一種新型醛酮還原酶的克隆表達、性質研究以及在不對稱合成 (R)-CHBE中的應用

張瑾成，魏　淼，許　琳，嚴　明

(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211800)

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一種新型醛酮還原酶的克隆表達、性質研究以及在不對稱合成 (R)-CHBE中的應用

張瑾成，魏淼，許琳，嚴明

(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211800)

摘要：為開發(fā)催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)制備(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯((R)-CHBE)的新型催化劑，挖掘到了來自白色念珠菌SC5314中的一種NADPH輔酶依賴型醛酮還原酶CAK基因(cak)，并將該基因在大腸桿菌中表達。將重組酶進行純化后，測定其酶學性質，并構建了以葡萄糖為輔底物的雙酶偶聯輔酶再生系統(tǒng)，考察其不對稱轉化制備(R)-CHBE的能力。結果表明：CAK對多種醛酮類化合物有催化活性，其催化COBE的最適反應溫度為40 ℃，最適pH為5。CAK在40 ℃下以及酸性條件中能保持較好的穩(wěn)定性。Mg(2+)、Na+、 K+對酶活有一定的激活作用，而Cu(2+)存在條件下酶會徹底失活。乙酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯對酶活的抑制作用較小。利用雙酶偶聯輔酶再生系統(tǒng)不對稱轉化制備(R)-CHBE。在合適的條件下，轉化600 mmol/L的底物，產率達80.6%，產物對映體過量值(e.e.值)>99%。

關鍵詞：醛酮還原酶；NADPH再生；蛋白純化；酶學性質；(R)-4-氯-3羥基丁酸乙酯

(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯((R)-CHBE)作為一種手性醇，是合成L-肉堿[1]、阿托伐他汀鈣[2]、(-)-大內酰亞胺A[3]、(R)-γ-氨基-β-羥基丁酸(GABOB)[4]、負霉素[5]、(R)-4-氨基-3-羥丁酸[6]等手性藥物的重要中間體，全細胞催化還原4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)制備手性CHBE具有反應條件溫和、操作工藝相對簡單、對環(huán)境污染小等優(yōu)勢，是目前首選的制備方法。早期的研究多采用野生細胞作為催化劑[7-8]，其缺點是產率及光學純度很低，且篩選野生型菌株非常困難。為了克服這些缺點，近年來的研究側重于將能夠不對稱還原COBE的酶在工程菌中過表達用于催化。目前，文獻報道的用于不對稱還原COBE制備(R)-CHBE的酶以醛酮還原酶[9](AKR)、短鏈脫氫酶[10](SDR)、羰基還原酶[11](CAR)為主，然而其中大多數酶在制備(R)-CHBE中仍然不能同時獲得較高的產率和光學純度。He等[12]將一種來自于鮭色鎖擲酵母的羰基還原酶SsCR用于不對稱還原制備(R)-CHBE，其產率和產品的光學純度均達到較高的水平(轉化600 mmol/L COBE，產率為100%，光學純度為大于99%)，但反應需在有機-水兩相并添加輔酶的情況下進行。

酶催化合成手性醇時需要輔酶NAD(P)H提供氫，額外添加會大大提高生產成本。引入另一種酶及輔底物構建雙酶偶聯反應，使NAD(P)+再生為NADPH，可以實現輔酶的循環(huán)，避免輔酶的持續(xù)添加。例如使用葡萄糖脫氫酶和葡萄糖就可以將NADP+再生為NADPH[13]。在全細胞催化中，為實現雙酶耦聯反應，可以將用于不對稱還原COBE的酶與葡萄糖脫氫酶在大腸桿菌中共表達，相比于將兩種酶單獨表達，這種方式的效率通常會更高。

本研究利用基因數據挖掘的手段，發(fā)現一種白色念珠菌來源的醛酮還原酶CAK，將其在大腸桿菌中表達，研究其酶學性質。同時構建雙酶偶聯輔酶再生系統(tǒng)，將其應用于不對稱轉化制備(R)-CHBE中，并對多個催化條件進行優(yōu)化，以期實現經濟高效催化制備(R)-CHBE的目的。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株和試劑

E.coliDH5α、E.coliRosetta、質粒pET-22b(+)及白色念珠菌(CandidaalbicansSC5314)基因組，保藏于筆者所在實驗室。

