小麥黃花葉病抗性鑒定及抗性親本簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選

魏　瑋，李俊敏，孫麗英，戎均康，周　偉（．浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江臨安00；．浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州00；.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌700）

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小麥黃花葉病抗性鑒定及抗性親本簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選

魏瑋1，李俊敏2，孫麗英3，戎均康1，周偉1
（1．浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江臨安311300；2．浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310021；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌712100）

摘要：小麥梭條斑花葉病毒（wheat spindle streak mosaic virus，WSSMV）又名小麥黃花葉病毒（wheat yellow mosaic virus，WYMV）是造成小麥Triticum aestivum減產(chǎn)的重要病害。不同的小麥品種對(duì)WYMV病害的抗性表現(xiàn)相當(dāng)復(fù)雜。推廣抗性品種是防止WYMV大面積田間發(fā)病的有效措施。以從國(guó)內(nèi)外收集到的527個(gè)小麥品種/系為材料，對(duì)其WYMV抗性進(jìn)行了病圃鑒定，篩選抗性穩(wěn)定的品種/系，并以其中推廣面積較大的WYMV抗性和敏感品種為親本篩選在抗性和敏感親本間具有多態(tài)性的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記。結(jié)果表明：527個(gè)候選材料中只有10個(gè)品種/系的抗性相對(duì)比較穩(wěn)定。以其中3個(gè)推廣面積較大的WYMV抗性品種‘豐抗1號(hào)’T.aestivum‘Fengkang 1’，‘石家莊72’T.aestivum‘Shijiazhuang 72’，‘鄭麥9023’T.aestivum‘Zhengmai 9023’以及2個(gè)推廣面積較大的WYMV敏感型品種‘揚(yáng)麥158’T.aestivum‘Yangmai 158’和‘煙農(nóng)22’T.aestivum‘Yangnong 22’為親本，篩選在抗性和敏感親本間具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記。結(jié)果表明：‘豐抗1號(hào)’/‘揚(yáng)麥158’和‘石家莊72’/‘揚(yáng)麥158’間的簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性最大，分別為64.0%和63.3%。因此，以WYMV抗性品種‘豐抗1號(hào)’和‘石家莊72’，以及WYMV敏感品種‘揚(yáng)麥158’為親本材料構(gòu)建作圖群體更有利于利用分子標(biāo)記對(duì)控制WYMV抗性數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTLs）進(jìn)行精細(xì)定位和目標(biāo)基因的圖位克隆。圖2表3參17

關(guān)鍵詞：植物保護(hù)學(xué)；小麥；分子標(biāo)記；黃花葉病毒；抗性

小麥黃花葉?。╳heat spindle streak mosaic virus，WSSMV）是由土壤習(xí)居性真菌——禾谷多黏菌Polymyxa graminis傳播的一類病毒病害。其主要病原物為小麥黃花葉病毒（wheat yellow mosaic virus，WYMV）隸屬于馬鈴薯Y病毒科Potyviridae大麥黃花葉病毒屬Bymovirus［1］。目前，小麥黃花葉病廣泛分布于中國(guó)長(zhǎng)江中下游、西南四川盆地、黃淮以及陜西渭河流域等冬小麥Triticum aestivum種植區(qū)。近年來(lái)，由于中國(guó)農(nóng)業(yè)機(jī)械化及大型農(nóng)機(jī)具跨區(qū)作業(yè)的推廣，使得土傳病毒病原迅速蔓延，小麥黃花葉病發(fā)生面積不斷擴(kuò)大。加之生產(chǎn)中缺乏品種抗病性分析，無(wú)法避免感病品種大面積種植，導(dǎo)致病害發(fā)生程度逐年增加，對(duì)中國(guó)小麥的安全生產(chǎn)造成極大的危害。由于禾谷黏多菌Polymyxa graminis產(chǎn)生的休眠孢子菌團(tuán)具有極強(qiáng)的抗逆性，能夠持久性攜帶和傳播病毒，使得此病害難以采用常規(guī)的物理、化學(xué)和生物的方法進(jìn)行防控，對(duì)小麥生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。目前，世界各地對(duì)小麥病毒病的防治主要是通過(guò)選育抗病良種并輔以栽培管理，但是生產(chǎn)中缺乏優(yōu)質(zhì)高（穩(wěn)）產(chǎn)多抗的品種，單一抗病品種的大面積種植容易增大選擇壓力，加快了抗性喪失。特別是在氣候、栽培耕作變化時(shí)容易引起次要病害大流行。如何得到廣譜抗（耐）病良種仍然是今后小麥抗病育種的重點(diǎn)。小麥對(duì)黃花葉病的抗性表現(xiàn)復(fù)雜，先前研究表明：小麥對(duì)黃花葉病的抗性表現(xiàn)為顯性核遺傳，是由一到多對(duì)基因控制的［2－3］。不同來(lái)源的材料之間遺傳背景各異，同時(shí)病害的發(fā)生又與環(huán)境因素密切相關(guān)［4－7］。因此，不同研究之間的可比性相對(duì)較差。本研究以從國(guó)內(nèi)外收集的527份小麥品種/系為材料，分別在山東煙臺(tái)、河南駐馬店和江蘇高郵的WYMV病圃進(jìn)行鑒定，期望篩選獲得WYMV抗性穩(wěn)定的抗原材料。在此基礎(chǔ)上以鑒定出的推廣面積相對(duì)較大的抗性和敏感型小麥為親本，篩選在所選材料間具有最大比率多態(tài)性的SSR分子標(biāo)記信息，為利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）分子標(biāo)記對(duì)WYMV抗性數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTLs）進(jìn)行精細(xì)定位以及選育WYMV抗性品種奠定工作基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1供試材料

