青貯發(fā)酵對玉米秸稈品質(zhì)及菌群構(gòu)成的影響

陶　蓮　刁其玉

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點實驗室，北京100081)

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青貯發(fā)酵對玉米秸稈品質(zhì)及菌群構(gòu)成的影響

陶蓮刁其玉*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點實驗室，北京100081)

摘要：本研究旨在探討青貯發(fā)酵對玉米秸稈感官指標(biāo)、發(fā)酵品質(zhì)、營養(yǎng)成分以及門、綱、目、科和屬5個水平細(xì)菌群落構(gòu)成及豐度的影響。將去穗后仍青綠的蠟熟期玉米秸稈切短揉搓至1～2 cm，將水分調(diào)節(jié)至65%～70%后，取青貯前樣品(3個重復(fù))和青貯后樣品(3個重復(fù))使用聚乙烯袋真空包裝，室溫貯藏45 d后開啟取樣，運用實驗室檢測手段及MiSeq高通量測序技術(shù)分析青貯前后玉米秸稈品質(zhì)及菌群結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明：1)青貯發(fā)酵45 d后的玉米秸稈青貯飼料呈黃綠色，質(zhì)地較好，呈酸香味。青貯發(fā)酵作用能夠使玉米秸稈pH迅速降低(P<0.05)，乳酸含量顯著增加(P<0.05)，中性洗滌纖維(NDF)及酸性洗滌纖維(ADF)含量有下降趨勢(P>0.05)。2)玉米秸稈經(jīng)過青貯發(fā)酵后，變形菌門(Proteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和魏斯氏菌屬(Weissella)菌群數(shù)量顯著降低(P<0.05)；青貯發(fā)酵能夠顯著增加厚壁菌門(Firmicutes)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、乳桿菌目(Lactobacillales)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、片球菌屬(Pediococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)菌群數(shù)量(P<0.05)。綜上，青貯發(fā)酵改善玉米秸稈感官指標(biāo)、發(fā)酵品質(zhì)以及營養(yǎng)成分的同時，可以有效降低有害細(xì)菌的數(shù)量，增加有益菌的數(shù)量，從而可以降低致病菌對家畜健康存在的潛在風(fēng)險。通過實驗室檢測手段及Miseq高通量測序技術(shù)相結(jié)合，能夠在分析青貯品質(zhì)的同時，提供青貯前后整個菌落構(gòu)成及豐度變化的信息，進(jìn)而為發(fā)酵過程的調(diào)控提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：MiSeq；玉米秸稈；青貯發(fā)酵；品質(zhì)；細(xì)菌