4-氯乙酰乙酸乙酯，Fluka公司；(R)/(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯標準品，Sigma-Aldrich公司；限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Prime STAR HS DNA 聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司；蛋白質marker，Fermentas公司；質粒抽提試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；抗生素及其余試劑，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基使用LB培養(yǎng)基[14]。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨25、酵母提取物15、 NaCl 10、乳糖3、 葡萄糖2。用于誘導目標蛋白的表達。

1.2方法

1.2.1醛酮還原酶CAK的克隆

根據來自白色念珠菌CandidaalbicansSC5314醛酮還原酶cDNA序列(GenBank:XM_714761)設計引物。上游、下游引物分別引入NdeI及NcoI酶切位點。上游引物為5′- G￣G￣A￣A￣T￣T￣C￣C￣A￣T￣A￣T￣G￣C￣C￣A￣G￣C￣T￣C￣A￣A￣T￣T￣G￣C￣A-3′，下游引物為5′-C￣A￣T￣G￣C￣C￣A￣T￣G￣G￣T￣T￣A￣A￣T￣C￣A￣T￣C￣A￣A￣A￣G￣T￣T￣G￣T￣T￣G￣A-3′(劃線處為酶切位點)以白色念珠菌基因組為模板，通過PCR獲得目的片段cak。cak片段和質粒pET-22b(+)經過NdeI和NcoI 37 ℃雙酶切、連接后轉化大腸桿菌DH5α。在含有氨芐青霉素(100 μg/mL)和氯霉素(34 μg/mL)的抗性平板上挑取陽性克隆后抽提質粒，送交南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.2醛酮還原酶CAK的表達

經測序驗證后，將重組質粒轉化表達宿主E.coliRosetta。接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL )和氯霉素(34 μg/mL)的液體 LB 培養(yǎng)基中，于 37 ℃培養(yǎng),8 h后，將菌液按2%(體積分數)接種量轉接于 50 mL(500 mL三角燒瓶)含氨芐青霉素(100 μg/mL)和氯霉素(34 μg/mL)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)3 h后，轉 30 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結束后，8 000 r/min離心20 min收集菌體。菌體用同體積 pH 7.0的Na3PO4緩沖懸浮后超聲破碎，8 000 r/min低溫離心20 min，收集到的上清液即為粗酶液。

1.2.3蛋白濃度測定及SDS-PAGE分析

蛋白濃度測定采用Bradford法[15]。SDS-PAGE采用分子克隆實驗指南[16]提供的方法，分離膠質量分數為12%，濃縮膠質量分數為5%。粗酶液加入2× Loading Buffer后，95 ℃水浴5 min后上樣，上樣量為10 μL。

1.2.4酶活力測定

酶活力測定體系包括1 mmol/L NADPH、10 mmol/L底物COBE和pH 7.0 Na3PO4緩沖液，加入適當粗酶液啟動反應。于30 ℃下測定波長340 nm處吸光值的下降率。酶活定義:每分鐘內氧化1 μmol NAD(P)H所需要的酶量為一個酶活單位U。其計算見式(1)。

(1)

式中：ΔA為340 nm處吸光值的變化值；ε為消光系數，取值為6 220；Vt為總反應體積(mL)；Vs為酶液體積(mL)；L為光徑，取值為1 cm;t為反應時間(min)。

1.2.5蛋白純化

將粗酶液進行(NH4)2SO4沉淀以除去部分雜蛋白，再使用疏水層析柱進行進一步純化。層析柱首先用pH 7.4、含有1.5 mol/L (NH4)2SO4的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)預平衡。洗脫緩沖液為pH 7.4、20 mmol/L的磷酸鹽，采用0～100%緩沖液梯度洗脫。收集到的活性蛋白經透析、離心處理后，最后得到的上清即為純化后的酶液。

1.2.6酶的底物譜測定

醛酮還原酶CAK的底物譜測定選用的底物主要包括醛類和酮類化合物：乙醛、戊二醛、正丁醛、正戊醛、辛醛、苯甲醛、甘油醛、丙酮醛、檸檬醛、乙酰乙酸乙酯、COBE、丙酮、丁酮、3-戊酮、2,3-戊二酮、2-辛酮、乙酰丙酮、甲基異丁基甲酮。分別將上述物質以10 mmol/L的濃度加入酶活測定體系測定酶活。

