COPD模型大鼠氣道黏液高分泌機(jī)制及健脾益肺化痰方干預(yù)作用*

劉 娟，鐘相根，鄧秀蘭，李 配，齊明月，趙娜妹

北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029

COPD模型大鼠氣道黏液高分泌機(jī)制及健脾益肺化痰方干預(yù)作用*

劉 娟，鐘相根，鄧秀蘭△，李 配，齊明月，趙娜妹

北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029

目的：觀察健脾益肺化痰系列方對慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)模型大鼠的防治作用及其機(jī)制。方法：采用單純香煙煙熏法建立COPD大鼠模型。將60只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、健脾益肺化痰方組、健脾益肺方組、化痰方組和羧甲司坦組，每組10只。健脾益肺化痰方組、健脾益肺方組、化痰方組和羧甲司坦組大鼠分別給予相應(yīng)的藥物灌胃治療，正常組和模型組灌胃等體積純凈水。用酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)檢測各組大鼠肺泡灌洗液(BALF)中黏蛋白5AC(MUC5AC)、黏蛋白5B(MUC5B)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、環(huán)氧化酶2(COX2)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)、前列腺素E2(PGE2)的含量。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液(BALF)中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2含量顯著升高(P＜0.05)。與模型組比較，健脾益肺化痰組、健脾益肺組、化痰組大鼠肺泡灌洗液(BALF)中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2含量均降低(P＜0.05)。結(jié)論：健脾益肺化痰系列方中以標(biāo)本兼治的健脾益肺化痰方尤為突出，能降低COPD模型大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量，抑制氣道黏液高分泌傳導(dǎo)通路，使氣道結(jié)構(gòu)重塑，改善氣道通氣狀況，最終改善COPD模型大鼠肺功能。

COPD；氣道黏液高分泌；標(biāo)本兼治；健脾益肺化痰系列方

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以氣道不完全可逆性氣流受限為特征的慢性疾病，與肺部對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。COPD以氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管的慢性炎癥為特征，同時(shí)氣道黏液高分泌是其重要的病理生理特征，可加重氣道阻塞，并致下呼吸道感染難以控制，已被認(rèn)為是影響COPD病死率和預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］。氣管、支氣管杯狀細(xì)胞化生是黏蛋白的主要來源，也是黏液過度分泌的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。研究顯示［2］，黏蛋白5AC(MUC5AC)、黏蛋白C5B(MUC5B)是構(gòu)成黏液的主要低聚物黏蛋白，在COPD患者中表達(dá)明顯增加，MUC5AC存在于氣道上皮杯狀細(xì)胞，MUC5B存在于黏膜下腺體。研究表明［3-4］參與COPD對黏液分泌有作用的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)有IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IL-17，以 及TNF-α、EGF、前列腺素、白三烯等，且它們之間存在協(xié)同效應(yīng)。目前認(rèn)為杯狀細(xì)胞化生及MUC5AC基因表達(dá)的關(guān)鍵介導(dǎo)環(huán)節(jié)涉及白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導(dǎo)通路。

本課題在“黏液高分泌”及“痰”相關(guān)理論的指導(dǎo)下，采用單純香煙煙熏建立COPD大鼠模型，以健脾益肺化痰系列方藥進(jìn)行干預(yù)治療，觀察發(fā)現(xiàn)健脾益肺化痰系列方可顯著改善COPD大鼠肺功能、血?dú)饧胺谓M織病理狀況［5］，本研究擬從氣道黏液高分泌角度，進(jìn)一步探討健脾益肺化痰系列方防治COPD的作用機(jī)制及針對“痰”進(jìn)一步辨證論治的差異性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級健康雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(180±20)g，鼠齡10～12周［購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，動(dòng)物許可證號：SCXK(京) 2012-0001]，于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)7天。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥實(shí)驗(yàn)用中藥材全部購自北京同仁堂醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室鑒定。生藥劑量比例按原著換算，依照人單位體質(zhì)量生藥量求得大鼠單位體質(zhì)量生藥量，擴(kuò)大10倍。各組藥物分別以純凈水煎煮30分鐘，提取2次。再合并煎液，并將所得藥液用雙層紗布過濾，水浴加熱蒸發(fā)濃縮，貯于冰箱中備用。羧甲司坦組予羧甲司坦(北京曙光藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：H11021036，規(guī)格：250 mg×12片×2板/盒)500 mg/kg灌胃，劑量參考文獻(xiàn)［6］。

1.2.1 健脾益肺化痰方 由四君子湯、玉屏風(fēng)散、二陳湯加桔?；梅浇M成。藥物組成：黨參15 g，茯苓15 g，白術(shù)10 g，炙甘草5 g，黃芪15 g，防風(fēng)6 g，半夏10 g，陳皮10 g，桔梗10 g。

1.2.2 健脾益肺方 四君子湯合玉屏風(fēng)散組成。藥物組成：黨參15 g，茯苓15 g，白術(shù)10 g，炙甘草5 g，黃芪15 g，防風(fēng)6 g。

