亞硫酸鈉預(yù)處理對木糖渣木質(zhì)素的去除及纖維素酶水解的影響

姜力鳳，劉　玉，于　光，張躍冬，王海松

(1. 齊魯工業(yè)大學(xué)制漿造紙科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，山東濟(jì)南250353；

2.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，山東青島266101)

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亞硫酸鈉預(yù)處理對木糖渣木質(zhì)素的去除及纖維素酶水解的影響

姜力鳳1,2，劉玉1，于光2，張躍冬2，王海松2

(1. 齊魯工業(yè)大學(xué)制漿造紙科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，山東濟(jì)南250353；

2.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，山東青島266101)

摘要：木糖渣作為一種固體廢物，通常被送往電廠燃燒產(chǎn)熱，未得到充分利用。為了提高木糖渣的附加值，研究了亞硫酸鈉預(yù)處理對玉米芯木糖渣木質(zhì)素脫除率及纖維素酶水解效率的影響。確定最佳反應(yīng)條件：亞硫酸鈉用量12%(對絕干的木糖渣)、pH 7、反應(yīng)溫度160 ℃、保溫時間20 min。在該條件下處理木糖渣，木質(zhì)素脫除率為77.45%，纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到85.17%。預(yù)處理后木糖渣在5 FPU/g底物纖維素酶作用下水解48 h，葡萄糖得率為84.77%，而未經(jīng)處理的木糖渣在20 FPU/g底物纖維素酶作用下水解48 h后得到的葡萄糖得率僅為70.58%。

關(guān)鍵詞：亞硫酸鈉法預(yù)處理；木糖渣；酶水解；葡萄糖得率

我國是世界上的農(nóng)業(yè)大國，玉米產(chǎn)量位居世界第二，每年有超過2 000萬t的玉米芯產(chǎn)生，其中大部分采用稀酸水解法提取玉米芯中的戊糖生產(chǎn)木糖(醇)、低聚木糖或糠醛[1]，但占原料組分60%以上的纖維素和木質(zhì)素部分卻被作為殘渣(木糖渣)送到電廠燒掉，沒有得到充分利用。隨著糠醛、木糖系列產(chǎn)品價格的下滑及國家對環(huán)保問題的日益重視[2]，生產(chǎn)糠醛或木糖產(chǎn)品的企業(yè)面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，所以加大對木糖渣組分的高值化利用研究具有重要意義。

木糖渣的主要成分為纖維素(超過50%)、木質(zhì)素(約20%)及少量半纖維素，所以將主要成分纖維素轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖成為展開利用木糖渣的最廣泛研究[3]。因為木糖渣產(chǎn)量大、纖維素含量高、結(jié)構(gòu)疏松而被認(rèn)為是生產(chǎn)纖維寡糖比較合適的原料[4]。李秋園等[5]使用纖維素酶水解未經(jīng)處理的木糖渣，酶用量30 FPU/g底物水解48 h還原糖，得率可以達(dá)到85%～88%。該方法雖然過程簡單，但因為原料中木質(zhì)素對纖維素的屏蔽及對酶制劑的吸附[6]，纖維素酶的用量很大，所以轉(zhuǎn)化過程并不經(jīng)濟(jì)。岳軍等[7]先使用乙醇處理木糖渣脫除木質(zhì)素后再加入纖維素酶水解，在較低的酶用量下實(shí)現(xiàn)了較高的酶水解轉(zhuǎn)化率，為降低木糖渣水解糖化成本開啟了新思路。但以上都只研究了纖維素的轉(zhuǎn)化而沒有考慮到木質(zhì)素的利用，亞硫酸鹽法預(yù)處理木質(zhì)纖維生物質(zhì)時，不僅可以簡單地獲得作為混凝土減水劑的木質(zhì)素磺酸鹽，還能提高纖維素的轉(zhuǎn)化效率、降低纖維素酶成本、提高原料的利用率、增加企業(yè)收入、促進(jìn)企業(yè)轉(zhuǎn)型升級，最近幾年逐漸引起了人們的關(guān)注[8-11]。

本文中，筆者以固體廢棄物木糖渣為原料，采用亞硫酸鈉法進(jìn)行預(yù)處理，以獲得木質(zhì)素磺酸鈉，同時得到可以被酶利用的底物，以期達(dá)到高效利用玉米芯木糖渣的目的。