從國(guó)內(nèi)外收集到的527個(gè)普通小麥品種（系）。包括：北京6號(hào)，臨優(yōu)2069，京雙16，西農(nóng)2208，邯6172，小偃5號(hào)，鄭麥9023，豐抗1號(hào)，石家莊72，京紅4號(hào)，山西平遙小白麥，華北672，金光麥，中育6號(hào)，有芒紅18號(hào)，有芒448，有芒白4號(hào)，陜麥150，淮麥20，長(zhǎng)6359，有芒紅8號(hào)，石品83，小偃168，太原567，臨農(nóng)1號(hào)，臨農(nóng)2號(hào)，鄭麥366，陜優(yōu)225，煙農(nóng)15，皖麥52，新麥20，北京5號(hào)，晉麥10號(hào)，陜229，魯農(nóng)116，代179，豐抗5號(hào)，徐州15，京花1號(hào)，北京11，北京841，雙豐收，北京14，北京13，濟(jì)南14，豐抗3號(hào)，豐麥2號(hào)，湘農(nóng)3099，良星99，鄭州24，濟(jì)南4號(hào)，農(nóng)大198，鄂麥25，矮稈早，豐抗8號(hào)，豐抗9號(hào)，豐抗10號(hào)，蜀萬(wàn)8號(hào)，北京10號(hào)，旱選1號(hào)，豫麥70-36，洲元936，陜627，濟(jì)麥21，尤皮1號(hào)，德選1號(hào)，豐抗4號(hào)，魯麥2號(hào)，京411，綿陽(yáng)4號(hào)，許躍6號(hào)，商洛76-8715，濮優(yōu)938，煙農(nóng)21，鄭農(nóng)16，泛麥5號(hào)，衡7228，鄭州15，濟(jì)南2號(hào)，豐抗2號(hào)，Rieti 75，鄭引4號(hào)，小偃54，南農(nóng)大96C076，山東95519，長(zhǎng)武134，洛夫林13，尤皮2號(hào)，青春1號(hào)，豐強(qiáng)7號(hào)，陜麥175，蒲臨5號(hào)，鳳麥13，魯麥17，臨農(nóng)11，西安實(shí)心麥，衡觀136，有芒紅7號(hào)，鄭麥98，昌樂(lè)5號(hào)，科冬81，京冬1號(hào)，安徽3號(hào)，冀麥24，荊麥66，科農(nóng)199，京作278，鄂麥11，臨麥4號(hào)，慶選15，京作236，長(zhǎng)豐1號(hào)，京旺9號(hào)，北京8694，衛(wèi)東4號(hào)，寧麥3號(hào)，石家莊407，泗麥2號(hào)，綿麥1403，新麥9817，山農(nóng)189，歐柔，Heine Hvede，青春2號(hào)，邢選7號(hào)，徐州14，溫麥8號(hào)，望麥15，蘇州7829，寧麥13，濰麥8號(hào)，煙5158，農(nóng)大45，豫麥10號(hào)，皖麥18，陜8242，波蘇1號(hào)，黔歡2，商洛76-08710，商洛76-8718，鄂26046，綿麥185，綿麥37，綿麥45，皖麥36，豫麥25，豫麥52，鄭農(nóng)17，周麥19，鄂麥16，洛旱6，太空6號(hào)，溫麥18，有芒白2號(hào)，南原1號(hào)，云麥25，南大8號(hào)，陜7587，湘1445，高優(yōu)505，小偃803，豫麥41，鄭麥9405，陜159，昌濰18，望麥17，百農(nóng)878，百農(nóng)9904，北京0045，科麥10號(hào)，揚(yáng)06G86，鎮(zhèn)麥4號(hào)，中育10號(hào)，鄂麥17，溫麥7號(hào)，許科1號(hào)，北京8號(hào)，西農(nóng)6028，碧玉麥，北京16，荊州66號(hào)，視察15，鎮(zhèn)麥1號(hào)，寧麥9號(hào)，南大2419，蘇麥1號(hào)，淮麥16科麥13，漯麥4號(hào)，綿麥46，寧糯1號(hào)，平安3號(hào)，新麥9號(hào)，豫麥34，豫麥49，豫優(yōu)1號(hào)，豫麥49-168，江東門，碧瑪2號(hào)，西峰9號(hào)，豐抗15，安徽9號(hào)，敵銹早，百農(nóng)3217，揚(yáng)麥10號(hào)，小偃4號(hào)，臨農(nóng)5號(hào)，川578，臨農(nóng)12，農(nóng)14，荊州7561，鄭州6811，陜76，陜興336，寧麥資32，凡415，花培2號(hào)，淮麥18，連麥1號(hào)，連麥2號(hào)，陜麥229，同舟麥916，西農(nóng)2000，豫麥47，豫麥70，豫農(nóng)201，鎮(zhèn)麥5號(hào)，魯麥21號(hào)，陜農(nóng)138，優(yōu)麥8004，鄭育麥958，小偃6號(hào)，臨汾5064，華中6號(hào)，石家莊34，晉麥21，偃大26，蘇麥2號(hào)，矮73，中梁11，白芒麥，商洛76-8712，商洛76-0879，商洛76-0872，西客108D6，阜麥936，旱抗4118，洪育2號(hào)，淮麥17，新原958，衡觀35，襄麥55，陜農(nóng)78，碧瑪4號(hào)，阿勃，洛夫林10號(hào)，Virgilio，Etoile de