基于熒光標(biāo)記SSR的CID法快速鑒定福建茶樹(shù)品種

王讓劍，楊軍，孔祥瑞，高香鳳福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹(shù)改良中心福建分中心，福建 福安 355015

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基于熒光標(biāo)記SSR的CID法快速鑒定福建茶樹(shù)品種

王讓劍，楊軍，孔祥瑞，高香鳳
福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹(shù)改良中心福建分中心，福建 福安 355015

摘要：茶樹(shù)品種真實(shí)性鑒定是茶樹(shù)種質(zhì)資源研究的重要組成部分，是茶樹(shù)品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的前提。在茶樹(shù)基因組上按照均勻分布的原則選擇45個(gè)SSR標(biāo)記合成熒光標(biāo)記引物，利用這些標(biāo)記引物對(duì)54個(gè)福建無(wú)性系茶樹(shù)品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，標(biāo)記基因型分型后進(jìn)一步篩選出9個(gè)SSR標(biāo)記核心引物。這批核心引物的多態(tài)性信息含量（Polymorphism information content，PIC）均大于0.5，等位位點(diǎn)數(shù)在3～5之間，基因型數(shù)在5～10之間，屬于高度多態(tài)性引物且方便進(jìn)行基因型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，適宜用來(lái)進(jìn)行無(wú)性系茶樹(shù)品種的真實(shí)性鑒定。利用其中的6個(gè)標(biāo)記核心引物建立了54個(gè)福建無(wú)性系茶樹(shù)品種的品種鑒別圖（Cultivar identification diagram，CID），該CID能直觀地提供對(duì)其中任意品種進(jìn)行鑒定所需要的標(biāo)記引物以及相應(yīng)的標(biāo)記基因型，且能夠方便地進(jìn)行擴(kuò)容以用來(lái)對(duì)更多的無(wú)性系茶樹(shù)品種進(jìn)行真實(shí)性鑒定。利用該方法對(duì)無(wú)性系茶樹(shù)品種進(jìn)行真實(shí)性鑒定，操作方便、快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性高、實(shí)用性強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)所獲得的茶樹(shù)品種鑒定圖（CID）對(duì)茶樹(shù)品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)，以及促進(jìn)茶樹(shù)品種選育工作健康可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

關(guān)鍵詞：茶樹(shù)；SSR；品種鑒別圖（CID）；品種鑒定

茶樹(shù)是我國(guó)山地丘陵地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物，茶產(chǎn)業(yè)也是茶區(qū)農(nóng)民脫貧致富的重要產(chǎn)業(yè)。隨著現(xiàn)代茶產(chǎn)業(yè)的加速發(fā)展與轉(zhuǎn)型升級(jí)，人們?cè)诿麅?yōu)茶開(kāi)發(fā)與制作過(guò)程中愈發(fā)重視茶樹(shù)良種所起到的提質(zhì)增效的基礎(chǔ)性作用。茶樹(shù)是多年生異花授粉自交不親和木本作物，具有常規(guī)育種周期長(zhǎng)（育成一個(gè)茶樹(shù)良種需要20多年），但容易利用枝條扦插進(jìn)行無(wú)性繁殖的特點(diǎn)[1]。該特點(diǎn)意味著一個(gè)茶樹(shù)良種如獲生產(chǎn)認(rèn)可，即可迅速無(wú)性繁殖推廣，茶樹(shù)品種侵權(quán)現(xiàn)象極易發(fā)生。為保護(hù)茶樹(shù)良種知識(shí)產(chǎn)權(quán)和促進(jìn)茶樹(shù)良種選育工作健康可持續(xù)發(fā)展，需要建立一套快速、準(zhǔn)確、科學(xué)、實(shí)用的茶樹(shù)良種真實(shí)性鑒定方法。