1.2.7溫度對酶活及穩(wěn)定性的影響

將純化后的酶液分別在不同溫度的反應條件下測定其酶活力，研究溫度對酶活的影響。將酶液置于20、25、30、35、40、45和50 ℃的水浴中，每隔10 min取樣，分別測定殘余酶活以研究酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.8pH對酶活的影響及酶的pH穩(wěn)定性

使用不同pH的緩沖體系測定酶活，研究pH對酶活的影響，緩沖體系為pH 4.0～5.5醋酸鹽緩沖液、pH=5.5～7.5磷酸鹽緩沖液、pH 7.5～9.0 Tris緩沖液。將酶液分別置于pH=4.0～9.0的緩沖液中，4 ℃保存24 h后測定酶活力，研究酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.9金屬離子對酶活的影響

向純化后的酶液中分別加入1 mmol/L的Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Na+和K+，在4 ℃下孵育1 h后測定酶活，考察金屬離子對酶活的影響。

1.2.10有機溶劑對酶活的影響

向酶活測定體系中加入10%～50%(體積分數)的有機溶劑(乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛酸乙酯、三氯甲烷、鄰苯二甲酸二丁酯、異丙醚)，分別測定酶活，考察金屬離子對酶活的影響。

1.2.11雙酶共表達菌株的構建及表達

將葡萄糖脫氫酶gdh基因片段插入至重組質粒pET-cak中cak片段下游實現雙酶共表達，具體方法：設計引物擴增gdh基因(來自巨大芽胞桿菌)并在gdh片段5′端引入SD-AS序列。上游引物為C￣A￣T￣G￣C￣C￣A￣T￣G￣G￣T￣A￣A￣G￣G￣A￣G￣G￣A￣T￣A￣T￣A￣C￣A￣T￣A￣T￣G￣T￣A￣T￣A￣C￣A￣G￣A￣T￣T￣T￣A￣A￣A￣A￣G(含NcoI酶切位點)，下游引物為A￣T￣A￣A￣G￣A￣A￣T￣G￣C￣G￣G￣C￣C￣G￣C￣T￣T￣A￣C￣T￣A￣G￣C￣C￣T￣C￣T￣T￣C￣C￣T￣G￣C(含NotI酶切位點)經PCR擴增后，將重組質粒pET-cak和片段分別用NcoI和NotI雙酶切，連接并經測序驗證后轉化入大腸桿菌Rosetta中表達。制備粗酶液后用SDS-PAGE檢測。單獨測定粗酶液中2種酶的酶活：GDH酶活測定體系為1 mmol/L NADP+,10 mmol/L底物葡萄糖，pH 7.0 Na3PO4緩沖液，加入適量粗酶液啟動反應。于30 ℃下測定波長340 nm處吸光值的上升率。酶活定義：每分鐘內還原1μmol NADP+所需要的酶量為一個酶活單位U。

1.2.12生物轉化COBE至(R)-CHBE

低溫離心收集發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的含重組質粒pET-cak-gdh的雙酶共表達重組菌，以20 g/L的添加量添加入反應體系中。反應體系包括200～600 mmol/L的底物COBE、800 mmol/L的葡萄糖以及Na3PO4緩沖液。轉化反應在恒溫搖床200 r/min的條件下進行，并定時調節(jié)pH至初始值。

1.2.13底物及產物的氣相檢測方法

COBE與CHBE濃度采用氣相色譜儀(Agilent 7820A)測定。PEG20M毛細管柱(20 m×0.32 mm×0.25 μm)；載氣為N2，分流比1∶ 20；氣化和檢測室的溫度220 ℃，梯度升溫(初始溫度130 ℃，保持3 min；以20 ℃/min程序升溫至135 ℃，保持7 min；再以40 ℃/min程序升溫至150 ℃，保持3 min；再以20 ℃/min程序升溫至160 ℃，保持1 min)；檢測器為FID。COBE和CHBE的出峰時間分別為9.713 min和13.838 min。

產物對映體過量值(e.e.)的測定也同樣使用氣相色譜儀，分析條件：色譜柱CP-Chirasil Dex CB(25 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氮，分流比1∶ 50；進樣室和檢測室溫度250 ℃。(R)-CHBE和(S)-CHBE出峰時間分別為16.813 min和17.413 min。