青貯飼料常被認(rèn)為是乳酸菌發(fā)酵的產(chǎn)物，然而實際上是一個極其復(fù)雜的微生物共生體系，參與青貯過程的微生物種類非常多，包括青貯原料上附著的微生物、引起青貯飼料發(fā)酵的微生物以及引起青貯腐敗變質(zhì)的微生物等[1]。在青貯發(fā)酵過程中，菌落的構(gòu)成及豐度是不斷變化的，乳酸菌等少數(shù)優(yōu)勢種群對整個種群起決定作用[2]。為對青貯過程進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)青貯過程中有益菌種的生長，使青貯飼料迅速進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)，抑制有害菌的繁殖，從而降低干物質(zhì)、蛋白質(zhì)及可溶性糖等營養(yǎng)物質(zhì)的損失率，提高青貯發(fā)酵品質(zhì)，了解各種微生物的活動規(guī)律是非常有必要的，特別是青貯前后起主要作用的菌群的活動規(guī)律[3]。近些年來有關(guān)青貯過程中微生物種類和豐度的研究一直是國內(nèi)外該領(lǐng)域研究的熱點，這些研究主要包括：1)不同青貯階段中微生物的動態(tài)變化，如乳酸菌、大腸桿菌、霉菌和酵母等[1-2,4]；2)不同青貯劑、青貯原料及青貯條件對青貯過程中微生物種類的影響[5-6]。我國玉米秸稈資源豐富，玉米秸稈青貯應(yīng)用廣泛，青貯后有機(jī)物消化率可提高4.8%～15.4%，消化能提高0.23～0.62 MJ，代謝能提高0.19～0.56 MJ[5-6]。然而目前有關(guān)玉米秸稈青貯飼料品質(zhì)的研究較多，而對發(fā)酵前后微生物菌群變化的研究以及玉米秸稈青貯品質(zhì)及細(xì)菌群落相關(guān)性的探討較少。另外，目前有關(guān)青貯飼料中微生物研究的方法多采用傳統(tǒng)的微生物平板純培養(yǎng)方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物學(xué)方法[變性梯度凝膠電泳(DGGE)/溫度梯度凝膠電泳(TGGE)/瞬時溫度梯度電泳(TTGE)、16sRNA基因的末端限制性片段分析技術(shù)(T-RFLP)、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、印記雜交、定量PCR、基因芯片]等，只能反映出樣品中少數(shù)優(yōu)勢菌的信息，無法對樣品中的微生物做到絕對定量，為微生物進(jìn)化關(guān)系的研究提供的信息也很有限[7-8]。第二代測序技術(shù)MiSeq高通量測序平臺采用邊合成邊測序原理，不僅可實現(xiàn)一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，而且在測序速度和測序通量上都有進(jìn)一步提升，可以測定微生物從門、綱、目、科、屬各個水平上的構(gòu)成及豐度，具有測序深度高、利于鑒定低豐度群落物種的特點，已成為研究細(xì)菌和真菌群落多樣性的首選之策[7-8]，目前此平臺已在微生物多樣性群落結(jié)構(gòu)研究方面受到了廣大學(xué)者的認(rèn)可。然而截至目前，有關(guān)利用MiSeq高通量全基因組測序技術(shù)研究玉米秸稈青貯菌群群落及豐度的研究鮮有報道。本研究擬對玉米秸稈青貯前后品質(zhì)及細(xì)菌群落進(jìn)行系統(tǒng)分析，探明青貯發(fā)酵過程對玉米秸稈品質(zhì)及細(xì)菌群落的影響，并分析青貯品質(zhì)及細(xì)菌群落變化的關(guān)系，為微生物接種劑的研發(fā)及利用生物手段調(diào)控青貯發(fā)酵過程提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

玉米秸稈(corn straw)取自河北省保定市，品種為三北21，于2014年9月30日蠟熟期摘穗后部分葉片仍然青綠時，立即刈割。

1.2試驗設(shè)計

本試驗共設(shè)置青貯前(pre-ensiling)和青貯后(post-ensiling)2個組，每組3個重復(fù)，各樣品編號見表1。玉米秸稈刈割后，用青貯切碎揉搓機(jī)切短至1～2 cm，將蒸餾水均勻噴灑在粉碎玉米秸稈上，將水分調(diào)節(jié)至65%～70%，取原料樣品后，另取樣品裝入聚乙烯袋(24 cm×40 cm)，每袋1 kg，用真空包裝機(jī)(DZ-280/2SD)抽真空并封口。原料樣品置于冰盒中，迅速帶回實驗室，-20 ℃貯藏，青貯樣品室溫條件下(25～37 ℃)貯藏，室溫貯藏45 d后開封取樣，立即于-80 ℃保存，待檢。

表1　試驗組設(shè)計及樣品編號

青貯前：玉米秸稈青貯原料。青貯后：發(fā)酵45 d后的玉米秸稈青貯飼料。下表同。

Pre-ensiling: stuff of corn stalk silage. Post-ensiling: corn stalk silage of 45 d. The same as below.