隨著現(xiàn)代茶樹(shù)育種工作的蓬勃發(fā)展，越來(lái)越多的茶樹(shù)良種來(lái)源于少數(shù)育種骨干親本，且茶樹(shù)表型性狀易受環(huán)境因子等影響，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)品種鑒定方法已難以有效鑒定眾多的茶樹(shù)良種。DNA指紋圖譜具有準(zhǔn)確鑒定大量茶樹(shù)品種的能力[2-3]，但其本身僅是數(shù)字化的順序組合，提供的鑒定過(guò)程信息相對(duì)較少。品種鑒定圖（Cultivar identification diagram,CID）可將品種鑒定過(guò)程充分的體現(xiàn)出來(lái)并提供所需的標(biāo)記引物以及品種鑒定相應(yīng)的標(biāo)記基因型[4]。該方法的開(kāi)發(fā)很好地解決了DNA標(biāo)記有效應(yīng)用于品種鑒定的問(wèn)題，使DNA標(biāo)記在品種鑒定中的可操作性和實(shí)用性得到充分發(fā)揮，目前燈籠果[5]、蘋果[6]、葡萄[7]等果樹(shù)品種鑒定已有運(yùn)用該技術(shù)的報(bào)道。

茶樹(shù)分子標(biāo)記技術(shù)研究始于上世紀(jì)90年代，迄今為止多種DNA分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于茶樹(shù)種質(zhì)資源領(lǐng)域研究[8-12]。在眾多DNA分子標(biāo)記中，SSR由于具有共顯性、位點(diǎn)豐富、多態(tài)性好、穩(wěn)定性高等諸多優(yōu)點(diǎn)而備受青睞[13-15]。本實(shí)驗(yàn)以54個(gè)福建無(wú)性系茶樹(shù)品種為參試材料，利用熒光標(biāo)記的SSR分子標(biāo)記方法建立茶樹(shù)品種鑒定圖（CID），并對(duì)其可靠性與可操作性加以驗(yàn)證，以期為茶樹(shù)良種的快速鑒定和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供參考。

1 材料和方法

1.1 參試材料

參試無(wú)性系茶樹(shù)品種來(lái)自于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶樹(shù)種質(zhì)資源圃（表1），各品種采集春季新梢一芽二葉，每個(gè)品種獨(dú)立選取2個(gè)單株，保鮮袋封存后置–70℃冰箱中備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測(cè)

采用CTAB法[16]分別提取不同茶樹(shù)品種2個(gè)重復(fù)的基因組DNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA大小和完整性，用756-MC型紫外分光光度計(jì)測(cè)定茶樹(shù)基因組DNA的OD260、OD280值，分析計(jì)算基因組DNA純度和濃度，用1×TE緩沖液稀釋基因組DNA至終濃度為30 ng·μL-1，–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物合成

參考文獻(xiàn)[17]，在茶樹(shù)基因組上按照均勻分布的原則選取45個(gè)SSR標(biāo)記（茶樹(shù)共15個(gè)連鎖群，平均每個(gè)連鎖群選取3個(gè)標(biāo)記），進(jìn)一步合成熒光標(biāo)記SSR引物。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè)與數(shù)據(jù)讀取

反應(yīng)體系：ddH2O 16 μL，10×Buffer 3 μL，dNTP(10 mmol·L-1)3 μL，MgCl22 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1.5 μL，Taq酶1 μL(0.5 U)，模板DNA 2 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入下列溫度循環(huán)：94℃變性1 min，不同溫度條件退火1min，72℃延伸1 min，重復(fù)35個(gè)熱循環(huán)；72℃延伸20 min，最后4℃保存。在96孔板內(nèi)加入1 μL DNA擴(kuò)增樣品與10 μL ROX500分子量標(biāo)準(zhǔn)工作液，震蕩混勻，使用Applied Biosystems 3730xl DNA分析儀檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)合不同標(biāo)記引物的基序堿基個(gè)數(shù)，對(duì)小數(shù)位采取四舍五入，保留整數(shù)位讀取數(shù)據(jù)。