2結果與討論

2.1基因數據挖掘獲得醛酮還原酶CAK

以目前文獻報道的幾種可用于不對稱還原COBE合成(R)-CHBE的氧化還原酶(ARI、ByueD、gox2036、LEK、CmAR等)的氨基酸序列作為探針，在NCBI數據庫中進行搜索，發(fā)現1種來自白色念珠菌Candidaalbican的假定蛋白，其氨基酸序列與氧化還原酶LEK的氨基酸序列相似度大于50%，據此認為該假定蛋白具有不對稱還原制備(R)-CHBE的潛力。又經BLAST工具搜索，發(fā)現該蛋白的氨基酸序列與多種醛酮還原酶的氨基酸序列具有顯著的相似性(超過40%相似性)，這說明此蛋白屬于醛酮還原酶超家族，將此酶命名為CAK。

2.2醛酮還原酶CAK的克隆、表達及純化

將PCR擴增后的cak基因片段和質粒pET-22b(+)分別雙酶切后進行連接，經測序驗證完全正確。將得到的重組質粒命名為pET-cak。將pET-cak轉化表達宿主大腸桿菌Rosetta，經發(fā)酵培養(yǎng)，超聲破碎菌體得到了粗酶液。文獻報道的醛酮還原酶絕大多數為NADPH輔酶依賴型，本實驗酶活測定也選擇NADPH作為輔酶，使用NADH作為輔酶檢測不到任何活性。經計算，粗酶液比酶活為4.3 U/mg。粗酶液經純化后，用SDS-PAGE分析，結果如圖1所示。由圖1可知，目標蛋白大小與預期一致(約3.3×104)，純化后的酶液比酶活達到9.3 U/mg。

1—重組菌粗酶液; 2—經(NH4)2SO4初步純化;3—經疏水層析純化; 4—標準蛋白質圖1　　　蛋白純化SDS-PAGE電泳圖Fig.1　　　SDS-PAGE analysis of purified CAK

2.3酶的底物譜測定

醛酮還原酶的底物譜主要由醛類和酮類化合物構成，CAK的底物譜測定結果如表1所示。由表1可見，CAK對于醛類的底物譜較寬，對多種醛類有催化活力且活力較高。其對丙酮醛的催化活力最高，

表1　CAK的底物譜測定

酶活達到18.64 U/mg。相比較而言，CAK能夠催化的酮類化合物種類比較少，在所有測定的酮類化合物中，除乙酰乙酸乙酯、COBE、2,3-戊二酮這類帶有α酮基的化合物外，其他酮類均測不到活性。

2.4溫度對酶活的影響結果

考察溫度(20～50 ℃)對CAK酶活的影響，結果如圖2所示。由圖2可知：在40 ℃時，醛酮還原酶CAK的活力達到最高；低于40 ℃時，酶活力受到了抑制；而當溫度超過40 ℃時，雖然較高的溫度可使酶促反應速率加快，但是此時蛋白變性對酶活的抑制作用更加明顯，所以酶活力開始呈現下降趨勢。

圖2　　　溫度對CAK酶活的影響Fig.2　　　Effects of temperature on activity of CAK

2.5CAK的熱穩(wěn)定性

不同的溫度條件下研究CAK的熱穩(wěn)定性，結果見圖3。由圖3可知：其在40 ℃以下能保持較好的穩(wěn)定性；而當在45 ℃條件下保溫0.5 h后，酶活幾乎完全喪失。這表明在超過45 ℃的條件下，酶的空間結構很容易被破壞。Wang等[17]報道了一種Lodderomyceselongisporus來源的用于制備(R)-CHBE的醛酮還原酶，其在40 ℃下保溫0.5 h后僅有20%的殘余酶活，相比較而言，CAK的熱穩(wěn)定性要略高一些。

圖3　　　CAK的溫度穩(wěn)定性曲線Fig.3　　　Thermostability of CAK

2.6pH對酶活的影響

考察不同pH對醛酮還原酶的酶活影響，結果見圖4。由圖4可知：在pH為5時酶活最高，在pH 4～7之間，酶活力保留了最大酶活的70%以上。在堿性條件下，酶活會受到較大程度的抑制。這可能是因為在偏酸性的環(huán)境中，CAK酶分子活性中心的空間構象更有利于與底物的結合，表現出了更高的催化活性。