1.2.3 化痰方 即二陳湯加桔梗化裁方，藥物組成：半夏10 g，陳皮10 g，茯苓15 g，炙甘草5 g，桔梗10 g。

1.3 儀器與試劑大前門牌香煙(烤煙型，焦油量12 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，煙氣一氧化碳含量14 mg)；自制動(dòng)物熏煙箱(60 cm×50 cm×40 cm)；自動(dòng)切片機(jī)、自動(dòng)包埋機(jī)；溫控儀鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；高精度可調(diào)節(jié)移液器，槍頭(白槍頭、黃槍頭、藍(lán)槍頭)；吸水紙(自備)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn))；TECAN全波長酶標(biāo)儀(Thermo生產(chǎn)，Multiskan MK3)；離心機(jī)(Tomy Seiko生產(chǎn))；試管及離心管，容量瓶，蒸餾水。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、健脾益肺化痰方組、健脾益肺方組、化痰方組、羧甲司坦組，共6組，每組10只。模型組于吸煙造模12周后每天給予等體積純凈水灌胃，各給藥組于吸煙第13周起于每日上午吸煙前半小時(shí)給予相應(yīng)藥物灌胃；正常組每天給予等體積純凈水灌胃。

1.4.2 COPD大鼠模型建立 參考文獻(xiàn)［7］方法，采用單純香煙煙熏法復(fù)制COPD大鼠模型。模型組及各給藥組大鼠放入自制被動(dòng)吸煙玻璃熏箱，箱頂留有通氣孔，燃燒大前門牌香煙，由三通管導(dǎo)入煙霧。1次熏煙燃燒大前門香煙12支，每支香煙約產(chǎn)生煙霧1 L，煙霧濃度約5%，持續(xù)0.5小時(shí)，每日吸煙2次，上下午各1次，每周5天，連續(xù)16周。1.4.3 實(shí)驗(yàn)取材 實(shí)驗(yàn)大鼠在末次給藥后，禁食12小時(shí)，4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉。隨機(jī)挑選等量的各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物，行正中切口，氣管插管，進(jìn)行生理鹽水支氣管肺泡灌洗3次，5 mL/次。待注入生理鹽水后，輕輕按摩肺組織30秒，回收支氣管肺泡灌洗液(BALF)，記錄回收的灌洗液量(保證回收率＞80%)。將回收的BALF離心(3 000 r/min，4℃) 10分鐘，用于ELISA檢測。

1.4.4 酶聯(lián)免疫測定法(ELISA) 檢測大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量。

1.4.4.1 試劑盒組成 酶標(biāo)板：12條×8孔；標(biāo)準(zhǔn)品：2瓶(凍干品)；生物素標(biāo)記抗體：1×120 μL/瓶；辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素：1×120 μL/瓶；生物素標(biāo)記抗體稀釋液：1×15 mL/瓶；辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液：1×15 mL/瓶；樣本稀釋液：1× 50 mL/瓶；濃洗滌液：1×20 mL/瓶；底物溶液：1× 10 mL/瓶；終止液：1×10 mL/瓶；板貼：4張；密封袋：1個(gè)。

1.4.4.2 操作步驟 1)將各種試劑移至室溫(18～25℃)平衡至少30分鐘，按各自試劑配制方法配制試劑以備用；2)加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔。每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本100 μL，輕輕晃動(dòng)混勻，覆上板貼，37℃溫育2小時(shí)；3)棄去液體，甩干，不用洗滌；4)每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，覆上新的板貼，37℃溫育1小時(shí)；5)棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2分鐘，200 μL/孔，甩干；6)每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μL，覆上新的板貼，37℃溫育1小時(shí)；7)棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2分鐘，200 μL/孔，甩干；8)依序每孔加底物溶液90 μL，37℃避光顯色15～30分鐘；9)依序每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)；10)在反應(yīng)終止后5分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以(±s)表示，多組樣本間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

模型組大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量均顯著升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。健脾益肺化痰組、健脾益肺組、化痰組大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量均降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3組中藥給藥組之間比較，健脾益肺化痰組(標(biāo)本兼治組)COPD模型大鼠炎癥因子IL-1β、TGF-α的含量下降較明顯，化痰組(治標(biāo)組)次之，健脾益肺組(治本組)COPD模型大鼠IL-1β、TGF-α含量下降最低。健脾益肺化痰組(標(biāo)本兼治組)COPD模型大鼠炎癥因子COX2、PGE2的含量下降較明顯，健脾益肺組(治本組)次之，化痰組(治標(biāo)組)COPD模型大鼠COX2、PGE2含量下降最低，見表1—2。

表1 各組大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B的含量(±s) pg/mL

表1 各組大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B的含量(±s) pg/mL

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；☆表示與健脾益肺組比較，P＜0.05；△表示與化痰組比較，P＜0.05。