表1　參試無(wú)性系茶樹(shù)品種信息Table 1 The information of tested clonal tea cultivars

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測(cè)與數(shù)據(jù)讀取

反應(yīng)體系：ddH2O 16 μL，10×Buffer 3 μL，dNTP(10 mmol·L-1)3 μL，MgCl22 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1.5 μL，Taq酶1 μL （0.5 U），模板DNA 2 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入下列溫度循環(huán)：94℃變性1 min，不同溫度條件退火1 min，72℃延伸1 min，重復(fù)35個(gè)熱循環(huán)；72℃延伸20 min，最后4℃保存。在96孔板內(nèi)加入1 μL DNA擴(kuò)增樣品與10 μL ROX500分子量標(biāo)準(zhǔn)工作液，震蕩混勻，使用Applied Biosystems 3730xl DNA分析儀檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)合不同標(biāo)記引物的基序堿基個(gè)數(shù)，對(duì)小數(shù)位采取四舍五入，保留整數(shù)位讀取數(shù)據(jù)。

1.2.5 引物篩選

利用PIC-CALC V0.6軟件計(jì)算各引物的多態(tài)性信息含量（Polymorphism information content，PIC），其中，Pi為第i個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率[18]。按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步篩選茶樹(shù)品種真實(shí)性鑒定的SSR核心引物：①PIC≥0.5；②3≤等位位點(diǎn)數(shù)≤5；③5≤基因型數(shù)≤10。

1.2.6 茶樹(shù)CID的建立

按如下方法建立茶樹(shù)CID：如果某個(gè)品種在某個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)上具有與其他品種均不同的基因型出現(xiàn)，那么這個(gè)品種即被鑒定；如果某組品種在某個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)上均具有相同的基因型出現(xiàn)，那么這組品種即被分到同一組；利用不同的標(biāo)記引物繼續(xù)對(duì)同一組品種進(jìn)行鑒定，直至所有品種完全鑒定。

1.2.7 茶樹(shù)CID的驗(yàn)證

隨機(jī)選擇任意參試茶樹(shù)品種驗(yàn)證茶樹(shù)CID的可靠性與可操作性。如果隨機(jī)選擇的品種能被快速準(zhǔn)確地鑒定，則判定建立的茶樹(shù)CID具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2 結(jié)果和分析

2.1 數(shù)據(jù)穩(wěn)定性檢測(cè)

對(duì)不同無(wú)性系品種兩次重復(fù)分別檢測(cè)及讀取數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)在小數(shù)位以及部分個(gè)位上存在一定的差異，但結(jié)合考慮標(biāo)記引物的基序堿基個(gè)數(shù)，并對(duì)小數(shù)位采取四舍五入，保留整數(shù)位進(jìn)行處理后，重復(fù)之間數(shù)據(jù)無(wú)差異，說(shuō)明熒光標(biāo)記SSR檢測(cè)方法重復(fù)之間數(shù)據(jù)穩(wěn)定性高，如表2所示。

2.2 SSR標(biāo)記核心引物篩選

利用45個(gè)熒光標(biāo)記SSR引物對(duì)54個(gè)參試無(wú)性系茶樹(shù)品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步篩選出9個(gè)SSR標(biāo)記核心引物，如表3所示。

表2　紅芽佛手茶樹(shù)品種的檢測(cè)結(jié)果Table 2 the detection results of Hong-Ya-Fo-Shou

2.3 茶樹(shù)CID的建立

首先標(biāo)記核心引物TM351可將參試茶樹(shù)品種分成8種基因型，按照不同大小等位位點(diǎn)的存在以“+”表示。其中第1種基因型為“+238+262”，僅包括13號(hào)品種，這個(gè)品種可被立即鑒定。其余7種基因型均包括2個(gè)以上的茶樹(shù)品種，按基因型不同分成相應(yīng)的7個(gè)組。第1組基因型為“+238”，包括12、25；第2組基因型為“+250”，包括38、49、41；第3組基因型為“+238+250”，包括42、18、26；第4組基因型為“+244+256”，包括31、17、39、23；第5組基因型為“+238+244”，包括19、15、10、11、8、6、21；第6組基因型為“+244”，包括37、48、45、51、47、44、16、35、1、7、5、9、43、22、14、28、36、40、20；第7組基因型為“+244+250”，包括29、3、30、54、24、52、53、34、46、2、50、27、32、4、33。