圖4　　　pH對CAK酶活的影響Fig.4　　　Effects of pH on activity of CAK

2.7CAK的pH穩(wěn)定性

圖5比較了酶在不同pH條件下保存24 h后的殘余酶活。由圖5可知：CAK在酸性條件下較為穩(wěn)定。而當pH大于8時，酶活損失嚴重。其原因可能是在堿性環(huán)境下，OH-濃度的增加，使得酶活性中心的結構更容易發(fā)生不可逆的改變，從而導致其催化活力急劇降低。因此，CAK不宜保存在堿性的緩沖液中。

圖5　　　CAK的pH穩(wěn)定性曲線Fig.5　　　pH stability of CAK

2.8金屬離子對CAK酶活的影響

考察多種金屬離子對CAK酶活的影響，結果見表2。由表2可知：其中Mg2+、Na+、K+對酶活有一定的激活作用，其余金屬離子均對酶活有抑制作用，其中添加Cu2+使酶完全失活。該結果表明，CAK對某些金屬離子尤其是Cu2+較為敏感，少量的Cu2+就可以使酶的空間結構破壞，導致其完全喪失活性，因此，在催化體系中應該避免Cu2+的引入。

表2　金屬離子對酶活的影響

2.9有機溶劑對CAK酶活的影響

催化轉化COBE的反應中，為增加底物的溶解性，降低底物和產物對酶的毒害作用，通常會加入有機溶劑，但有機溶劑本身也可能會抑制酶活性[18]。COBE和CHBE在乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛酸乙酯、三氯甲烷、鄰苯二甲酸二丁酯、異丙醚這幾種有機溶劑中的油水分配系數都較高，表明這些有機溶劑具備用于有機-水雙相催化制備CHBE的潛力。本實驗考察上述有機溶劑及其加入量對酶活的影響，以不加有機溶劑體系的相對酶活為100%，結果見圖6。由圖6可知：所有的有機溶劑均對酶活有抑制作用，其中乙酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯的抑制作用相對較小，當有機相體積分數達到50%，時CAK尚有60%左右的殘余酶活。

圖6　　　有機溶劑對酶活的影響Fig.6　　　Effects of organic solvents on activity of CAK

2.10CAK和GDH的共表達及酶活測定

雙酶共表達重組菌粗酶液經SDS-PAGE鑒定，結果見圖7。由圖7可見，目的條帶明顯，相對分子質量與預期一致，2種酶在大腸桿菌中均得到了良好的可溶性表達。經計算，粗酶液中CAK和GDH的酶活分別為2.5和6.2 U/mg(以1 mg蛋白計)。

1—雙酶共表達粗酶液; 2—細胞破碎液(沉淀); 3—細胞破碎液(全菌); 4—標準蛋白質圖7　　　雙酶共表達蛋白電泳Fig.7　　　SDS-PAGE analysis of co-expressing

2.11底物濃度對輔酶再生系統(tǒng)不對稱催化還原COBE的影響

圖8　　　底物濃度對輔酶再生體系催化　　　合成(R)-CHBE的影響Fig.8　　　Effects of COBE concentration on the　　　synthesis of (R)-CHBE by coenzyme　　　regeneration system

利用醛酮還原酶CAK和葡萄糖脫氫酶共表達的重組大腸桿菌細胞，以及在催化體系中添加的輔底物葡萄糖來實現輔酶再生。反應體系的pH設定為6.0，溫度設定為35 ℃。圖8表示了不同底物濃度下，雙酶共表達重組菌全細胞催化還原COBE的產率隨時間變化的曲線。由圖8可知：在底物濃度為400 mmol/L以下時，經過24 h的催化反應，底物幾乎都能轉化完畢(產率大于99%)。當底物濃度超過500 mmol/L時，反應24 h的產率降低至80%以下，這可能是因為體系中積累了高濃度的產物CHBE，抑制了醛酮還原酶CAK的活性，使反應難以繼續(xù)進行。測定最終產物的對映體過量值(e.e.值)，結果均在99%以上。

