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    環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)早期診斷結(jié)核性腦膜炎的研究

    2016-04-27 07:42:34孫雯雯肖和平
    中國(guó)防癆雜志 2016年12期
    關(guān)鍵詞:腦膜炎結(jié)核性敏感度

    孫雯雯 肖和平

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    ·論著·

    環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)早期診斷結(jié)核性腦膜炎的研究

    孫雯雯 肖和平

    目的 評(píng)價(jià)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)快速檢測(cè)腦脊液標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌對(duì)于結(jié)核性腦膜炎(TBM)早期診斷的價(jià)值。 方法 收集上海市肺科醫(yī)院于2014年1月至2015年12月收治的200例疑診為TBM的患者在行抗結(jié)核藥物治療前的腦脊液標(biāo)本,分別采用結(jié)核分枝桿菌涂片法(簡(jiǎn)稱“涂片法”)、BACTECTMMGIT液體960培養(yǎng)法(簡(jiǎn)稱“MGIT 960培養(yǎng)法”)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RTFQ PCR)法和LAMP技術(shù)檢測(cè)腦脊液標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌。使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)算LAMP技術(shù)診斷TBM的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值; 4種檢測(cè)方法陽(yáng)性檢出率的比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;LAMP技術(shù)與其他3種檢測(cè)方法檢測(cè)的一致性評(píng)價(jià)采用Kappa檢驗(yàn)。結(jié)果 200例患者中臨床確診為結(jié)核性腦膜炎者172例(86.00%),4種檢測(cè)方法(涂片法、MGIT 960培養(yǎng)法、LAMP法,RTFQ PCR)對(duì)診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感度分別為2.91%(5/172)、12.79%(22/172)、43.02%(74/172)、34.30%(59/172)。LAMP法與涂片法、MGIT960培養(yǎng)法比較,敏感度均明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=75.11,P=0.000;χ2=43.88,P=0.002);與RTFQ PCR法比較,敏感度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.08,P=0.130)。LAMP技術(shù)對(duì)診斷結(jié)核性腦膜炎的特異度分別為92.86%(26/28),其他3種檢測(cè)方法均為100.00%(28/28)。LAMP技術(shù)與RTFQ PCR、MGIT 960培養(yǎng)法、涂片法檢測(cè)結(jié)核性腦膜炎一致性總體符合率與Kappa系數(shù)分別為88.50%(177/200)、0.87;71.00%(142/200)、0.73;63.50%(127/200)、0.59。結(jié)論 LAMP 技術(shù)在診斷結(jié)核性腦膜炎患者中具有較高的敏感度、特異度,與MGIT960培養(yǎng)法及RTFQ PCR法具有較高的一致性,對(duì)于結(jié)核性腦膜炎的早期診斷具有一定的臨床價(jià)值。

    結(jié)核, 腦膜; 診斷; 實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和方法; 核酸擴(kuò)增技術(shù); 對(duì)比研究

    結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis,TBM)患者臨床表現(xiàn)缺乏特異性,病原學(xué)陽(yáng)性檢出率極低,國(guó)內(nèi)報(bào)道腦脊液(cerebro-spinal fluid,CSF)結(jié)核分枝桿菌(MTB)檢出率僅為12.3%[1]。TBM患者的CSF改變多不典型,易與新型隱球菌性腦膜炎、病毒性腦膜炎等相混淆,故早期診斷存在困難。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)是一種新型的核酸擴(kuò)增方法,該方法無(wú)需昂貴的設(shè)備和嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件,具有方法簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速靈敏等優(yōu)點(diǎn)。目前,國(guó)內(nèi)外已有研究者做了一些有益的探索[2],但應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測(cè)CSF中結(jié)核分枝桿菌的研究極為少見,于霞等[3]在采用LAMP技術(shù)檢測(cè)臨床標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的系統(tǒng)評(píng)價(jià)中指出,納入全球18項(xiàng)研究中17項(xiàng)為痰標(biāo)本,因此臨床上針對(duì)LAMP技術(shù)在CSF結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方面的應(yīng)用價(jià)值缺乏較大樣本量的研究。本研究收集200例上海市肺科醫(yī)院于2014年1月至2015年12月收治的疑診為結(jié)核性腦膜炎患者在行抗結(jié)核藥物治療前的CSF標(biāo)本,分別采用結(jié)核分枝桿菌抗酸染色涂片法(簡(jiǎn)稱“涂片法”)、BACTECTMMGIT 960液體培養(yǎng)法(簡(jiǎn)稱“MGIT 960培養(yǎng)法”)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ PCR)、LAMP法檢測(cè)標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌,對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以評(píng)價(jià)LAMP技術(shù)對(duì)結(jié)核性腦膜炎早期診斷的價(jià)值。