進(jìn)一步利用其他篩選出來(lái)的標(biāo)記核心引物鑒定以上7個(gè)組的所有品種。其中第1組12、25利用TM581可分成“+222+228”和“+222”兩種基因型，這兩個(gè)品種隨即被鑒定。第2組38、49、41利用TM581可分成“+222+234”、“+222+228”、“+240”3種基因型，這3個(gè)品種亦可被隨即鑒定。另外5組品種利用該方法以及相應(yīng)的標(biāo)記引物可依次鑒定，直至所有品種被鑒定出來(lái)。

由于同一標(biāo)記引物可以對(duì)不同組品種同時(shí)進(jìn)行鑒定，因此該方法可以達(dá)到及時(shí)、充分利用引物的效果，這樣不易出現(xiàn)過(guò)多使用引物的現(xiàn)象，提高了引物利用效率。然后根據(jù)所有引物及相應(yīng)的標(biāo)記基因型信息繪制參試茶樹(shù)CID，如圖1所示。該圖可以提供鑒定任意參試無(wú)性系茶樹(shù)品種所需要的引物以及依據(jù)的標(biāo)記基因型，從而可對(duì)茶樹(shù)品種進(jìn)行快速鑒定。利用茶樹(shù)CID對(duì)單個(gè)品種進(jìn)行鑒定時(shí)，實(shí)際上是利用1組標(biāo)記依次進(jìn)行鑒定，而不僅僅是利用單一標(biāo)記的差異來(lái)鑒定，因此，該方法鑒定結(jié)果相對(duì)單一標(biāo)記而言可靠性更高。

表3　篩選出的用于建立茶樹(shù)品種鑒定圖的核心引物Table 3 Core primer pairs chosen for creating the cultivar identification diagram

2.4 茶樹(shù)CID的驗(yàn)證

茶樹(shù)CID的可靠性和可操作性需要進(jìn)行驗(yàn)證，該驗(yàn)證也是對(duì)如何使用茶樹(shù)CID進(jìn)行品種鑒定的說(shuō)明。對(duì)茶樹(shù)CID中任意品種進(jìn)行鑒定，可以很容易地找到所需要的標(biāo)記引物以及需要參考的標(biāo)記基因型。

隨機(jī)選擇3個(gè)茶樹(shù)品種進(jìn)行驗(yàn)證，如品種1、2、3，從茶樹(shù)CID上看這3個(gè)品種利用標(biāo)記核心引物TM351、TM581和TM442可以完全鑒定開(kāi)來(lái)。首先，利用TM351對(duì)1、2、3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中1出現(xiàn)“+244”基因型（圖2-A），故品種1被鑒定出屬于茶樹(shù)CID 第6組，2、3出現(xiàn)“+244+250”（圖2-B、圖2-C）基因型，故品種2、3被鑒定出屬于茶樹(shù)CID第7組，由于茶樹(shù)CID第6組、第7組分別包括19、15個(gè)品種，所以還需進(jìn)一步鑒定。其次，利用TM581對(duì)1品種進(jìn)行擴(kuò)增，出現(xiàn)“+228+234”基因型（圖3-A），故1被鑒定出屬于第6組的第2亞組，由于該亞組包括3個(gè)品種，所以還需進(jìn)一步鑒定。利用TM581對(duì)2、3品種進(jìn)行擴(kuò)增，這兩個(gè)品種均出現(xiàn)“+228”基因型（圖3-B、圖3-C），故2、3被鑒定出屬于第7組的第2亞組，由于該亞組包括4個(gè)品種，所以還需進(jìn)一步鑒定。最后，利用TM442對(duì)1進(jìn)行擴(kuò)增，出現(xiàn)“+268+292”基因型（圖4-A），由于該基因型僅包括唯一的品種，故品種1的鑒定結(jié)果與茶樹(shù)CID一致，即品種1被鑒定。利用TM442 對(duì)2、3進(jìn)行擴(kuò)增，其中2出現(xiàn)“+286”基因型（圖4-B），3出現(xiàn)“+268+280”基因型（圖4-C），由于這2種基因型均僅包括唯一的品種，故品種2、3的鑒定結(jié)果與茶樹(shù)CID一致，即品種2、3被鑒定。上述鑒定過(guò)程完全符合圖1，這也驗(yàn)證了茶樹(shù)CID技術(shù)用于茶樹(shù)品種真實(shí)性鑒定具有良好的穩(wěn)定性和可操作性。

