P2X7受體對(duì)缺氧誘發(fā)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響

郝旭紅，裴　涌，孫曉楠

?

·實(shí)驗(yàn)論著·

P2X7受體對(duì)缺氧誘發(fā)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響

郝旭紅，裴涌，孫曉楠

Effect of P2X7purinoceptor on hypoxia-induced apoptosis of retinal ganglion cells

Xu-Hong Hao，Yong Pei，Xiao-Nan Sun

Foundation item:Natural Science Foundation of Liaoning(No.2014020184)

Department of Ophthalmology,Shenyang the Fourth Hospital of People, Shenyang 110031, Liaoning Province, China

Correspondence to:Xu-Hong Hao. Department of Ophthalmology, Shenyang the Fourth Hospital of People, Shenyang 110031, Liaoning Province, China.sysyhxh@163.com

Received：2015-11-16Accepted：2016-03-18

Abstract

?AIM: To investigate the effect of P2X7on hypoxia-induced apoptosis of retinal ganglion cells in mice.

?METHODS: According to the different factors, retinal ganglion cells of the mouse were randomly divided into four groups: control group (G1), hypoxia group (G2), hypoxia + agonist (BzATP) group (G3), hypoxia + antagonistic agent (BBG) group (G4). Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was used to detect the survival rate of cells; the rate of cell apoptosis was determined by Annxin V/PI staining flow cytometry; Western Blot analysis was employed to detect the protein expressrion levels of cleave-caspase-3 and cleave-PARP.

?RESULTS: Compared with control group, the results significantly indicated the survival rate of cells decreased and the rate of apoptosis increased treated with hypoxia. In addition, the protein levels of cleave-caspase-3 and cleave-PARP were remarkably higher than the control group. BzATP markedly augmented the apoptosis induced by hypoxia, and BBG pretreatment observably decreased the hypoxia-induced apoptosis.

?CONCLUSION: P2X7purinoceptor could be activated by hypoxia, and participate in the apoptosis of retinal ganglion cells.

KEYWORDS:?P2X7 purinoceptor；hypoxia；retinal ganglion cells；apoptosis

Citation:Hao XH, Pei Y, Sun XN.Effect of P2X7purinoceptor on hypoxia-induced apoptosis of retinal ganglion cells.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(4):622-624

摘要

關(guān)鍵詞：嘌呤受體P2X7；缺氧；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

引用：郝旭紅，裴涌，孫曉楠.P2X7受體對(duì)缺氧誘發(fā)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響.國(guó)際眼科雜志2016;16(4):622-624

0引言

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGC)是位于視網(wǎng)膜最終段的神經(jīng)細(xì)胞，其軸索為視神經(jīng)纖維。缺血、缺氧導(dǎo)致RGC的凋亡，甚至死亡，是許多視網(wǎng)膜和視神經(jīng)疾病發(fā)展到最后的必經(jīng)之路，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈阻塞等，因此研究缺氧誘發(fā)的RGC凋亡機(jī)制有可能找到治療和預(yù)防視網(wǎng)膜和視神經(jīng)疾病新的治療方法，從而避免更多人喪失寶貴的視力。近年來(lái)，嘌呤和嘌呤受體作為重要的信號(hào)分子備受關(guān)注。P2X7屬于核苷酸P2X 受體家族，P2X7受體通道開(kāi)放，可引起胞外信號(hào)的傳導(dǎo)、引起相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和增殖等。研究表明，RGC層中有P2X7受體的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5缺氧模型，觀察并探討嘌呤受體P2X7對(duì)缺氧誘發(fā)RGC凋亡的影響，希望為預(yù)防和治療RGC缺血、缺氧誘發(fā)的細(xì)胞凋亡提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株RGC-5，購(gòu)自ATCC。胎牛血清、DMEM 購(gòu)自Invitrogen公司；BzATP、BBG、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、堿性磷酸酶標(biāo)記的抗小鼠IgG購(gòu)自Sigma公司；cleave-caspase-3、cleave-PARP、β-actin一抗購(gòu)自Santa Cruz公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海貝博生物公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素100U/mL)，在37℃、5% CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株RGC-5，3～4d傳代1次。將細(xì)胞隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組(G1)、缺氧組(G2)、缺氧+激動(dòng)劑(BzATP)組(G3)、缺氧+拮抗劑(BBG)組(G4)；其中缺氧模式為將培養(yǎng)基更換為經(jīng)缺氧處理(預(yù)先用氮?dú)怙柡?無(wú)糖、無(wú)血清培養(yǎng)基，然后放入37℃、95% N2、5% CO2三氣培養(yǎng)箱中6h，之后更換含糖、含血清培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2孵育箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h。G3組在缺氧處理的同時(shí)給予100μmol/L BzATP；G4組先給予100nmol/L BBG預(yù)處理30min后，再給予缺氧處理。