Choisy，陜農(nóng)17，濟(jì)南8號(hào)，衛(wèi)東7號(hào)，京紅8號(hào)，內(nèi)麥14，寧豐小麥，豫麥17，萬(wàn)年2號(hào)，小偃96，臨麥7號(hào)，臨5507，泗麥6號(hào)，陜8242-1，黔歡3，高優(yōu)503，寧麥14，新麥208，偃展4110，豫麥18，豫麥36，金豐3號(hào)，蘭考矮早8，山東664，西農(nóng)9871，小偃216，煙5286，煙農(nóng)24，墨巴66，冀麥36，京紅9號(hào)，華麥7號(hào)，鄭州17，鄭6輻，鄭州6號(hào)，偃大24，偃大25，豫麥7號(hào)，偃師4號(hào)，內(nèi)鄉(xiāng)19，信陽(yáng)1號(hào)，蘇麥3號(hào)，選7，湘麥10號(hào)，花培726，福農(nóng)60112，福農(nóng)50002，蘇州8332，鄭州9285，鄂34963，鑒37，寧矮8606，商洛76(57)22-8-1，矮抗58，洛新998，綿麥39，綿麥42，雙抗7438，溫優(yōu)1號(hào)，煙農(nóng)19，豫麥49-198，豫麥49-986，豫麥58，周麥22，周麥23，洛麥21，石H06-402，西農(nóng)3517，螞蚱麥，蚰子麥，蘇聯(lián)早熟1號(hào)，濟(jì)南5號(hào)，魯沾1號(hào)，泰山1號(hào)，甘麥7號(hào)，香農(nóng)3號(hào)，科春5號(hào)，信陽(yáng)12，778，香農(nóng)3號(hào)，萬(wàn)雅2號(hào)，陜6801-3-1-1，畢麥6號(hào)，尕海1號(hào)，淮陰69-6，陜62（9）10-4，咸農(nóng)151，加35，鄂31846，科優(yōu)1號(hào)，新麥18，華麥8號(hào)，臨早51329，鄭州742，花培126，皖麥38，新麥11，鎮(zhèn)麥6號(hào)，武農(nóng)148，9987，揚(yáng)麥5，揚(yáng)麥17，豫麥38，石家莊54，京作208，有芒白15，石4414，鄂麥9號(hào)，鄭引1號(hào)，鄭州743，浙農(nóng)大85，新麥19，荊州1號(hào)，鄭州683，襄麥5號(hào)，新鄭1號(hào)，鄂恩1號(hào)，鄂麥18，藁城8901，旱麥111，濟(jì)麥19，開(kāi)麥18，科麥2號(hào)，科農(nóng)9204，寧麥11，寧鹽1號(hào)，濮麥9號(hào)，泰山23，溫麥19，西科麥2號(hào)，西科麥4號(hào)，西科麥5號(hào)，徐麥27，徐麥29，徐麥856，煙農(nóng)22，閆麥8911，揚(yáng)05-117，揚(yáng)06-164，揚(yáng)麥13，揚(yáng)麥15，揚(yáng)麥158，豫麥60，豫農(nóng)035，豫農(nóng)202，豫農(nóng)949，鄭麥004，鄭麥9094，眾麥2號(hào)，周麥12，周麥16，周麥18，03中16，西農(nóng)979，04中36，百農(nóng)160，科大9612，洛旱2，洛旱7，濮麥10號(hào)，陜麥139，陜農(nóng)757，項(xiàng)麥969，小偃22，揚(yáng)麥11，豫麥48，燕大1817，五一麥，阿夫，早洋麥，矮孟牛，繁6，農(nóng)大139，碧瑪1號(hào)，碧瑪5號(hào)，碧瑪6號(hào)，魯54405，濟(jì)寧3號(hào)，冀麥23，濟(jì)南12，濟(jì)南10，向陽(yáng)4號(hào)，北京12，京作210，科冬83，科春14，臨汾10號(hào)，京437，冀麥30，安徽10號(hào)，綿陽(yáng)62，南農(nóng)大黑芒，群眾42，日喀則7號(hào)，日喀則8號(hào)，晉麥20，晉麥33，臨麥6號(hào)，寧麥1號(hào)，揚(yáng)麥4號(hào)，鐘山2號(hào)，福繁16，福繁17，綿陽(yáng)12，揚(yáng)麥9號(hào)，鄂1161，鄂麥6號(hào)，寧麥8號(hào)，揚(yáng)麥12，揚(yáng)麥13，揚(yáng)麥14，揚(yáng)麥16，揚(yáng)麥18，揚(yáng)85，揚(yáng)92，冀麥26，華北187，農(nóng)大183，農(nóng)大311，旱選10號(hào)，太原566，太原116，遂農(nóng)3號(hào)，鄭州722，內(nèi)鄉(xiāng)173，咸農(nóng)68，鄭州721，葉青（白），竹葉青（紅），陜5860，陜農(nóng)21，云石1號(hào)，云麥35，開(kāi)封10號(hào)，許昌26，寧麥6號(hào)，坡川豐，友誼麥，川533，東白塔1號(hào)，鄭州741，新豐13，開(kāi)中70，臨農(nóng)13，云麥27，平?jīng)?2，陜6815，百泉565，京春70，陜62（9）2-1，克珍，孟縣2號(hào)，合春12，蘇州7906，鎮(zhèn)7495，于城851，南召76144，陜76，南農(nóng)大96C181，黑86-30，蘇州7946，寧矮8628，金陵1號(hào)，隴春7號(hào)，莆麥1號(hào)，川80-466，川78001，多抗893，鄭麥982，濟(jì)麥22。