2.12反應溫度對輔酶再生系統(tǒng)不對稱催化還原COBE的影響

考察溫度對催化體系的影響，采用較高的初始底物濃度(600 mmol/L)，pH設定為6.0，經24 h反應，測定并計算最終的產率，結果如圖9所示。由圖9可見，30 ℃的溫度條件下產率最高。較高和較低的反應溫度均不利于轉化，這是因為低溫(低于30 ℃)的轉化條件降低了酶促反應速率，必然會使最終產率降低。而較高的溫度則會使酶失活，另外，溫度越高，底物和產物也就越容易發(fā)生水解，這些原因都導致了最終產率的降低。

圖9　　　反應溫度對輔酶再生體系催化　　　合成(R)-CHBE的影響Fig.9　　　Effects of temperature on the synthesis of (R)-　　　CHBE by coenzyme regeneration system

2.13pH對輔酶再生系統(tǒng)不對稱催化還原COBE的影響

考察不同pH的緩沖體系(pH 4～8)用于催化反應,轉化600 mmol/L底物，于30 ℃反應24 h后，測定并計算產率，結果見圖10。由圖10可知：當反應體系的pH為7時可達到最高產率(80.6%)，這與CAK的最適pH(pH為5)有一定出入。這是因為GDH在pH大于7時才能表現出高活性，在酸性條件下其酶活力較低，使得輔酶再生的效率有所下降。

圖10　　　pH對輔酶再生體系催化合成　　　(R)-CHBE的影響Fig.10　　　Effects of pH on the synthesis of (R)-CHBE　　　by coenzyme regeneration system

3結論

從白色念珠菌中克隆了1種具有不對稱還原COBE的醛酮還原酶CAK，并在大腸桿菌中成功表達。對CAK進行純化后，研究其酶學性質：CAK對多種醛酮類化合物有催化活性；其催化COBE的最適反應溫度為40 ℃，最適pH為5；酶在40 ℃以下能保持較好的熱穩(wěn)定性，在弱酸性條件下酶的性質最穩(wěn)定，堿性環(huán)境中酶活損失較大；Mg2+、Na+、 K+的添加對酶有激活作用；多種有機溶劑均對酶活有抑制作用，而乙酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯對CAK的酶活影響相對較小。通過CAK和葡萄糖脫氫酶在大腸桿菌中共表達，構建輔酶再生體系，利用該體系催化不對稱合成(R)-CHBE，在最適的轉化條件下(30 ℃，pH=7)轉化600 mmol/L的底物，產率達80.6%，且產物的e.e.值超過99%，表明這種制備(R)-CHBE的方式具有良好的應用前景。

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(責任編輯荀志金)

Overexpression,characterization of a novel aldo-keto reductase for asymmetric synthesis of (R)-CHBE

ZHANG Jincheng,WEI Miao,XU lin,YAN Ming

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

Abstract：An NADPH-dependent aldo-keto reductase(CAK)gene from Candida albicans SC5314 was discovered for reducing 4-chloroacetoacetate ethyl ester (COBE) to ethyl (R)-4-chloro-3-hydroxybutanoate ((R)-CHBE). The CAK gene was cloned and overexpressed in Escherichia coli Rosetta. The catalytic properties of purified CAK were studied. Furthermore,an enzyme-coupled coenzyme regeneration system with co-substrate glucose was constructed,and its capability of reducing COBE to (R)-CHBE was studied. The results showed that CAK had catalytic activity for a variety of aldehydes and ketones. CAK had a maximum activity at 40 ℃ and pH 5. The enzyme was stable below 40 ℃ and under acidic conditions. Mg(2+),Na+ and K+ could enhance the activity of CAK. When Cu(2+) was added, no enzyme activity was detected. The inhibit effect of ethyl acetate and dibutyl-O-phthalate was relatively light. When the coenzyme regeneration system for conversion reaction was applied,the molar conversion yield reached 80.6% with 600 mmol/L COBE,and the e.e. value was over 99%.

Keywords：aldo-keto reductase; NADPH regeneration;protein purifying; enzyme property;(R)-4-chloro-3-hydroxybutanoic acid ethyl ester

中圖分類號：Q815

文獻標志碼：A

文章編號：1672-3678(2016)02-0033-08

作者簡介：張瑾成(1989—)，男,江蘇無錫人，研究方向：生物催化；嚴明(聯系人)，副教授，E-mail ：yanming@njtech.edu.cn

基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(2011CBA00804)；國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA022101)；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程

收稿日期：2015-03-17

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.007