    資料和方法

    一、一般資料

    選取上海市肺科醫(yī)院于2014年1月至2015年12月收治的疑診為結(jié)核性腦膜炎并擬行抗結(jié)核藥物治療的患者200例。根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)、排除標(biāo)準(zhǔn)最終臨床確診為結(jié)核性腦膜炎患者(簡(jiǎn)稱“TBM組”)172例,其中男108例(62.79%),女64例(37.21%),年齡16~78歲,平均年齡為(38.6±22.8)歲;排除結(jié)核性腦膜炎的患者(簡(jiǎn)稱“非TBM組”)28例,其中男19例(67.86%),女9例(32.14%),年齡為21~76歲,平均年齡為(42.8±24.5)歲。28例非TBM組患者中,16例為病毒性腦膜炎、6例為細(xì)菌性腦膜炎、4例為隱球菌腦膜炎、2例為肺癌腦轉(zhuǎn)移。收集患者抗結(jié)核藥物治療前的腦脊液標(biāo)本,保存于-20 ℃冰箱內(nèi)直至統(tǒng)一檢測(cè)。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意,所以患者均簽署用于本次臨床試驗(yàn)采取標(biāo)本的知情同意書。

    二、參照標(biāo)準(zhǔn)

    結(jié)核性腦膜炎的診斷建立根據(jù)2010年國(guó)際TBM協(xié)作組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4],評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

    1.臨床疑診標(biāo)準(zhǔn)為包含以下1個(gè)或多個(gè)癥狀或體征:發(fā)熱、頭痛、嘔吐、易激惹、腦膜刺激征、抽搐、局灶性神經(jīng)損害、意識(shí)狀態(tài)改變或嗜睡。

    2.結(jié)核性腦膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn):(1)確診結(jié)核性腦膜炎須符合以下標(biāo)準(zhǔn)之一:①臨床入選標(biāo)準(zhǔn)+CSF抗酸染色陽(yáng)性,或CSF結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性,或CSF核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性;②腦(脊髓或腦膜)組織的抗酸染色陽(yáng)性,且符合結(jié)核病病理變化 (多見于尸檢中)。(2)很可能的結(jié)核性腦膜炎:臨床入選標(biāo)準(zhǔn)+診斷評(píng)分10分(無(wú)影像學(xué)資料)或12分(有影像學(xué)資料)+排除診斷,其中至少有2分來(lái)自腦脊液檢測(cè)或腦影像學(xué)評(píng)分。(3)可能的結(jié)核性腦膜炎:臨床入選標(biāo)準(zhǔn)+診斷評(píng)分9分(無(wú)影像學(xué)資料)或6~11分(有影像學(xué)資料)+排除診斷,如未行腰椎穿刺術(shù)或頭顱正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)(PET)不能做此診斷。所有入組患者均經(jīng)過(guò)規(guī)范抗結(jié)核藥物治療4~8周,并根據(jù)臨床癥狀改善情況復(fù)查腦脊液、影像學(xué)等檢查,并以此資料建立臨床診斷,對(duì)疑診患者抗結(jié)核藥物治療無(wú)效者均行進(jìn)一步檢查明確診斷。

    三、檢測(cè)方法

    1.結(jié)核分枝桿菌抗酸染色涂片法:收集1 ml腦脊液標(biāo)本進(jìn)行涂片,干燥后行抗酸染色,鏡檢查找抗酸桿菌。操作嚴(yán)格按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷檢驗(yàn)規(guī)程》[5]和試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。