圖1　參試54個(gè)無(wú)性系茶樹(shù)品種CID示意圖Fig.1 CID schematic diagram of 54 tested clonal tea cultivars

圖2　標(biāo)記引物TM351對(duì)3個(gè)無(wú)性系茶樹(shù)品種鑒定結(jié)果的驗(yàn)證Fig.2 Verification of the identification results of 3 clonal tea cultivars by TM351

圖3　標(biāo)記引物TM581對(duì)3個(gè)無(wú)性系茶樹(shù)品種鑒定結(jié)果的驗(yàn)證Fig.3 Verification of the identification results of 3 clonal tea cultivars by TM581

圖4　標(biāo)記引物TM442對(duì)3個(gè)無(wú)性系茶樹(shù)品種鑒定結(jié)果的驗(yàn)證Fig.4 Verification of the identification results of 3 clonal tea cultivars by TM442

3 討論

3.1 SSR標(biāo)記核心引物的篩選

利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行品種真實(shí)性鑒定時(shí)核心引物的篩選非常重要，本實(shí)驗(yàn)從如下方面確保篩選的SSR引物能夠高效、準(zhǔn)確地應(yīng)用于茶樹(shù)品種真實(shí)性鑒定。首先，在茶樹(shù)15個(gè)連鎖群上按照均勻分布的原則選取45個(gè)SSR標(biāo)記，平均每個(gè)連鎖群3個(gè)SSR標(biāo)記，這樣可以避免篩選的SSR標(biāo)記核心引物過(guò)分集中于少數(shù)連鎖群，從而確保SSR標(biāo)記核心引物具有一定的代表性。其次，篩選的多態(tài)性SSR核心引物的PIC值均大于0.5，說(shuō)明這些核心引物均為高度多態(tài)性引物[19]，這樣能夠利用盡量少的標(biāo)記鑒定盡量多的品種，可以降低鑒定成本和提高鑒定效率。最后，篩選的多態(tài)性SSR核心引物等位位點(diǎn)數(shù)在3～5之間，基因型數(shù)在5～10之間，這2個(gè)參數(shù)均處于一個(gè)比較低的水平，方便進(jìn)行分子標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，既減少了統(tǒng)計(jì)工作量，又減小了因基因型數(shù)據(jù)偏大而產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)誤差的風(fēng)險(xiǎn)。

3.2 熒光標(biāo)記SSR檢測(cè)方法的應(yīng)用

SSR標(biāo)記主要表現(xiàn)為核苷酸重復(fù)基序重復(fù)次數(shù)的變化，多態(tài)性片段長(zhǎng)度的差異可以小到2 bp水平，常規(guī)PAGE膠檢測(cè)方法，不僅要耗費(fèi)大量的人力和時(shí)間進(jìn)行基因型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，而且在大規(guī)模、多批次的數(shù)據(jù)采集和分析方面，存在相當(dāng)大的缺陷，主要體現(xiàn)為差異較小的等位變異難以準(zhǔn)確識(shí)別、不同批次反應(yīng)數(shù)據(jù)難以統(tǒng)一處理等[20]。熒光標(biāo)記電泳檢測(cè)方法通過(guò)與內(nèi)標(biāo)比較，依據(jù)待檢品種目標(biāo)峰的位置，即可直接讀出目標(biāo)DNA片段的準(zhǔn)確大小，精確度可以達(dá)到1 bp水平。該方法還允許多重?zé)晒鈽?biāo)記，可成倍地提高檢測(cè)效率[21]。此外，該檢測(cè)方法不僅同一品種不同重復(fù)之間的結(jié)果非常一致，而且對(duì)不同品種之間的等位變異檢測(cè)也具有良好的吻合性[22]。本實(shí)驗(yàn)2個(gè)重復(fù)間數(shù)據(jù)無(wú)差異，說(shuō)明該方法具有良好的穩(wěn)定性，進(jìn)一步證實(shí)了熒光標(biāo)記SSR檢測(cè)方法準(zhǔn)確性高。