1.3測定指標(biāo)與方法

1.3.1感觀鑒定

按德國農(nóng)業(yè)協(xié)會(DLG)感官青貯評分標(biāo)準(zhǔn)及等級評定方法進(jìn)行綜合評定[9-10]。

1.3.2發(fā)酵品質(zhì)及營養(yǎng)成分的測定

取玉米秸稈青貯前及青貯后樣品20 g，加入180 mL蒸餾水，攪拌均勻，用組織搗碎機(jī)攪碎1 min，先后用4層紗布和定性濾紙過濾，濾出草渣得到浸出液，再用pH測定儀測青貯料浸出液的pH[11]；采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定氨態(tài)氮(ammonia nitrogen，NH3-N)含量[12]；采用烘箱干燥法測定干物質(zhì)(dry matter，DM)含量；采用凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)和總氮(total nitrogen，TN)含量[13]；采用范氏洗滌纖維法測定中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量[13]；采用蒽酮分光光度法測定可溶性糖(water soluble carbohydrates，WSC)含量[14]；使用SHIMADZE-10A型高效液相色譜分析乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)、丁酸(butyric acid，BA)含量，色譜柱：Shodex Rspak KC-811 S-DVB gel Column 30 mm×8 mm，檢測器：SPD-M10AVP，流動相：3 mmol/L高氯酸，流速：1 mL/min；柱溫50 ℃，檢測波長210 nm，進(jìn)樣量5 μL[10]。

1.3.3微生物種類及豐度的測定

1.3.3.1DNA的提取

青貯原料及樣品DNA的提取采用十二烷基苯磺酸鈉(SDS)法[15]。稱取0.5 g青貯原料及樣品，加3 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)(8 g NaCl，0.2 g KCL，2.8 g Na2HPO4·12H2O，0.2 g KH2PO4，加蒸餾水定容至1 L，pH 7.0～7.4)，渦旋15 min，1 790×g室溫離心5 min，棄上清，向沉淀中再加入3 mL PBS，重復(fù)上述步驟2次。向沉淀中加1 mL抽提緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L EDTA，3% SDS，pH 8.0)，16 000×g、4 ℃離心5 min，取上清加入等體積異丙醇，-20 ℃沉淀l h，12 000 r/min、4 ℃離心20 min，棄上清，加入70%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥沉淀5 min，加入30 μL蒸餾水重溶核酸，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。

1.3.3.2定量PCR檢測

PCR產(chǎn)物的混樣和純化：PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，使用Thermo Scientific公司的Gene JET膠回收試劑盒回收產(chǎn)物[18]。

1.3.3.3文庫構(gòu)建和測序

1.3.3.4信息分析流程

使用CLUSTALW軟件分析，序列相似性大于97%時定義為相同的操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)。測序得到的原始數(shù)據(jù)(raw data)，存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)(dirty data)，為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，首先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)(clean data)。然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs聚類和物種分類分析，并將OTUs和物種注釋結(jié)合，從而得到每個樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結(jié)果。再對OTUs進(jìn)行豐度、多樣性指數(shù)等分析，同時對物種注釋在各個分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析[8]。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件分析。玉米秸稈各樣品的相異系數(shù)使用ANOVA程序進(jìn)行差異顯著性分析，門、綱、目、科和屬各個水平上菌群豐度，玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)成分指標(biāo)使用獨立樣本t-test過程進(jìn)行平均值差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1玉米秸稈青貯飼料感官評定

青貯發(fā)酵45 d后的玉米秸稈青貯飼料3個重復(fù)的樣品均呈黃綠色，在色澤上無明顯差別；無霉變情況發(fā)生；質(zhì)地較好，無粘手現(xiàn)象，呈酸香味。各樣品的感官評定質(zhì)量均達(dá)到了優(yōu)良等級。

2.2玉米秸稈青貯前后發(fā)酵品質(zhì)及營養(yǎng)成分

由表2可知，青貯發(fā)酵作用能夠使玉米秸稈pH迅速降低(P<0.05)，乳酸含量顯著增加(P<0.05)，NDF、ADF及CP含量有下降趨勢(P>0.05)，而DM含量在青貯前后差異不顯著(P>0.05)，另外可知青貯發(fā)酵過程會消耗玉米秸稈中的WSC含量。