    2. MGIT 960液體培養(yǎng):收集經(jīng)4% NaOH溶液處理的腦脊液標(biāo)本1 ml,取0.1 ml接種于酸性羅氏培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)斜面上, 每份標(biāo)本分別接種2支, 置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4~8周,記錄培養(yǎng)結(jié)果。MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)由美國(guó) BD 公司生產(chǎn)。將腦脊液標(biāo)本按照 BACTECTMMGIT生產(chǎn)規(guī)范(MGITTMProcedure Manual)要求進(jìn)行培養(yǎng)[6]。

    表1 結(jié)核性腦膜炎的臨床診斷和排除診斷

    3.DNA提取與LAMP技術(shù)檢測(cè):收集1.5 ml腦脊液進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌DNA提取與LAMP技術(shù)檢測(cè)。針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異靶基因序列IS6110設(shè)計(jì)引物(所用引物)如下:

    F3 5′-AGACCTCACCTATGTGTCGA-3′;B3 5′-TCGCTGAACCGGATCGA-3′;FIP 5′-ATGGAGGTGGCCATCGTGGAAGCCTACGTGGCCTTTGTCAC-3′;BIP 5′-AAGCCATCTGGACCCGCCAACCCCTATCGTATGGTG-GAT-3′;FLP 5′-AGGATCCTGCGAGCGTAG-3′; BLP 5′-AAGAAGGCGTACTCGACCTG-3′。

    (1)DNA提?。翰捎煤怂峥焖偬崛≡噭┖衃榮研生物科技(中國(guó))有限公司],該試劑盒通過(guò)對(duì)樣本中所含的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行破碎處理,使細(xì)菌內(nèi)所含的核酸游離到溶液中,并將得到的溶液與吸附劑試劑管中的多孔介質(zhì)混合,把樣本中所含的阻礙核酸擴(kuò)增反應(yīng)的物質(zhì)去除,在通過(guò)滴注蓋薄膜濾器,使核酸溶液被提取出來(lái)。操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。(2)LAMP擴(kuò)增:采用達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒。將30 μl的核酸溶液加到反應(yīng)試管中。將恒溫器在67 ℃加熱40 min,再用加熱器進(jìn)行酶的滅活,80 ℃,5 min。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)管上下甩動(dòng)數(shù)次,使反應(yīng)液中的擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)先包被在試管內(nèi)壁的SYBR Green I染料混合,置于紫外線燈管下照射,陽(yáng)性管發(fā)出綠色熒光,未發(fā)出熒光為陰性。操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

    4.RTFQ PCR法:采用達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒,實(shí)時(shí)熒光核酸擴(kuò)增儀(型號(hào)DA7600),按試劑盒方法進(jìn)行檢測(cè)。

    四、相關(guān)定義

    (1)敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%;(2)特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%;(3)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%;(4)陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。

    五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 17.0軟件將所有患者基礎(chǔ)信息和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果建立數(shù)據(jù)庫(kù)。所有患者隨訪至少6個(gè)月,動(dòng)態(tài)記錄臨床癥狀及體征、腦脊液檢測(cè)指標(biāo)、影像學(xué)表現(xiàn)、治療后轉(zhuǎn)歸,建立最終的臨床診斷。根據(jù)2010國(guó)際TBM協(xié)作組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4],選擇符合確診標(biāo)準(zhǔn)患者的CSF標(biāo)本。使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)算LAMP法診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值。對(duì)不同方法檢出率的比較使用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;進(jìn)行LAMP法與其他3種檢測(cè)方法的一致性檢驗(yàn),計(jì)算Kappa系數(shù)。Kappa系數(shù)取值在-1~+1,其值越大,說(shuō)明一致性越高,Kappa系數(shù)在0.3~0.7提示一致性較好,Kappa系數(shù)>0.7說(shuō)明一致性強(qiáng)。

    結(jié) 果

    一、 4種檢測(cè)方法的檢出情況

    在最終確診為結(jié)核性腦膜炎的172例患者中,4種檢測(cè)方法(涂片法、MGIT 960液體培養(yǎng)法、LAMP法,RTFQ PCR法)陽(yáng)性檢出率分別為2.91%(5/172)、12.79%(22/172)、43.02%(74/172)、34.30%(59/172)。檢出時(shí)間(中位數(shù))結(jié)果說(shuō)明,LAMP法的檢出時(shí)間最短(表2)。