1.2田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

所有小麥材料分別于2009年，2010年和2011年的10月分別播種于山東省煙臺(tái)、河南省駐馬店和江蘇省高郵WYMV病圃。播種種子時(shí)按行均勻播種40~50粒種子·材料－1,行寬0.3 m，行長(zhǎng)1.2 m，設(shè)置重復(fù)3個(gè)·播種地點(diǎn)－1。小麥生長(zhǎng)期間進(jìn)行常規(guī)的田間管理，均勻施肥，于翌年3月進(jìn)行WYMV田間抗性鑒定。

1.3 WYMV的抗性鑒定方法

參照劉偉華等［8］和LIU等［9］小麥WYMV抗性鑒定的分級(jí)方法對(duì)參試材料進(jìn)行鑒定。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為0級(jí)：無(wú)癥狀；1級(jí)：輕度花葉且葉片不產(chǎn)生梭狀條紋癥狀，植株不矮化；2級(jí)：花葉明顯，梭條或黃花葉癥狀占葉面積的1/2左右，植株輕度矮化；3級(jí)：嚴(yán)重花葉，梭條或黃花葉癥狀占葉面積的3/4左右，植株明顯矮化。0級(jí)為免疫類型，1，2，3級(jí)為感病類型［8－10］。

1.4 SSR多態(tài)性分析

3個(gè)WYMV抗性品種（‘鄭麥9023’‘豐抗1號(hào)’和‘石家莊72’）和2個(gè)WYMV敏感品種（‘煙農(nóng)22’和‘揚(yáng)麥158’）分別取葉片組織0.2 g，采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取總DNA［11］。所提取的總DNA稀釋20倍后用做SSR多態(tài)性分析的模板。751對(duì)SSR引物參照Graingene 2.0（http://wheat.pw.usda.gov）小麥SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)的信息進(jìn)行合成。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2.5 μL 10×PCR緩沖液，0.5 μL三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs），0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，1.0 μL DNA樣品，0.5 μL rTaq酶，19.5 μL無(wú)菌水。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min，30個(gè)循環(huán)（94℃45 s，55℃45 s，72℃45 s），72℃10 min。采用80.0 g·L－1聚丙烯酰胺凝膠電泳分析PCR反應(yīng)產(chǎn)物，并用銀染法進(jìn)行PCR產(chǎn)物顯色分析［12］。