2.3玉米秸稈青貯前后微生物種類及豐度變化

2.3.1測序質(zhì)量

經(jīng)過過濾后6個樣品得到總拼接序列數(shù)(total tags)為490 251條，用于構(gòu)建OTUs并且活動分類信息的Tags數(shù)目(taxon tags)為476 217條，有效Tags數(shù)目達(dá)到97.14%。序列相似性大于97%的水平上，總檢測到OTUs數(shù)為7 258個。由圖1可知，各樣品的稀釋曲線均已趨于平坦，說明測序深度基本可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。相同序列數(shù)時，青貯前玉米秸稈OTU數(shù)量高于青貯后樣品，說明青貯發(fā)酵能夠降低玉米秸稈菌群多樣性。

表2　玉米秸稈青貯前后發(fā)酵品質(zhì)及營養(yǎng)成分

圖1　青貯前后玉米秸稈菌群稀釋曲線

2.3.2青貯前后玉米秸稈物種多樣性相似性分析

由圖2可知，青貯前和青貯后玉米秸稈共有OTUs數(shù)為575個，青貯前特有OTUs數(shù)為832個，青貯后特有OTUs數(shù)為161個，說明青貯前后菌群構(gòu)成同時具有特異性和相似性。由表3可知，玉米秸稈青貯前和青貯后2個組組內(nèi)樣品差異系數(shù)小，組間差異系數(shù)大，說明組樣品重復(fù)性好，青貯前后玉米秸稈物種多樣性存在明顯差異。

圖2　青貯前后玉米秸稈OTUs韋恩圖

項目Items青貯前1Pre-ensiling1青貯前2Pre-ensiling2青貯前3Pre-ensiling3青貯后1Post-ensiling1青貯后2Post-ensiling2青貯后3Post-ensiling3青貯前1Pre-ensiling10.000.070.020.320.250.34青貯前2Pre-ensiling20.070.000.080.290.220.30青貯前3Pre-ensiling30.120.080.000.260.180.27青貯后1Post-ensiling10.320.290.260.000.090.06青貯前2Post-ensiling20.250.220.180.090.000.11青貯前3Post-ensiling30.340.300.270.060.110.00平均值標(biāo)準(zhǔn)誤SEM0.040.040.040.030.040.04P值P-value0.0050.0040.0180.0020.0210.003

2.3.3不同組樣品在各個水平上優(yōu)勢菌群的異同

由表4可知，在門水平上，玉米秸稈中變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Fimicules)菌群數(shù)量在青貯前占優(yōu)勢地位。青貯45 d后，變形菌門

菌群數(shù)量顯著降低(P<0.05)，由78.08%降低至50.90%，厚壁菌門菌群數(shù)量顯著增加(P<0.05)，由18.76%增加至44.06%。

表4　青貯前后玉米秸稈門水平上菌群結(jié)構(gòu)

由表5可知，在綱水平上，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)菌群數(shù)量在青貯前玉米秸稈中占據(jù)前3位。青貯45 d后，γ-變形菌綱菌群數(shù)量顯著降低(P<0.05)，由67.72%降低到35.66%；芽孢桿菌綱菌群數(shù)量顯著增加(P<0.05)，由18.68%增加至43.94%；α-變形菌綱菌群數(shù)量由8.98%增加至13.39%，顯著上升(P<0.05)。

由表6可知，在目水平上，玉米秸稈青貯前腸桿菌目(Enterobacteriales)和乳桿菌目(Lactobacillales)菌群數(shù)量占據(jù)優(yōu)勢地位。青貯45 d后，腸桿菌目菌群數(shù)量顯著降低(P<0.05)，乳桿菌目菌群數(shù)量顯著增加(P<0.05)。

由表7可知，在科水平上，青貯前玉米秸稈中菌群數(shù)量占前3位的分別是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)和假單胞菌科(Pseudomonadaceae)，青貯45 d后，菌群數(shù)量占前3位的分別為乳桿菌科(Lactobacillaceae)、腸桿菌科和明串珠菌科。腸桿菌科和明串珠菌科菌群數(shù)量顯著降低(P<0.05)，乳桿菌科菌群數(shù)量顯著增加(P<0.05)。