    二、 4種檢測(cè)方法檢測(cè)的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值

    本研究的200例患者中,LAMP診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感度為43.02%(74/172)、特異度為92.86%(26/28)、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為97.37%(74/76)、陰性預(yù)測(cè)值為20.97%(26/124);LAMP法與涂片法、MGIT 960培養(yǎng)法相比,敏感度明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=75.11,P=0.000;χ2=43.88,P=0.002);與RTFQ PCR法相比,敏感度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.08,P=0.130)。具體見表3。

    三、LAMP與其他3種方法檢測(cè)結(jié)果比較

    以RTFQ PCR陽(yáng)性為標(biāo)準(zhǔn),PCR陽(yáng)性者LAMP的敏感度為94.92%(56/59),PCR陰性者LAMP的特異度為85.82%(121/141)。2種方法具有較強(qiáng)的一致性符合率88.50%(177/200),Kappa系數(shù)為0.87;以BACTEC MGIT 960培養(yǎng)法陽(yáng)性為金標(biāo)準(zhǔn),培養(yǎng)陽(yáng)性者LAMP的敏感度為90.91%(20/22),培養(yǎng)陰性者LAMP的特異度為68.54%(122/178),2種方法的一致性符合率為71.00% (142/200),Kappa系數(shù)為0.73;以涂片法為標(biāo)準(zhǔn),涂片陽(yáng)性者LAMP的敏感度為80.00%(4/5),涂片陰性者LAMP的特異度為65.08%(123/195),兩者一致性符合率為63.5%(127/200),Kappa系數(shù)為 0.59(表4)。

    表2 不同檢測(cè)方法檢測(cè)TBM及非TBM患者的結(jié)果分析

    表3 4種方法診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值

    注 敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%;特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%;陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%;陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

    表4 其他3種方法檢測(cè)結(jié)果與LAMP檢測(cè)結(jié)果的比較

    討 論

    結(jié)核病已成為全世界范圍內(nèi)危害人類生命安全的主要傳染性疾病之一,并位列感染性疾病死因第二名[7]。TBM是結(jié)核分枝桿菌感染后經(jīng)血行播散種植于腦膜和軟腦膜,進(jìn)而侵入蛛網(wǎng)膜下隙引起腦血管或腦實(shí)質(zhì)病變的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病。但部分患者發(fā)病隱匿,臨床表現(xiàn)不典型,其危害比較嚴(yán)重,預(yù)后差。因此,提高TBM的早期診斷已經(jīng)成為目前TBM診療環(huán)節(jié)中急需解決的臨床問(wèn)題之一。據(jù)最新國(guó)際TBM診斷標(biāo)準(zhǔn)[4],指出CSF中鏡檢查到抗酸桿菌、分離培養(yǎng)法或RTFQ PCR法檢測(cè)到MTB均可作為臨床確診TBM的標(biāo)準(zhǔn),但由于腦脊液標(biāo)本中MTB荷菌量低,涂片法檢測(cè)的敏感度低、特異度差,不能區(qū)別死菌或活菌,而培養(yǎng)法檢測(cè)雖精確可靠,但所需時(shí)間較長(zhǎng),極易錯(cuò)失最佳的治療時(shí)期[8]。所以,目前TBM的臨床診斷主要依賴于對(duì)患者的臨床表現(xiàn)、腦脊液檢查、影像學(xué)檢查及對(duì)治療效果的綜合判斷[9];但由于近年來(lái)抗生素和糖皮質(zhì)激素的不規(guī)范使用,使一些TBM患者在未得到規(guī)范的抗結(jié)核藥物治療前病情就得到了暫時(shí)的緩解[10],干擾了對(duì)結(jié)核病的診斷。因此,筆者認(rèn)為探索如何在TBM早期診斷中提高早期病原學(xué)診斷效率具有極大意義。