2　結(jié)果與分析

2.1 527個(gè)普通六倍體小麥黃花葉病的抗性鑒定

從國(guó)內(nèi)外收集的527個(gè)小麥品種分別種植在山東煙臺(tái)、河南駐馬店和江蘇高郵等地進(jìn)行3 a 3點(diǎn)的

WYMV田間抗性鑒定。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：小麥發(fā)病的主要田間癥狀為：發(fā)病初期，心葉上出現(xiàn)淡綠色或櫈黃色梭形或橢圓形斑點(diǎn)，然后斑點(diǎn)逐步擴(kuò)大合并，發(fā)展成為黃綠相間的斑駁或是不規(guī)則條紋，植株生長(zhǎng)受到擬制；發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，心葉嚴(yán)重失綠，細(xì)弱皺縮或扭曲成畸形，莖上也出現(xiàn)褪綠線狀條斑，植株生長(zhǎng)嚴(yán)重受擬制；隨著氣溫回升，植株起身拔節(jié)，花葉病癥逐步消失，新葉無(wú)病癥。經(jīng)過(guò)鑒定試驗(yàn)共發(fā)現(xiàn)在3個(gè)地點(diǎn)都呈WYMV抗性反應(yīng)的小麥品種共10個(gè)，分別為‘有芒白4號(hào)’‘陜麥150’‘臨優(yōu)2069’‘京雙16’‘西農(nóng)2208’‘鄭麥366’‘陜優(yōu)225’‘鄭麥9023’‘豐抗1號(hào)’和‘石家莊72’，占所有參試小麥品種的1.90%（表1）；而在3個(gè)地點(diǎn)都呈WYMV敏感反應(yīng)的小麥品種共203個(gè)，占所有參試小麥品種的38.52%（表1僅列出了在山東煙臺(tái)和江南地區(qū)先前推廣面積相對(duì)較大的2個(gè)WYMV敏感品種）。

表1　3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)都呈WYMV抗性的小麥品種Table 1　WYMV resistant wheat cultivars in three different experimental plots

2.2不同小麥品種WYMV抗性表現(xiàn)的不穩(wěn)定性分析

分析527個(gè)小麥品種3 a 3點(diǎn)的WYMV抗性鑒定結(jié)果表明：不同的小麥品種對(duì)WYMV的抗病反應(yīng)受地域影響比較大。在冬季和早春雨水相對(duì)比較少的河南駐馬店地區(qū)，3 a都呈WYMV抗性的小麥品種/系為245個(gè)，占所有參試材料的46.49%（其中高抗占36.05%，中抗占10.44%）；而在雨水相對(duì)較多，氣溫能穩(wěn)定在10~20℃的范圍時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)的山東煙臺(tái)和江蘇高郵地區(qū)，3 a都呈WYMV抗性的品種/系分別為32個(gè)和147個(gè)，分別占參試材料的比率僅為6.08%和27.89%。山東煙臺(tái)地區(qū)適宜發(fā)病的氣溫維持相對(duì)最長(zhǎng)，多雨潮濕的氣候特征使得在此地區(qū)感病的小麥品種/系達(dá)到了495個(gè)，遠(yuǎn)多于其他2個(gè)地區(qū)（表2）。另外，以上3個(gè)地區(qū)WYMV致病株也存在一定程度的遺傳變異。這些小麥品種對(duì)WYMV的抗性反應(yīng)具有地域性特點(diǎn)，使得建立小麥品種抗病性標(biāo)記顯得尤為重要。

表2　527個(gè)普通小麥品種在3個(gè)地點(diǎn)WYMV抗性的總體鑒定結(jié)果Table 2 Overall appraisal result of 527 wheat cultivars in three different experimental plots

2.3抗性親本SSR多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選

為了對(duì)小麥WYMV抗性QTL進(jìn)行遺傳定位，我們選取種植面積相對(duì)較大的3個(gè)WYMV抗性品種（‘鄭麥9023’‘豐抗1號(hào)’和‘石家莊72’）和2個(gè)WYMV敏感品種（‘煙農(nóng)22’和‘揚(yáng)麥158’）分別為抗性和感性材料進(jìn)行SSR多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選。參照Graingene 2.0小麥分子標(biāo)記遺傳圖譜的數(shù)據(jù)信息，共設(shè)計(jì)了751對(duì)覆蓋小麥7個(gè)染色體組的SSR引物分別在抗性和感性材料之間進(jìn)行SSR多態(tài)性的篩選。研究發(fā)現(xiàn)：抗性材料‘豐抗1號(hào)’和感性材料‘揚(yáng)麥158’之間的SSR多態(tài)性比率最高，為64.0%（圖1和表3）；其次是‘石家莊72’和‘揚(yáng)麥158’之間的SSR多態(tài)性為63.3%（圖2和表3）；‘鄭麥9023’和‘揚(yáng)麥158’間的SSR多態(tài)性比率最低為53.9%（表3）。