表5　青貯前后玉米秸稈綱水平上菌群結(jié)構(gòu)

表6　青貯前后玉米秸稈目水平上菌群結(jié)構(gòu)

表7　青貯前后玉米秸稈科水平上菌群結(jié)構(gòu)

由表8可知，在屬水平上，青貯前玉米秸稈中菌群數(shù)量占前3位的分別是魏斯氏菌(Weissella)、鞘氨醇菌(Sphingomonas)和Swaminathania屬，分別為16.92%、2.26%和2.22%。青貯45 d后菌群數(shù)量占前3位的分別為片球菌(Pediococcus)、魏

斯氏菌和乳桿菌屬(Lactobacillus)，分別為22.65%、9.98%和9.74%。青貯后片球菌和乳桿菌菌群數(shù)量顯著增加(P<0.05)，魏斯氏菌屬菌群數(shù)量顯著降低(P<0.05)。

表8　青貯前后玉米秸稈屬水平上菌群結(jié)構(gòu)

3討論

我國是世界上農(nóng)作物秸稈生產(chǎn)量最大的國家之一，2010年全國秸稈理論資源量為8.4億t，可收集資源量約為7億t，其中，玉米秸稈資源量最大，約為2.43億t，占秸稈可收集資源量的34.7%[19]。有研究報道玉米秸稈經(jīng)過青貯處理后，不僅能保持青綠飼料的青鮮狀態(tài)，具有明顯的酸甜芳香氣味，與玉米秸稈相比飼料中的CP含量可增加3.3%～16.4%，粗纖維含量降低5%～15%[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過青貯發(fā)酵45 d后的玉米秸稈青貯飼料均呈黃綠色，在色澤上無明顯差別，無霉變情況發(fā)生，質(zhì)地較好，無粘手現(xiàn)象，呈酸香味。另外，青貯發(fā)酵作用能夠使玉米秸稈NDF及ADF含量有下降趨勢，與其相符。而本研究中，玉米秸稈青貯后CP含量有下降趨勢，與其不符，原因可能是玉米秸稈青貯后NH3-N含量由14.98 g/kg上升到61.19 g/kg，從而消耗了部分CP。

本研究通過MiSeq高通量測序發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈在青貯后，菌落種類僅為青貯前的52.31%，其中共有菌種僅占玉米秸稈青貯前菌種數(shù)量的40.87%。青貯發(fā)酵能夠改變青貯飼料中群落結(jié)構(gòu)及豐度，原因可能是青貯制作時會將空氣排出形成一個封閉系統(tǒng)，為菌落的繁殖提供無氧環(huán)境，另外玉米秸稈中所含的可溶性糖等物質(zhì)能夠為菌落的繁殖提供底物，使得有益細(xì)菌迅速繁殖，降低青貯料pH，從而影響青貯過程中細(xì)菌群落的構(gòu)成[22]。青貯發(fā)酵不僅改變了玉米秸稈的品質(zhì)，同時改變了其菌落構(gòu)成，這說明二者之間存在著巨大的相關(guān)性。