1.2.2 MTT法檢測(cè)各組小鼠RGC細(xì)胞存活率將細(xì)胞以5×103/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后，按上述各分組處理方法處理細(xì)胞后，終止培養(yǎng)，每孔加入MTT 20μL(濃度為5g/L)，繼續(xù)避光培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心棄上清，加入200μL DMSO溶解MTT，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定波長(zhǎng)為490nm處各孔的吸光度。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠RGC細(xì)胞凋亡情況收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，加入試劑盒中結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)500μL懸浮細(xì)胞。加入5μL的Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻，于冰上避光條件孵育15min，然后加入10μL PI染色液后孵育15min，采用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞，結(jié)果使用雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖表示，同時(shí)計(jì)算凋亡細(xì)胞率。

1.2.4 Western Blot檢測(cè)各組小鼠RGC中cleave-PARP和cleave-caspase-3蛋白的表達(dá)細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞，超聲處理，離心，上清液置于-80℃保存?zhèn)溆谩?yīng)用BCA方法測(cè)定蛋白濃度。凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜并采用特異性抗體進(jìn)行Western Blot分析，cleave-PARP和cleave-caspase-3(1∶1000)，β-actin(1∶1000)。二抗：堿性磷酸酶標(biāo)記的抗小鼠IgG(1∶1000)。采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析和計(jì)算蛋白的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參β-actin的平均灰度值的比值表示蛋白水平，進(jìn)行半定量分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用Graphpad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。組間比較采用單因素方差分析。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠RGC細(xì)胞存活率應(yīng)用MTT 法檢測(cè)RGC-5細(xì)胞存活率，各組細(xì)胞存活百分率分別為：G1組(100.00±2.13)%、G2組(57.14±3.07)%、G3組(42.16±2.61)%、G4組(74.56±2.98)%。與G1組相比，G2、G3和G4組的 RGC-5細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)；經(jīng)100μmol/L BzATP與缺氧共同處理RGC-5細(xì)胞后，與G2組相比，細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)；而100nmol/L BBG預(yù)處理細(xì)胞后，與G2組相比，細(xì)胞RGC-5存活率顯著提高(P<0.05，圖1)。

2.2各組小鼠RGC細(xì)胞凋亡情況應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)RGC-5細(xì)胞凋亡率，各組細(xì)胞凋亡率分別為：G1組(12.25±2.50)%、G2組(48.00±4.55)%、G3組(59.05±2.10)%、G4組(37.5±5.20)%。與正常對(duì)照組相比，G2、G3和G4組的 RGC-5細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡(P<0.05)；其中缺氧+激動(dòng)劑組的細(xì)胞凋亡率最高，與缺氧組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；缺氧+拮抗劑組的細(xì)胞凋亡率，與單純?nèi)毖踅M相比，明顯下降(P<0.05)，但仍高于正常對(duì)照組(圖2～3)。

圖1各組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5存活率情況aP<0.05vsG1組；cP<0.05vsG2 組；G1：正常對(duì)照組；G2：缺氧組；G3：缺氧+激動(dòng)劑(BzATP)組；G4：缺氧+拮抗劑(BBG)組。

圖2各組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5凋亡情況G1：正常對(duì)照組；G2：缺氧組；G3：缺氧+激動(dòng)劑(BzATP)組；G4：缺氧+拮抗劑(BBG)組。

圖3各組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5凋亡率aP<0.05vsG1組；cP<0.05vsG2組；G1：正常對(duì)照組；G2：缺氧組；G3：缺氧+激動(dòng)劑(BzATP)組；G4：缺氧+拮抗劑(BBG)組。

2.3各組小鼠RGC中cleave-PARP和cleave-caspase-3蛋白的表達(dá)Western Blot檢測(cè)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)RGC-5細(xì)胞內(nèi)cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)，各組cleaved-PARP/β-actin相對(duì)灰度值分別為：G1組0.20±0.03，G2組0.62±0.03，G3組0.78±0.02，G4組0.46±0.05；各組cleaved-caspase-3/β-actin相對(duì)灰度值分別為：G1組0.21±0.03，G2組0.49±0.04，G3組0.66±0.04，G4組0.36±0.06。與G1組相比，G2、G3和G4組的cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；其中G3組cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)最多，而G4組在P2X7拮抗劑的作用下，使cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)明顯低于G2組(P<0.05)，但仍高于G1組(圖4～6)。

圖4各組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5中cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)G1：正常對(duì)照組；G2：缺氧組；G3：缺氧+激動(dòng)劑(BzATP)組；G4：缺氧+拮抗劑(BBG)組。

圖5各組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5中cleaved-PARP蛋白表達(dá)aP<0.05vsG1組；cP<0.05vsG2組。

圖6各組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5中cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)aP<0.05vsG1組；cP<0.05vsG2組。