表3　WYMV抗病品種和感病品種間SSR多態(tài)性分析Table 3 Polymorphic SSR markets analysis of WYMV resistant and sensitive cultivars

圖1　‘豐抗1號(hào)’和　‘揚(yáng)麥158’之間的多態(tài)性SSR標(biāo)記Figure 1 Polymorphic SSR markets between‘Fengkang 1’and‘Yangmai 158’

圖2　‘石家莊72’和‘揚(yáng)麥158’之間多態(tài)性SSR標(biāo)記Figure 2 Polymorphic SSR markets between‘Shijiazhuang 72’and‘Yangmai 158’

3　結(jié)論與討論

3.1小麥黃花葉病發(fā)病受環(huán)境和遺傳的雙重影響

在田間通過(guò)連續(xù)3 a對(duì)527個(gè)小麥材料的抗病性進(jìn)行鑒定，共篩選獲得10個(gè)WYMV抗性穩(wěn)定的品種（系）。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)：①不同小麥材料對(duì)WYMV表現(xiàn)相當(dāng)復(fù)雜，極容易受環(huán)境的影響。張宗英等［13］對(duì)國(guó)內(nèi)3個(gè)地區(qū)（河南潢川、江蘇揚(yáng)州、四川雅安）WYMV病毒核酸和蛋白序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的WYMV病毒核酸和蛋白序列存在著一定的差異，這可能是各地WYMV病害輕重不一的重要因素。因此，本試驗(yàn)中同一年份中的同一品種在不同地區(qū)的抗病性表現(xiàn)存在較大差異，推測(cè)不同地區(qū)的毒株在致病能力方面可能存在較大的差異。煙臺(tái)地區(qū)的毒株致病能力可能更強(qiáng)一些，使得本來(lái)在其他2個(gè)地區(qū)（河南駐馬店和江蘇高郵）抗病的品種（系）種植在山東煙臺(tái)病圃時(shí)變得容易感病。②不同的栽培條件也會(huì)影響到病癥的表現(xiàn)。例如施肥過(guò)少造成土壤貧瘠或施肥過(guò)多、土壤肥力過(guò)大都會(huì)影響感病品種的發(fā)病程度［14］。③小麥的播種期也會(huì)影響病癥的表現(xiàn)。早播土溫較高，適合真菌對(duì)小麥根系的侵入，并且可以在小麥發(fā)病期趕上低溫；晚播則造成發(fā)病期氣溫回升，以致影響病癥的表現(xiàn)。總體而言小麥發(fā)病的過(guò)程對(duì)氣溫較為敏感，早春發(fā)病期要求氣溫在12℃以下的時(shí)間持續(xù)較長(zhǎng)，尤其是連續(xù)的低溫陰雨天氣，病癥表現(xiàn)更加明顯；因此在春季氣溫偏高或氣溫回升較快的年份，會(huì)嚴(yán)重影響發(fā)病。盡管小麥WYMV抗性鑒定極容易受環(huán)境的干擾，但現(xiàn)今對(duì)小麥WYMV抗性的鑒定通常都在田間病圃里進(jìn)行，一般不適宜采用人工摩擦接種的方法在可控的室內(nèi)條件下完成鑒定。小麥WYMV對(duì)人工接種發(fā)病較難奏效，究其原因?yàn)樾←滭S花葉病毒為線狀粒子，容易斷裂，加之小麥黃花葉病毒的外殼蛋白極不穩(wěn)定，人工接種方法不利于病毒外殼蛋白的穩(wěn)定［8，14］。因此，接下來(lái)對(duì)我們構(gòu)建的F2作圖群體的WYMV抗病性鑒定將在田間病圃里進(jìn)行。