3.3 茶樹(shù)CID的使用及擴(kuò)容

利用茶樹(shù)CID可將茶樹(shù)品種鑒定過(guò)程充分體現(xiàn)出來(lái)。如果需鑒定的品種包含于建立的CID，可以很容易地從CID中快速選出特定的引物及其相應(yīng)的標(biāo)記基因型對(duì)待鑒定的品種進(jìn)行鑒定；如果需要鑒定的品種未包含于建立的CID，亦可直接利用CID圖中的6個(gè)標(biāo)記核心引物對(duì)該品種進(jìn)行單獨(dú)PCR分析，若發(fā)現(xiàn)其具有不同于CID圖中的標(biāo)記基因型出現(xiàn)，則很容易將需要鑒定的茶樹(shù)新品種添加到該CID中去，若發(fā)現(xiàn)與CID圖中的某些品種難以區(qū)分，則繼續(xù)選用新的SSR標(biāo)記引物對(duì)這些無(wú)法分開(kāi)的品種進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)篩選出的未用來(lái)建立參試無(wú)性系茶樹(shù)品種CID的核心引物亦可用來(lái)對(duì)茶樹(shù)CID進(jìn)行擴(kuò)容。此外，對(duì)未包含于茶樹(shù)CID的茶樹(shù)新品種的鑒定是單獨(dú)進(jìn)行的，無(wú)需對(duì)CID圖中的所有品種進(jìn)行重復(fù)鑒定，因此完成新品種鑒定的工作量不是太大。

致謝：本實(shí)驗(yàn)參試材料的采集得到了陳常頌、游小妹、鐘秋生、鄭國(guó)華等先生的支持幫助，謹(jǐn)此一并致謝！

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An Efficient Identification of Tea Cultivars in Fujian with A Strategy of Cultivar Identification Diagram(CID)Based on Fluorescent Labeled SSR Markers

WANG Rangjian,YANG Jun,KONG Xiangrui,GAO Xiangfeng

Tea Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Science/Fujian Branch,National Center for Tea Improvement,Fu′an 355015,China

Abstract:The authenticity identification of tea cultivars is an important part of the research on tea germplasm resources,and the precondition of intellectual property protection of tea cultivars,45 SSR markers were selected to synthesize fluorescent labeled SSR primer pairs based on the principle of uniform distribution in the genome of the tea plant.Using these markers,54 clonal tea cultivars in FUJIAN province were amplified by PCR and 9 SSR markers were selected as the core primer pairs after genotyping.The polymorphism information content(PIC)of the core primer pairs was more than 0.5,and the number of all alleles was varied from 3 to 5,the number of genotypes was varied from 5 to 10.These core primer pairs were suitable for identifying the authenticity of tea cultivars for 54 Fujian clonal tea cultivars due to high polymorphism and convenient to genotype.The cultivar identification diagram(CID)was then established using 6 of these core primer pairs.The CID provided primer pairs and its corresponding genotype,by which any cultivar in the CID could be identified.The capacity of the CID can be expanded so as to facilitatebook=211,ebook=104the authenticity identification of more clonal tea cultivars.The method was considered to be easy,fast,accurate,stable and practical for the authenticity identification of tea cultivars.The CID is important for the protection of intellectual property of tea cultivars,and will be helpful for the healthy and sustainable development of tea breeding.

Keywords:tea plant[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze],SSR,cultivar identification diagram(CID),cultivar identification

作者簡(jiǎn)介：王讓劍，男，助理研究員，主要從事茶樹(shù)種質(zhì)資源與遺傳育種研究，E-mail:rangjian.wang@163.com

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金(2015J01098)、福建省省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2014R1012-6)、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(CXTD-1-1302)、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(LTBB20140102)。

收稿日期：2015-09-09

修訂日期：2015-10-16

中圖分類號(hào)：S571.1；S326

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-369X（2016）02-210-09