3討論

嘌呤受體(purinoceptor，P受體)分為P1和P2兩類。其中P2受體主要由核苷酸激活， 包括P2X 和P2Y兩大家族。P2X 家族屬配體門(mén)控離子通道，包括7種亞型，即P2X1-7。其中P2X7受體與其它P2X受體亞型顯著不同，在低濃度激動(dòng)劑刺激下可以引起非選擇性單價(jià)和多價(jià)陽(yáng)離子通道開(kāi)放，允許K+、Na+、Ca2+等陽(yáng)離子跨膜流動(dòng)，而Ca2+大量?jī)?nèi)流可引發(fā)細(xì)胞的凋亡；在重復(fù)或者長(zhǎng)時(shí)間P2X7激活時(shí)，P2X7受體通道逐漸擴(kuò)大，可增至3nm孔洞，對(duì)各種陽(yáng)離子包括分子質(zhì)量達(dá)900Da 的有機(jī)陽(yáng)離子通透，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[1]，因此P2X7是一種重要的凋亡受體。P2X7受體在體內(nèi)的分布極為廣泛，視網(wǎng)膜內(nèi)、外層神經(jīng)元有多種類型P2X受體表達(dá)，其中P2X7受體主要分布在RGCs層[2-3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)P2X7受體與視網(wǎng)膜的功能密切相關(guān)，例如在玻璃體視網(wǎng)膜病變中，P2X7受體的表達(dá)增加；受體的激活可引起視網(wǎng)膜周細(xì)胞收縮等[4-5]。ATP是P2X7受體的天然激動(dòng)劑，但與P2X7受體親和力比較低。2’-3’-O-(4-benzoylbenzoyl)-ATP(BzATP)是P2X7受體最強(qiáng)的激動(dòng)劑，與P2X7受體的親和力是ATP的10～100倍[6]；P2X7受體拮抗劑包括Brilliant Blue G (BBG)、oxidized ATP (oxATP)、A-438079等，其中BBG在nmol/L濃度水平即選擇性拮抗P2X7受體[7-8]。RGC是視網(wǎng)膜最終端的神經(jīng)元，在視覺(jué)信息的整合和傳遞中至關(guān)重要。缺血、缺氧會(huì)導(dǎo)致RGC損傷、變性和凋亡，最終引起視覺(jué)功能喪失[9-10]，是許多視網(wǎng)膜和視神經(jīng)疾病發(fā)展到最后的必經(jīng)之路，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈阻塞等，因此研究缺氧誘發(fā)的RGC細(xì)胞凋亡機(jī)制有可能找到治療預(yù)防視網(wǎng)膜和視神經(jīng)疾病新的治療方法，從而避免更多人喪失寶貴的視力。基于上述，我們觀察了嘌呤受體P2X7對(duì)缺氧誘發(fā)RGC凋亡中的影響，首先，缺氧處理視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株RGC-5，MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率及Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)，其中caspase-3為caspase家族重要成員，是細(xì)胞凋亡蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，而PARP是caspase-3主要底物，兩者在細(xì)胞凋亡中起到重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，缺氧可以使RGC-5細(xì)胞的存活率明顯降低，凋亡率顯著升高，cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，這些結(jié)果表明，缺氧可以誘發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5發(fā)生凋亡。為了進(jìn)一步檢測(cè)P2X7受體是否參與缺氧導(dǎo)致的RGC-5細(xì)胞凋亡，分別用受體的激動(dòng)劑BzATP和拮抗劑BBG處理細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P2X7受體激動(dòng)劑BzATP能明顯加重缺氧誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)BG預(yù)處理可以顯著拮抗缺氧所致的細(xì)胞凋亡。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明缺氧能激活RGC嘌呤受體P2X7，并參與RGC的凋亡。但P2X7受體通過(guò)何種機(jī)制參與RGC的凋亡尚需進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)深入探討。

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DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.4.08

收稿日期：2015-11-16 修回日期： 2016-03-18

通訊作者：郝旭紅.sysyhxh@163.com

作者簡(jiǎn)介：郝旭紅，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，病房副主任，研究方向：眼底病、青光眼、神經(jīng)眼科。

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金(No.2014020184)
作者單位：(110031)中國(guó)遼寧省沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院眼科

目的：探討嘌呤受體P2X7對(duì)缺氧誘發(fā)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響。

方法：以小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株RGC-5為研究對(duì)象，按照不同處理因素將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組(G1)、缺氧組(G2)、缺氧+激動(dòng)劑(BzATP)組(G3)、缺氧+拮抗劑(BBG)組(G4)；采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞的存活率；用Annxin V/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cleave-caspase-3和cleave-PARP蛋白的表達(dá)。

結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，RGC-5細(xì)胞經(jīng)缺氧處理后，細(xì)胞存活率明顯降低；凋亡率顯著升高；細(xì)胞內(nèi)cleave-caspase-3和cleave-PARP蛋白表達(dá)增加；P2X7受體激動(dòng)劑BzATP能明顯加重缺氧誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)BG預(yù)處理可以顯著拮抗缺氧所致的細(xì)胞凋亡。

結(jié)論：缺氧能激活視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞嘌呤受體P2X7，并參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。