1材料與方法

1.1材料與試劑

本研究所用的玉米芯木糖渣來自于山東福田科技集團(tuán)有限公司。酶水解過程所用纖維素酶Celluclast1.5L和β-葡萄糖苷酶Novozyme188均來自Novozymes公司，酶活分別為192 FPU/mL和300 IU/mL。木糖渣的主要成分如表1所示，因為原料取自工廠木糖水洗工段，pH為4.5，含水量高達(dá)38.22%，固體組成部分為灰分4.12%、葡聚糖68.45%及木質(zhì)素29.13%，原料含有少量木糖(實(shí)驗室沒有檢測到)。

1.2玉米芯木糖渣的預(yù)處理

木糖渣的預(yù)處理采用parr4848壓力攪拌反應(yīng)釜進(jìn)行，在液固比為8∶ 1(mL/g)的條件下裝入20 g木糖渣(以絕干質(zhì)量計)，在設(shè)定的亞硫酸鈉用量、反應(yīng)液pH、最高溫度以及保溫時間條件下處理木糖渣。蒸煮結(jié)束后，取出樣品用水洗至中性，用于酶解實(shí)驗和組分測定。

表1　木糖渣的主要成分

1.3預(yù)處理樣品的酶水解

準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于0.4 g絕干質(zhì)量的預(yù)處理后的木糖渣，放入具塞細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入0.05 mol/L的檸檬酸鈉緩沖溶液和0.2 mL疊氮化鈉溶液(0.02 g/mL)控制酶水解質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，然后分別加入相當(dāng)于20 FPU/g底物的纖維素酶和10 IU/g底物的β-葡萄糖苷酶。放入50 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，在95 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩反應(yīng)到設(shè)定的時間后，取上層清液測定碳水化合物含量。

1.4木素含量和碳水化合物的測定

準(zhǔn)確稱取0.3 g絕干樣品于耐壓瓶中，加入3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為72%的H2SO4，將耐壓瓶置于室溫下2 h，期間每隔5 min攪拌1次，已使固體顆粒與H2SO4充分接觸，令原料水解充分。H2SO4水解后，向耐壓瓶中加入84 mL去離子水，將H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)稀釋到4%，混合均勻。將耐壓瓶密封好，放在121 ℃的壓力滅菌鍋中反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，將耐壓瓶冷卻至室溫。取少量上清液，將其用0.45 μm微孔濾膜過濾，將所得到的樣品進(jìn)行液相色譜分析，測得單糖含量。

樣品的木質(zhì)素和碳水化合物含量，參照文獻(xiàn) [12]進(jìn)行測定，其中：

木質(zhì)素脫除率=(1-m(預(yù)處理物料中殘余的木

(1)

酶水解效率=m(預(yù)處理物料酶水解液中得到的葡

(2)

葡萄糖得率=m(初始物料經(jīng)預(yù)處理酶水解后得到

(3)

2結(jié)果與討論

2.1亞硫酸鈉用量對木糖渣組成和酶水解性能的影響

在反應(yīng)溫度170 ℃、反應(yīng)液pH 2.7、保溫時間20 min的條件下，考察亞硫酸鈉用量對木糖渣的纖維素含量、木質(zhì)素脫除率、酶水解效率及葡萄糖得率的影響，結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1　　　亞硫酸鈉用量對纖維素含量及木質(zhì)素脫除率的影響Fig.1　　　Effects of sodium sulfite dosage on cellulose　　　contents and lignin removal rate

圖2　　　亞硫酸鈉用量對酶水解效率及葡萄糖得率的影響Fig.2　　　Effects of sodium sulfite dosage on enzymatic　　　hydrolysis efficiency and glucose yield

從圖1可以看出：隨著亞硫酸鈉用量的增加，纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及木質(zhì)素脫除率均是先略有增加，然后下降。當(dāng)亞硫酸鈉用量為12%時，木質(zhì)素脫除率最高為41.83%，纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到72.05%。當(dāng)亞硫酸鈉用量為14%時，木質(zhì)素脫除率反而略有下降。這可能是過多的亞硫酸鈉降解木質(zhì)素碎片吸附在纖維素表面，反而降低了木質(zhì)素的去除率，對應(yīng)的纖維素含量也出現(xiàn)了降低。所以亞硫鈉用量12%可以實(shí)現(xiàn)木糖渣的較好分離，而處理玉米秸稈時則需18.9%的亞硫酸鈉用量[9]，說明酸水解去除了半纖維素的包裹作用的木糖渣遠(yuǎn)比玉米秸稈更容易處理。