小麥WYMV抗病性為顯性核基因控制的性狀，抗性可能受2對(duì)致病顯性基因（S1S1，S2S2）和1對(duì)擬制基因（Ⅱ）所控制［14］。劉偉華等［8］用抗病性強(qiáng)的小麥品種‘揚(yáng)輻9311’‘寧麥7號(hào)’‘寧麥9號(hào)’與不同感病品種通過(guò)雜交和測(cè)交配制組合來(lái)分析此3個(gè)抗病品種的抗性遺傳規(guī)律。結(jié)果表明：品種‘揚(yáng)輻9311’和‘寧麥7號(hào)’對(duì)小麥WYMV的抗性是由一對(duì)顯性基因控制的；‘寧麥9號(hào)’對(duì)小麥WYMV的抗性由一對(duì)作用力較強(qiáng)的顯性主效基因所控制，個(gè)別組合F2群體的抗、感分離比偏離3∶1的比率，推測(cè)WYMV抗性可能受環(huán)境影響的微效基因或不完全顯性的基因所控制。LIU等［9］用WYMV高抗品種‘寧麥9號(hào)’與高感品種‘揚(yáng)麥10號(hào)’雜交建立了F2分離群體，將WYMV抗病基因（YmNM）定位在2A染色體上，與其最近的SSR標(biāo)記Xgwm328的遺傳距離為17.6 cm。LIU等［9］用高抗品種‘揚(yáng)輻9311’作母本與高感品種‘揚(yáng)麥10號(hào)’作父本雜交建立了F2分離群體，經(jīng)連鎖分析發(fā)現(xiàn)，抗病基因（YmYF）定位在2DL染色體臂上，并且與4個(gè)SSR標(biāo)記Xwmc41，Xwmc181，Xpsp3039和Xgwm349緊密連鎖［10］。Nishio等［15］用高抗品種‘Ibis’作母本與高感品種‘Münstertaler’作父本進(jìn)行雜交，構(gòu)建了DH作圖群體，將WYMV抗病基因（Ym1b）定位在2DL染色體臂上，此基因與4個(gè)SSR標(biāo)記Xcfd16，Xwmc41，Xcfd168和Xwmc181緊密連鎖。WYMV抗病基因YmYF和Ym1b都被定位在2DL染色體臂上，都與Xwmc41和Xwmc181緊密連鎖?？梢?jiàn)WYMV抗病基因是由定位于2號(hào)染色體上的一對(duì)基因控制的，此結(jié)果與劉偉華等［8］于WYMV的抗性是由一對(duì)顯性基因控制的研究結(jié)果相一致。但是Zhu等［14］利用高抗品種‘西風(fēng)’與高感品種‘鎮(zhèn)9523’所創(chuàng)建的重組易位系（recombinant inbred lines，RIL）為材料，分別在3BS，5AL和7BS染色體臂上定位了3個(gè)WYMV抗性QTLs位點(diǎn)。可見(jiàn)小麥WYMV抗性并不是簡(jiǎn)單的單基因控制的性狀，而是由多基因控制的數(shù)量性狀，其抗性QTLs的遺傳定位結(jié)果會(huì)受作圖群體親本的選擇差異以及群體類型的影響。我們已以父母本間SSR多態(tài)性最大且在江浙地區(qū)推廣面積比較大的WYMV感病小麥品種‘揚(yáng)麥158’為母本，WYMV抗性品種‘豐抗1號(hào)’‘石家莊72’為父本配制了F2作圖群體。接下來(lái)將對(duì)F2分離群體的抗、感分離比進(jìn)行分析，以及利用篩選獲得的多態(tài)性SSR標(biāo)記對(duì)F2分離群體的基因型進(jìn)行分析，以明確不同的WYMV抗性品種的抗性遺傳規(guī)律和抗性QTLs的遺傳定位穩(wěn)定性。