    MGIT 960培養(yǎng)法是近年研制的專門用于MTB快速培養(yǎng)的方法,主要通過(guò)連續(xù)檢測(cè)接種標(biāo)本培養(yǎng)基所顯示的熒光強(qiáng)度變化來(lái)判斷是否有分枝桿菌生長(zhǎng),平均檢出時(shí)間明顯縮短,平均為2~4周,目前已成為臨床上最有效的結(jié)核病病原學(xué)確診方法之一[5],是細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)檢測(cè)的主要發(fā)展方向[11]。本研究中,MGIT 960培養(yǎng)法診斷TBM的敏感度僅為12.79%(22/172),雖遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)涂片法[2.91%(5/172)],但顯然無(wú)法滿足臨床需求。

    PCR技術(shù)是通過(guò)對(duì)基因的選擇性片段進(jìn)行體外高效擴(kuò)增,實(shí)現(xiàn)目的基因的檢測(cè),是目前臨床上廣泛應(yīng)用于結(jié)核病病原學(xué)診斷的分子生物學(xué)技術(shù);而RTFQ PCR法是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上,加入熒光標(biāo)記的探針,把核酸擴(kuò)增、雜交及光譜技術(shù)結(jié)合在一起,從而提高檢測(cè)的敏感度和特異度。目前,RTFQ PCR法已成功用于檢測(cè)痰標(biāo)本和肺泡灌洗液標(biāo)本,特別是含菌量較低的標(biāo)本。已有研究顯示,RTFQ PCR法檢測(cè)腦脊液中的結(jié)核分枝桿菌具有較高的敏感度(68%,95%CI=62%~74%)與特異度(100%)[12],因此本研究選取RTFQ PCR法作為檢測(cè)手段之一,并與LAMP法進(jìn)行對(duì)照研究。

    2000年,Notomi等[13]開發(fā)出一種新的DNA擴(kuò)增技術(shù)-LAMP,之后Nagamine等[14]的研究也表明,通過(guò)設(shè)計(jì)兩條環(huán)形引物可使反應(yīng)速度提升1/2~1/3,其技術(shù)特點(diǎn)為:(1)儀器簡(jiǎn)便:擴(kuò)增反應(yīng)在恒定溫度下就能進(jìn)行,不需要PCR儀和其他檢測(cè)儀器,僅水浴鍋即能完成反應(yīng)。(2)高特異性:針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)段,設(shè)計(jì)4條引物。若有一條引物不匹配,則不能進(jìn)行反應(yīng)。(3)快速、高效擴(kuò)增:整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程在60 min內(nèi)即可完成。(4) 敏感度高:最低檢測(cè)值為1~10拷貝,比PCR最低檢測(cè)值高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。(5)步驟簡(jiǎn)單:所有試劑在反應(yīng)前加入即可,實(shí)現(xiàn)一步法核酸擴(kuò)增。(6)鑒定簡(jiǎn)便:目測(cè)即可判斷是否發(fā)生了反應(yīng)。即使沒有分子生物學(xué)基礎(chǔ)的檢驗(yàn)人員在經(jīng)過(guò)1周培訓(xùn)后也能掌握該技術(shù)[15]。

    目前,LAMP法對(duì)MTB的檢測(cè)主要是針對(duì)MTBC靶基因gyrb和IS6110[16-17],本研究基于IS6110設(shè)計(jì)引物,利用LAMP技術(shù)對(duì)臨床疑診為TBM的患者CFS標(biāo)本進(jìn)行分析,最終發(fā)現(xiàn)LAMP法診斷TBM的敏感度為43.02%,明顯高于涂片法(2.91%)及MGIT 960快速培養(yǎng)法(12.79%),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=75.11,P=0.000;χ2=43.88,P=0.002),且具有較高的特異度(92.86%),證明LAMP法對(duì)于早期診斷TBM可能具有較高的臨床價(jià)值。Nagdev等[18]通過(guò)LAMP法檢測(cè)CFS標(biāo)本,結(jié)果表明LAMP對(duì)TBM的診斷敏感度高達(dá)88.23%,特異度達(dá)80.00%,這是首次運(yùn)用LAMP法檢測(cè)CFS中MTB的研究,但該研究樣本量較小,僅為27例;本研究結(jié)果中LAMP法對(duì)MTB的敏感度(43.02%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于上述國(guó)外同類研究,這可能與我國(guó)是結(jié)核病高發(fā)的發(fā)展中國(guó)家,在臨床診治、流行病學(xué)研究、檢測(cè)技術(shù)條件上與發(fā)達(dá)國(guó)家存在較大差異有關(guān);再則,LAMP技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)CFS診斷 TBM的研究較少,本研究是全球第二次、國(guó)內(nèi)首次,除可查尋文獻(xiàn)外,缺乏可借鑒資料,且操作人員檢測(cè)CFS經(jīng)驗(yàn)也較少,可能存在一定的實(shí)驗(yàn)室誤差。以上原因可能導(dǎo)致了本研究與國(guó)外類似研究結(jié)果的差距。但本研究結(jié)果顯示,LAMP技術(shù)對(duì)TBM診斷具有較MTB涂片法、培養(yǎng)法更高的價(jià)值,與PCR法具有一致的臨床診斷價(jià)值,但成本更低廉,與國(guó)外研究[18]結(jié)論相一致。提示我們對(duì)LAMP技術(shù)有進(jìn)一步深入研究的理由和空間。