圖2顯示了亞硫酸鈉用量對木糖渣酶水解效率及葡萄糖得率的影響。從圖2可以看出：隨著亞硫酸鈉用量的增加，酶水解效率和葡萄糖得率均呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢，并在亞硫酸鈉用量12%時達(dá)到最高點(diǎn)，這時木糖渣的酶水解效率和葡萄糖得率分別為90.06%和82.27%。這與圖1中木質(zhì)素的脫除趨勢是一致的，過多的亞硫酸鈉用量降解木質(zhì)素碎片吸附到纖維素表面，影響了纖維素的酶水解效率和葡萄糖得率。綜合圖1、圖2亞硫酸鈉用量對木糖渣纖維素含量、木質(zhì)素脫除率、酶水解效率及葡萄糖得率的影響，可以確定12%的亞硫酸鈉為處理木糖渣的最佳用量。

2.2反應(yīng)pH對木糖渣組成和酶水解性能的影響

圖3、圖4為在亞硫酸鈉用量12%、最高溫度170 ℃、保溫時間20 min的條件下，反應(yīng)pH的變化(該實(shí)驗的pH通過加入H2SO4或NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié))對木糖渣的纖維素含量、木質(zhì)素脫除率、酶水解效率及葡萄糖得率的影響。從圖3可以看出：隨著pH的增大，纖維素含量和木質(zhì)素脫除率均先減小后增大，在pH為4時木質(zhì)素脫除率最低為14.49%，此時木糖渣中纖維素含量為66.25%。在pH為7(此時為木糖渣水溶液中加入12%亞硫酸鈉后的pH，無需加入H2SO4或NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié))時木質(zhì)素的脫除率最高達(dá)到77.77%，此時木糖渣中纖維素的含量對應(yīng)也達(dá)到最大值為84.61%。中性亞鈉法即可實(shí)現(xiàn)木糖渣木質(zhì)素的較好脫除，充分說明了木糖渣組分的容易處理，不需額外加入NaOH，降低了成本。

圖3　　　反應(yīng)pH對纖維素含量及木質(zhì)素脫除率的影響Fig.3　　　Effects of reaction pH value on cellulose 　　　contents and lignin removal rate

圖4　　　反應(yīng)pH對酶水解效率及葡萄糖得率的影響Fig.4　　　Effects of reaction pH value on enzymatic　　　hydrolysis efficiency and glucose yield

圖4顯示了反應(yīng)pH對木糖渣酶水解效率及葡萄糖得率的影響。從圖4可以看出，隨著反應(yīng)pH的增加，預(yù)處理木糖渣酶水解效率和葡萄糖得率均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，在pH為7時達(dá)到最大值，分別為94.04%和87.03%。這與木糖渣中纖維素含量的變化趨勢是一致的，說明纖維素的純度(或是木質(zhì)素的含量)直接影響酶水解效率[13]，當(dāng)繼續(xù)提高反應(yīng)pH到8時，纖維素含量下降(圖3)，對應(yīng)酶水解效率和葡萄糖得率降低，所以可以選擇加入亞硫酸鈉后不需調(diào)節(jié)pH(即pH等于7)的處理條件作為木糖渣預(yù)處理反應(yīng)的最佳pH。

2.3預(yù)處理溫度對木糖渣組成和酶水解性能的影響

圖5　　　預(yù)處理溫度對纖維素含量、木質(zhì)素脫除率的影響Fig.5　　　Effects of pretreatment tempreture on cellulose　　　contents and lignin removal rate

圖5、圖6為固定亞硫酸鈉用量12%、pH為7、保溫時間20 min的條件下，反應(yīng)溫度對纖維素含量、木質(zhì)素脫除率、酶水解效率及葡萄糖得率的影響。從圖5可以看出，隨著預(yù)處理溫度的升高，木質(zhì)素脫除率、纖維素含量逐漸升高，160 ℃時趨于平緩。對應(yīng)圖6中木糖渣的酶水解效率和葡萄糖得率也呈現(xiàn)出這樣的趨勢。說明溫度越高越有利于木質(zhì)素的脫除、纖維素的含量也越高，從而提高了木糖渣的酶水解效率和葡萄糖得率。但當(dāng)溫度超過160 ℃時，雖然木糖渣的酶水解效率持續(xù)增加，但葡萄糖得率卻出現(xiàn)了下降。這是因為過高的溫度也促進(jìn)了纖維素的降解，增加了預(yù)處理過程碳水化合物的損失。所以可以選取最高溫度160 ℃為最佳處理溫度。