3.2 SSR多態(tài)性標(biāo)記在WYMV抗性和感性親本染色體上分布不均勻

為了利用SSR分子標(biāo)記對(duì)WYMV抗性QTLs進(jìn)行精細(xì)定位以及為選育WYMV抗性新品種奠定工作基礎(chǔ)，我們選取推廣面積較大的WYMV抗性品種（‘豐抗1號(hào)’‘石家莊72’和‘鄭麥9023’）和WYMV敏感型品種（‘揚(yáng)麥158’和‘煙農(nóng)22’）為親本，篩選在抗性和感性親本間具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)‘豐抗1號(hào)’/‘揚(yáng)麥158’和‘石家莊72’/‘揚(yáng)麥158’間的SSR多態(tài)性最大（分別為64.0%和63.3%），并依據(jù)Graingene 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)SSR標(biāo)記的遺傳距離信息，構(gòu)建了抗性和感性親本的多態(tài)性SSR標(biāo)記遺傳圖譜。SSR標(biāo)記是產(chǎn)生的原理是：DNA復(fù)制或修復(fù)過(guò)程中DNA滑動(dòng)、錯(cuò)配或有絲分裂和減數(shù)分裂期姐妹染色單體不均等交換而產(chǎn)生的簡(jiǎn)單序列重復(fù)。SSR標(biāo)記數(shù)量豐富，均勻分布于全基因組，且重復(fù)性高，穩(wěn)定性好，適合于自動(dòng)化分析，是目前使用最廣泛的一種標(biāo)記。分析多態(tài)性SSR標(biāo)記在WYMV抗性和感性親本不同染色體上的分布特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)第3號(hào)和第5號(hào)染色體上多態(tài)性SSR標(biāo)記的比率要明顯高于其他染色體上。Justin等曾在5B長(zhǎng)臂上的基因富集高重組區(qū)建立了一個(gè)飽和物理圖譜，這個(gè)區(qū)段占5B長(zhǎng)臂4%的物理距離，卻占整個(gè)染色體30%的重組，多重交叉發(fā)生在這一熱點(diǎn)區(qū)段，重組率是整個(gè)染色體的11倍［16］。因此，我們推測(cè)第3號(hào)和第5號(hào)染色體較其他染色體具有更加活躍的染色體重排、易位或是滑動(dòng)等現(xiàn)象，可能是導(dǎo)致WYVM抗性和感性親本多態(tài)性SSR標(biāo)記在不同染色體分布不均一的重要原因。Liu等［17］分析先前已構(gòu)建的小麥遺傳圖發(fā)現(xiàn)，50%以上的SSR標(biāo)記位點(diǎn)成簇分布在著絲粒附近，其擴(kuò)展的遺傳距離低于30 cm。本研究中WYMV抗性和感性小麥親本多態(tài)性SSR標(biāo)記在同一染色體組的不同染色體區(qū)段分布也不均勻，主要集中在著絲粒的附近區(qū)段，這與Liu等［17］總結(jié)出的SSR分子標(biāo)記分布規(guī)律相一致。

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Selection of wheat having resistance to yellow mosaic virus and screen out SSR molecular markers having polymorphism between resistant and sensitive parents

WEI Wei1,LI Junmin2,SUN Liying3,RONG Junkang1,ZHOU Wei1
（1.The Key Laboratory for Quality Improvement of Agricultural Products of Zhejiang Province,School of Agriculture and Food Science,Zhejiang A &F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.Key Laboratory of Pest and Disease Control Zhejiang Province,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,Zhejiang,China;3.College of Plant Protection,Northwest A &F University,Yangling 712100,Shaanxi,China）

Abstract:Wheat yellow mosaic virus（WYMV）,one of the most devastating diseases of cereals,also called wheat spindle streak mosaic virus（WSSMV）,has different effects on different cultivars of wheat.Breeding andbook=72,ebook=75growing resistant cultivars is one of the most effective method to defense WYMV.Selection of suitable parents for the formation of mapping population for QTLs mapping involved in WYMV is a basic work to breed new WYMV resistant cultivars.In this study,527 different cultivars / lines of wheat from different districts at home and abroad were introduced and identified in disease plots with three different experimental plots and three replications each plot.Then polymorphic simple sequence repeats（SSRs）markers were screened out between resistant and sensitive parents which had a larger planting area than other wheat cultivars.Results showed that only ten of the 527 candidate materials had a relatively more stable WYMV disease resistance.Three WYMV resistant wheat cultivars out of ten resistant materials including‘Fengkang 1’‘Shijiazhuang 72’and ‘Zhengmai 9023’and two sensitive wheat cultivars with a wider planting area,‘Yangmai 158’and‘Yannong 22’,were selected for further comparison.Higher polymorphic rates were obtained with the parental group of‘Fengkang 1’and‘Yangmai 158’（64.0%）and the parental group of‘Shijiazhuang 72’and ‘Yangmai 158’（63.3%）than other groups.Therefore,using WYMV resistant cultivars‘Fengkang 1’and ‘Shijiazhuang 72’,along with WYMV sensitive parent‘Yangmai 158’to form mapping populations would be more opportune for fine mapping of quantitative trait locus（QTLs）involved in WYMV resistance and mapbased gene cloning.［Ch,2 fig.3 tab.17 ref.］

Key words:plant protection;Triticum aestivum;molecular marker;yellow mosaic virus;resistance

作者簡(jiǎn)介：魏瑋，從事植物種質(zhì)資源創(chuàng)新研究。E-mail：1187374847@qq.com。通信作者：周偉，副教授，博士，從事植物分子遺傳與種質(zhì)資源創(chuàng)新研究。E-mail：zhouwei19810501@163.com

基金項(xiàng)目：浙江省科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃（新苗人才計(jì)劃）項(xiàng)目（2014R412048）；浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金資助項(xiàng)目（2010DS700124-KF1103）；浙江省旱糧農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)（2012C12902-2-6）；浙江省科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2011R50026-23）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LQ12C13003）

收稿日期：2015-03-27；修回日期：2015-06-01

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.01.010

中圖分類號(hào)：S435.121；S432.21

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-0756（2016）01-0071-09