    近年來(lái),已經(jīng)出現(xiàn)了LAMP法檢測(cè)MTB技術(shù)的改進(jìn)與創(chuàng)新,如將rimM(16SrRNA蛋白)作為靶目標(biāo)設(shè)計(jì)為L(zhǎng)AMP引物,使檢測(cè)方法的敏感度達(dá)到1 pg/μl基因組DNA[19];將LAMP技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合在一起的方法(如逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合免疫吸附雜交技術(shù))快速檢測(cè)體液標(biāo)本MTB的16SrRNA,該方法可以重復(fù)檢測(cè)單一拷貝[20],Ustar生物技術(shù)有限公司通過(guò)固定在塑料盒內(nèi)的條帶側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物,有效防止了擴(kuò)增產(chǎn)物的泄漏[21]。這些研究將進(jìn)一步有助于提高LAMP技術(shù)的準(zhǔn)確性,有助于提高檢測(cè)的敏感度。

    已有研究表明,LAMP法比PCR法的最低檢測(cè)濃度提高了10倍[22],提示對(duì)于荷菌量更低的標(biāo)本(如菌陰痰標(biāo)本、CFS標(biāo)本等)進(jìn)行LAMP法檢測(cè)可能更具優(yōu)勢(shì)。本研究中,將LAMP技術(shù)與RTFQ PCR法檢測(cè)結(jié)果相比較,兩者敏感度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=2.08,P=0.130),且具有較高的一致性符合率(88.50%),Kappa系數(shù)為0.87。筆者認(rèn)為RTFQ PCR法本身是PCR經(jīng)過(guò)改良的技術(shù),其敏感度較PCR檢測(cè)高,因此RTFQ PCR與LAMP技術(shù)敏感度相似。但RTFQ PCR法的檢測(cè)時(shí)間仍需5~6 h,且需要價(jià)格較為昂貴的設(shè)備;通過(guò)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)曲線圖譜來(lái)判讀結(jié)果,對(duì)操作人員的技術(shù)水平要求較高。而LAMP法具有檢測(cè)時(shí)間更短(1.2 h)、儀器更簡(jiǎn)便、對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)水平要求更低的優(yōu)勢(shì),更適合在發(fā)展中國(guó)家和基層廣泛開展。

    本研究還發(fā)現(xiàn)一個(gè)現(xiàn)象,將LAMP法分別與MGIT 960培養(yǎng)法和RTFQ PCR法作對(duì)比,其敏感度明顯高于MGIT 960培養(yǎng)法(χ2=43.88,P=0.002),但與RTFQ PCR法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.08,P>0.05),且在診斷的一致率方面,LAMP與RTFQ PCR法的一致性符合率(88.50%,Kappa=0.87)也高于與MGIT 960培養(yǎng)法的一致率(71.00%,Kappa=0.73),其原因可能是由于RTFQ PCR法和LAMP法等分子生物學(xué)檢測(cè)法對(duì)活菌或死菌的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,而常規(guī)培養(yǎng)法只有活菌才能培養(yǎng)陽(yáng)性,這也提示臨床醫(yī)生在TBM治療轉(zhuǎn)歸的評(píng)價(jià)方面,LAMP等生物學(xué)檢測(cè)方法可能參考意義不大。