圖6　　　預(yù)處理溫度對酶水解效率、葡萄糖得率的影響Fig.6　　　Effects of pretreatment tempreture on enzymatic　　　hydrolysis efficiency and glucose yield

2.4保溫時間對木糖渣組成和酶水解性能的影響

在固定亞硫酸鈉用量12%、pH為7、最高溫度160 ℃的條件下，考察了保溫時間對纖維素含量、木質(zhì)素脫除率、酶水解效率及葡萄糖得率的影響，結(jié)果見圖7和圖8。

圖7　　　保溫時間對纖維素含量及木質(zhì)素脫除率的影響Fig.7　　　Effects of holding time on cellulose contents　　　and lignin removal rate

圖8　　　保溫時間對酶水解效率及葡萄糖得率的影響Fig.8　　　Effects of holding time on enzymatic　　　hydrolysis efficiency and glucose yield

從圖7可以看出：隨著保溫時間的延長，木質(zhì)素脫除率逐漸升高，說明延長保溫時間有利于脫除木糖渣中的木質(zhì)素；但反應(yīng)時間超過20 min時，繼續(xù)延長保溫時間，纖維素含量反而降低，說明繼續(xù)延長反應(yīng)時間，纖維素降解趨勢超過了木質(zhì)素的脫除率，所以纖維素含量下降。由圖8可知：酶水解效率和葡萄糖的得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，并在20 min時達(dá)到最大值。這是因為時間少于20 min時反應(yīng)不徹底，木質(zhì)素脫除率較低，酶水解效率不高。當(dāng)時間超過20 min時，纖維素發(fā)生降解反應(yīng)，反而降低了葡萄糖得率。綜合以上幾個方面，確定最佳保溫時間為20 min。

2.5亞硫酸鈉預(yù)處理前后木糖渣的酶水解性能的比較研究

圖9～12分別顯示了木糖渣使用亞硫酸鈉預(yù)處理前后在不同纖維素酶用量、不同水解時間的酶水解效率和葡萄糖得率，可以看出亞硫酸鈉預(yù)處理對木糖渣的酶水解性能變化情況。圖9為未經(jīng)處理的木糖渣在纖維素酶用量從5 FPU/g底物增加到20 FPU/g底物、反應(yīng)時間48 h以內(nèi)的酶水解效率變化情況。從圖9可以看出：隨著反應(yīng)時間的延長，木糖渣的酶水解效率逐漸增加，并且20 FPU/g底物纖維素酶用量的酶水解效率要遠(yuǎn)高于5 FPU/g底物的，在48 h時分別達(dá)到72.02%和61.03%。這是因為原料中的木質(zhì)素會造成對纖維素的包裹作用及對纖維素酶的優(yōu)先吸附[14]，所以即使在較高的纖維素酶用量下，未經(jīng)處理的木糖渣也不能達(dá)到較高的酶水解效率。對應(yīng)圖10中，雖然隨著纖維素用量的增加和反應(yīng)時間的延長，葡萄糖得率均呈現(xiàn)增加趨勢，但因為未經(jīng)處理木糖渣的酶水解效率低，使葡萄糖得率最高只有70.58%，這時纖維素酶用量也為最高的20 FPU/g底物。

圖9　　　原料在不同纖維素酶用量和不同反應(yīng)　　　時間下的酶水解效率Fig.9　　　Enzymatic hydrolysis efficiency of raw　　　material at different cellulose dosage　　　and reaction time

圖10　　　原料在不同纖維素酶用量和不同反應(yīng)　　　時間下的葡萄糖得率Fig.10　　　Glucose yield of raw material at different　　　cellulose dosage and reaction time

圖11　　　亞硫酸鈉預(yù)處理后不同纖維素酶用量和　　　不同反應(yīng)時間下的酶水解效率Fig.11　　　Enzymatic hydrolysis efficiency of sulfite　　　 different cellulose dosage and reaction time

圖12　　　亞硫酸鈉預(yù)處理后不同纖維素酶用量和　　　不同反應(yīng)時間對葡萄糖得率的影響Fig.12　　　Effects of sulfite pretreatment on 　　　glucose yield at different cellulose 　　　dosage and reaction time