組別 只數(shù) MUC5AC MUC5B正常組 10 142.2±23.8 87.8±49.5模型組 10 782.1±93.2*1972.9±551.2*健脾益肺化痰組 10 402.5±55.6#△760.4±111.9#△健脾益肺組 10 495.1±83.1#1905.4±453.0#化痰組 10 629.8±48.6#☆1919.7±286.8#☆羧甲司坦組 10 556.5±86.9 1445.9±255.4

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量(±s) pg/mL

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量(±s) pg/mL

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；☆表示與健脾益肺組比較，P＜0.05；△表示與化痰組比較，P＜0.05。

組別 只數(shù) IL-1β COX2TGF-α PGE2正常組 10 65.53±7.36 82.79±13.50 260.15±51.05 5.38±3.95模型組 10 164.43±34.97*128.36±10.45*397.21±102.84*28.76±4.38*健脾益肺化痰組 10 96.30±15.26#96.69±18.04#205.56±43.48#△☆11.33±5.34#健脾益肺組 10 152.73±24.79#△115.83±25.66#356.24±68.22 12.16±2.54#化痰組 10 101.05±23.51#117.48±26.97 341.30±64.60 12.21±3.75#羧甲司坦組 10 117.55±8.99 95.09±36.00 242.70±70.07 10.04±6.58

3 討論

杯狀細(xì)胞化生和黏液高分泌過度分泌是COPD氣道慢性炎癥的重要病理改變，過度分泌的黏液潴留于氣道，加重了已經(jīng)狹窄氣道的阻塞，加速了肺功能的下降進(jìn)程，容易導(dǎo)致氣道內(nèi)感染的發(fā)生，病情惡化。COPD氣道黏液高分泌的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是杯狀細(xì)胞化生/增生，而IL-13、IL-1β、TNF-α信號通路參與刺激誘導(dǎo)了杯狀細(xì)胞的化生/增生。此外，EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是諸多刺激因子誘導(dǎo)MUC5AC基因表達(dá)的共同通路，多種刺激物可通過NE/TNF-α/TGF-α/EGFR等信號途徑，上調(diào)MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄和MUC5AC生成［8］。IL-1β激活COX2/PGE2；經(jīng)MAPK激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinasel1/2，ERK1/2)和p38-MAPK途徑，激活環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)，從而誘導(dǎo)MUC5AC基因的表達(dá)［9 ］。

COPD屬中醫(yī)學(xué)“肺脹”“咳嗽”“喘證”“痰飲”范疇，在對其病證病機(jī)的認(rèn)識中，始終重視痰的作用［10-13］；在治療過程中，也積極化痰，大多以益氣健脾化痰法為原則［14］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“脾為生痰之源，肺為貯痰之器”，肺脾氣虛，津液不化，痰濁潴留，伏痰形成；外邪引動(dòng)伏痰，引發(fā)COPD。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與中醫(yī)學(xué)對本病進(jìn)行較為全面的研究［15］，認(rèn)識到現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“氣道黏液高分泌”就是中醫(yī)學(xué)的“痰”。相關(guān)臨床研究［16-18］表明，健脾益肺化痰系列方治療穩(wěn)定期COPD患者，具有減輕臨床癥狀，減少急性發(fā)作頻率，改善呼吸功能等作用。藥理研究［19］表明，健脾益肺化痰系列方具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗變態(tài)反應(yīng)、抗菌抗病毒、抗纖維化、增強(qiáng)腎上腺皮質(zhì)功能等功效。臨床上通過抑制黏液高分泌或化痰，可以有效緩解COPD的發(fā)?。?0-21］。本實(shí)驗(yàn)選用健脾益肺化痰方及其拆方，從氣道黏液高分泌角度探討其作用機(jī)制，并著重對比分析“健脾益肺化痰標(biāo)本兼治”的干預(yù)作用。

綜上所述，健脾益肺化痰系列方中以標(biāo)本兼治的健脾益肺化痰方尤為突出，可以通過抑制COPD氣道上皮杯狀細(xì)胞化生及黏液高分泌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制氣道黏液高分泌，使氣道結(jié)構(gòu)重塑，改善氣道通氣狀況，最終改善COPD模型大鼠肺功能。這可能是健脾益肺化痰標(biāo)本兼治法改善COPD大鼠肺功能的效應(yīng)機(jī)制之一，可為臨床使用健脾益肺化痰系列方防治COPD提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Airway Mucus Hypersecretion Mechanism in Rat with COPD Model and Intervention Process of Tonifying the Spleen and Nourishing the Lung as well as Eliminating Phlegm

LIU Juan,ZHONG Xianggen,DENG Xiulan△,LI Pei,QI Mingyue,ZHAO Namei College of Basic Medical Sciences,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China

A

1004-6852(2016)11-0011-04

2016-01-14

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號81173314，81473666)；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科基本科研項(xiàng)目(編號2013-ZDXKKF-03)。

劉娟(1987—)，女，在讀碩士研究生。研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病的中醫(yī)藥防治。

△通訊作者：鄧秀蘭(1963—)，女，碩士學(xué)位，副教授。研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病的診治。