    根據(jù)本研究結(jié)果,在LAMP法檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本中,最終排除TBM的患者有2例,提示本研究存在一定的假陽(yáng)性率,這主要是LAMP技術(shù)反應(yīng)的高敏感性極易使樣品與反應(yīng)體系污染。如:在打開裝反應(yīng)液的管蓋時(shí), 反應(yīng)產(chǎn)物容易形成氣溶膠污染環(huán)境、試劑和實(shí)驗(yàn)器材,從而造成假陽(yáng)性。因此,為了防止假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn),我們?cè)贚AMP 操作的整個(gè)過(guò)程中要謹(jǐn)慎小心, 提高實(shí)驗(yàn)者的操作水平;將配制反應(yīng)液的實(shí)驗(yàn)區(qū)域和加入模板的實(shí)驗(yàn)區(qū)域,以及觀察結(jié)果的實(shí)驗(yàn)區(qū)域分開, 實(shí)行分區(qū)操作,注意防止樣品間的交叉污染,嚴(yán)格控制可能導(dǎo)致污染的機(jī)會(huì)。

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    (本文編輯:孟莉 范永德)

    Exploration of loop-mediated isothermal amplification in early diagnosis of tuberculous meningitis

    SUNWen-wen,XIAOHe-ping.

    ClinicandResearchCenterofTuberculosis,ShanghaiKeyLaboratoryofTuberculosis,ShanghaiPulmonaryHospital,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200433,China

    Correspondingauthor:XIAOHe-ping,Email:xiaoheping_sars@163.com

    Objective To evaluate the LAMP assay for rapidly detection ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) in cerebrospinal fluid (CSF) and diagnose TBM in early stage. Methods The CSF samples were collected from patients who were clinical suspected tubercular meningitis before treatment from January 2014 to December 2015 in Shanghai pulmonary hospital. The CSF samples were tested by acid-fast bacillus (AFB) staining, BACTEC MGIT 960 culture, RTFQ PCR and LAMP. The clinic information and the final clinical diagnosis were recorded. Statistical analysis was done by SPSS 17.0,the sensitivity,specificity, positive predictive value (PPV),negative predictive va-lue (NPV) of the LAMP assay in the diagnosis of TBM were calculated; The sensitivity comparison among the four methods were performed using Chi-squared test,P<0.05 was considered statistically significant. The concordance between AFB, RTFQ PCR, BACTEC MGIT 960 cultureand and LAMP was evaluated byKappatest. Results A total of 200 CSF specimens were evaluated retrospectively using the LAMP assay,172 (86.00%) of them were diagnosed TBM finally. The sensitivity of the four methods (AFB staining, BACTEC MGIT 960 culture, RTFQ PCR and LAMP) were respectively: 2.91% (5/172),12.79% (22/172),43.02% (74/172),34.30% (59/172). The sensitivity of LAMP was significance higher than AFB and BACTEC MGIT 960 culture (χ2=75.11,P=0.000;χ2=43.88,P=0.002);while no significant difference was found compared RTFQ PCR (χ2=2.08,P=0.130). The specificity of LAMP and other there methods for the diagnosis of TBM in this study were 92.86% (26/28) and 100.00%. The concordance of Lamp with BACTEC MGIT 960 culture and RTFQ PCR were 71.00% (142/200) and 88.50% (177/200),theKappavalue were 0.73 and 0.87 respectively. Conclusion LAMP assay has a high sensibility and specificity in patients diagnosed TBM,the performance of LAMP was high consistency with RTFQ PCR and BACTEC MGIT 960 culture; LAMP could be a valuable method in early diagnosis of TBM.

    Tuberculosis, meningeal; Diagnosis; Laboratory techniques and procedures; Nucleic acid amplification techniques; Comparative study

    10.3969/j.issn.1000-6621.2016.12.018

    上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題(20134Y153)

    200433 同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病臨床研究中心 上海市結(jié)核病(肺)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

    肖和平,Email:xiaoheping_sars@163.com

    2016-06-28)

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