圖11和圖12為12%亞硫酸鈉用量、pH為7、最高溫度160 ℃、反應(yīng)時間20 min的最佳反應(yīng)條件下處理后的木糖渣在不同纖維素酶用量和反應(yīng)時間的酶水解效率和葡萄糖得率。從圖11可以看出，脫除了77.45%木質(zhì)素的木糖渣，即使在較少的纖維素酶用量5 FPU/g底物時，反應(yīng)48 h后，酶水解效率高達(dá)92.76%，遠(yuǎn)高于未經(jīng)處理木糖渣在20 FPU/g底物用量的酶水解效率72.02%，說明木糖渣中木質(zhì)素的去除因為打破了木質(zhì)素的屏障作用及減少了對纖維素酶的無效吸附，所以大幅度地提高了聚糖的酶水解效率，降低了纖維素酶的用量[15]。而對應(yīng)的圖12中葡萄糖得率也呈現(xiàn)相同的趨勢，在5 FPU/g底物用量、反應(yīng)48 h的葡萄糖得率達(dá)到了84.77%，比未經(jīng)處理木糖渣纖維素酶用量20 FPU/g底物用量、反應(yīng)48 h的葡萄糖得率70.58%高20.10%。

3結(jié)論

亞硫酸鈉法預(yù)處理木糖渣的最佳反應(yīng)條件：亞硫酸鈉用量12%、反應(yīng)pH 7、反應(yīng)溫度160 ℃、保溫時間20 min。在該條件下處理的木糖渣木質(zhì)素脫除率為77.45%，纖維素含量為85.17%。在纖維素酶用量5 FPU/g底物、β-葡萄糖苷酶10 IU/g底物的用量條件下反應(yīng)48 h，木糖渣的酶水解效率和葡萄糖得率分別為92.76%和84.77%，相比未經(jīng)處理木糖渣纖維素酶用量20 FPU/g底物和β-葡萄糖苷酶10 IU/g底物下，反應(yīng)48 h的酶水解效率72.02%和葡萄糖得率70.58%分別高出28.80%和20.10%。亞硫酸鈉法預(yù)處理木糖渣，不僅能經(jīng)濟(jì)高效地去除原料中的木質(zhì)素，得到較純纖維素，降低纖維素酶用量、提高酶水解效率和葡萄糖得率，而且分離獲得的木質(zhì)素磺酸鹽還可以作為表面活性劑廣泛應(yīng)用于混凝土減水劑和油田緩凝劑等領(lǐng)域，極大提高了木糖渣轉(zhuǎn)化效率和利用率，對于促進(jìn)以玉米芯為原料的木糖廠和糠醛廠的轉(zhuǎn)型升級具有重要意義。

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(責(zé)任編輯管珺)

Effect of corncob residue pretreatment by sodium sulfite on lignin removal and cellulose hydrolysis

JIANG Lifeng1,2,LIU Yu1,YU Guang2,ZHANG Yuedong2,WANG Haisong2

(1. Key Laboratory of Pulp and Paper Science & Technology of Ministry of Education of China,Qilu University of Technology,Jinan,250353,China;2. Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266101,China)

Abstract：Corncob residue (CCR) is often underutilized, as a waste burned at power plants. To valorize CCR, we studied the pretreatment of CCR by sodium sulfite to remove lignin, followed by enzymatic hydrolyzing the cellulose. The optimum reaction conditions were 12% dosage of sodium sulfite (based on the dried weight of CCR) at pH 7 and 160 ℃ for 20 min. After the pretreatment, 77.45% lignin was removed and the cellulose content of CCR was increased to 85.17%. The residue was further hydrolyzed by cellulase (5 FPU/g) for 48 h. Glucose yield was 84.77%, whereas it was 70.58% when hydrolyzed by cellulase (20 FPU/g) without pretreatment by sodium sulfate.

Keywords：sodium sulfite pretreatment;corncob residue;enzymatic hydrolysis;glucose yield

中圖分類號：TQ353

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-3678(2016)02-0058-06

作者簡介：姜力鳳(1989—)，女，山東青島人，研究方向：生物質(zhì)資源化利用；王海松(聯(lián)系人)，研究員，E-mail: wanghs@qibebt.ac.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金(21206184、31370582)；制漿造紙科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室開放基金(KF201404)

收稿日期：2015-07-01

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.011