玉米秸稈中菌群數(shù)量占絕對優(yōu)勢的2個門為厚壁菌門和變形菌門。經(jīng)過青貯發(fā)酵后，厚壁菌門菌群數(shù)量由18.76%增加至44.06%，厚壁菌門是原核生物系統(tǒng)進(jìn)化樹低GC含量的革蘭氏陽性菌，主要有產(chǎn)芽孢、非產(chǎn)芽孢和支原體菌群，很多芽孢桿菌可以降解多種大分子化合物，如纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)等[2]。而玉米秸稈青貯后NDF、ADF及CP含量均有下降趨勢，由此可推斷青貯飼料中纖維素及蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)含量的部分變化可能是由厚壁菌門細(xì)菌引起的。變形菌門是革蘭氏陰性細(xì)菌，是細(xì)菌中最大的一門，包括很多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、弧菌和螺桿菌等種類[23]。青貯飼料中的腸道細(xì)菌盡管被認(rèn)為不屬于致病菌，但因其會與乳酸菌競爭性利用糖類物質(zhì)，同時降解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生影響青貯口味的毒素生物胺，并阻礙青貯飼料pH的降低。另外在青貯環(huán)境下腸道細(xì)菌還能將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽[24]。而經(jīng)過青貯發(fā)酵變形菌門菌群數(shù)量顯著降低，由此可見，玉米秸稈中WSC含量顯著降低除部分被乳酸菌所利用外，有部分是被變形菌門細(xì)菌所利用，而青貯后CP含量的下降趨勢和NH3-N含量的增加也與其有著密不可分的關(guān)系。另外，在綱、目和科水平上，同樣發(fā)現(xiàn)青貯前玉米秸稈中占據(jù)絕對優(yōu)勢地位的含致病菌較多的γ-變形菌綱、腸桿菌目和腸桿菌科菌群數(shù)量均顯著降低，而經(jīng)過青貯發(fā)酵后芽孢桿菌綱、乳桿菌目和乳桿菌科菌群數(shù)量顯著增加，這說明青貯過程改善玉米秸稈顏色、氣味、質(zhì)地、發(fā)酵品質(zhì)以及營養(yǎng)成分的同時，可以有效降低有害細(xì)菌的數(shù)量，增加有益菌的數(shù)量，從而可以降低致病菌對家畜健康存在的潛在風(fēng)險，改善家畜健康。

Cai等[25]從各個時期的水稻青貯中分離到了161株乳酸菌，根據(jù)形態(tài)和DNA序列分析，將這些菌株分類為乳球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬、腸球菌屬、片球菌屬和魏斯氏菌屬，這些菌株主要為同型發(fā)酵乳酸菌，占總數(shù)的66%。Dunière等[3]認(rèn)為，玉米青貯中主要的細(xì)菌種類分別為類芽孢桿菌(Paenibacillus)、黃桿菌(Flavobacteriaceae)、鞘氨醇單胞菌、微小桿菌(Exiguobacterium)、根瘤菌、不動桿菌(Acinetobacter)和Buchnera菌。在本試驗中，青貯后玉米秸稈上菌群數(shù)量為前10位的，分別是片球菌、魏斯氏菌、乳桿菌屬、鞘氨醇菌屬、嗜菌屬(Stenotrophomonas)、Swaminathania屬、不動桿菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)、Hymenobacter屬和歐文氏菌屬(Erwinia)。研究結(jié)果的差異可能是由于細(xì)菌種類檢測手段、試驗樣品、發(fā)酵時間和發(fā)酵方式等不同造成的。前人研究發(fā)現(xiàn)，青貯飼料發(fā)酵初期，片球菌起著非常重要的作用，植物原料在收獲制作成青貯飼料后，最先進(jìn)行發(fā)酵的是糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)和腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，接著被更耐酸的菌株，如植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)和布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)等取代[26]。張想峰等[27]認(rèn)為在青貯發(fā)酵后期起主要作用的是乳酸桿菌。楊楊等[28]認(rèn)為，魏斯氏菌在青貯飼料發(fā)酵初期起重要作用，且在提高青貯飼料品質(zhì)方而作用較小。本研究發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈青貯45 d后，片球菌菌群數(shù)量由1.05%增加至22.65%，魏斯氏菌屬菌群數(shù)量由16.92%降低到9.98%，乳桿菌屬菌群數(shù)量由0.07%增加至9.74%，這說明片球菌和乳桿菌在青貯過程中繁殖迅速，發(fā)揮著重要作用。而魏斯氏菌屬菌群數(shù)量青貯初期較高，青貯后期數(shù)量下降，說明其可能是在青貯初期發(fā)揮作用較大，與楊楊等[28]觀點一致。與前人研究相比，采用Miseq高通量平臺測序不僅能夠確定整個菌落的構(gòu)成，避免傳統(tǒng)微生物鑒定方法只能反映出樣品少數(shù)優(yōu)勢菌的信息，無法對樣品中的微生物做到絕對定量的劣勢，體現(xiàn)其極大的優(yōu)越性。本試驗僅對Miseq高通量平臺測序技術(shù)對玉米秸稈青貯飼料青貯前后菌群結(jié)構(gòu)及豐度進(jìn)行了初步的摸索，而不同處理、品種、青貯時間等因素均可能對微生物種類產(chǎn)生影響，本課題組相關(guān)研究正在開展中。

4結(jié)論

① 玉米秸稈經(jīng)過青貯發(fā)酵后顏色黃綠，質(zhì)量良好，具有酸香味；pH迅速降低，乳酸含量顯著增加，NDF及ADF含量有下降趨勢。

② 玉米秸稈經(jīng)過青貯發(fā)酵后變形菌門、γ-變形菌綱、腸桿菌目、腸桿菌科、魏斯氏菌屬菌群數(shù)量顯著降低，厚壁菌門、芽孢桿菌綱、乳桿菌目、乳桿菌科、片球菌屬和乳桿菌屬菌群數(shù)量顯著增加。

③ 通過實驗室檢測手段及Miseq高通量測序技術(shù)相結(jié)合，能夠在分析青貯品質(zhì)的同時， 提供青貯前后整個菌落構(gòu)成及豐度變化的信息，進(jìn)而為發(fā)酵過程的調(diào)控提供依據(jù)。

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(責(zé)任編輯武海龍)

Effects of Ensiling on Quality and Bacteria Composition of Corn Stalk

TAO LianDIAO Qiyu*

(Key Laboratory of Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture, Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

Abstract:The objective of the present study was to investigate the effects of ensiling process of corn stalk silage on its sensory indicators, fermentation quality, nutrition composition and bacteria composition and abundance in phylum, class, order, family and genus. Green and dough stage corn stalk without ear was chopped to 1 to 2 cm with water content of 65% to 70%. Each three samples were collected and packaged by vacuum packager in polyethylene bags before and after ensiling process. After being stored at room temperature for 45 days, changes of the silage quality and bacteria composition were analyzed using laboratory testing methods and MiSeq sequencing technology. The results showed as follows: 1) the corn silage was yellow-green and had the good texture and smell after ensiling 45 days. The pH was rapidly increased (P<0.05), the lactic acid content was significantly increased (P<0.05), while the content of neutral detergent fiber (NDF) and acid detergent fiber (ADF) had the downward trend (P>0.05). 2) After ensiling of corn silage, the numbers of Proteobacteria plylum, Gammaproteobacteria class, Enterobacteriales order, Enterobacteriaceae family and Weissella genus were significantly decreased (P<0.05), while the numbers of Firmicutes phylum, Bacilli class, Lactobacillales order, Lactobacillaceae family, and Pediococcus and Lactobacillus genus were significantly increased (P<0.05). In conclusion, ensiling process can improve the sensory indicators, fermentation quality, nutrition composition with effectively reducing the amount of harmful bacteria and increasing the number of beneficial bacteria, which can reduce the potential risk to animal health pathogens exist. Combing laboratory testing methods and MiSeq sequencing technology can provide the information of silage quality and the composition and abundance of bacteria, which can provide the basis for the regulation of the fermentation process.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(1)：198-207]

Key words:MiSeq; corn stalk; ensiling; quality; bacteria

*Corresponding author, professor, E-mail: diaoqiyu@caas.cn

中圖分類號：S816

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)01-0198-10

作者簡介：陶蓮(1984—)，女，達(dá)斡爾族，內(nèi)蒙古呼倫貝爾人，在站博士后，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail: cautaolian@163.com*通信作者：刁其玉，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: diaoqiyu@caas.cn

基金項目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(20120304202)

收稿日期：2015-07-08

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.01.026