苜蓿根瘤菌的發(fā)酵工藝優(yōu)化

閆洪雪，劉 露，李 麗，趙宏濤，張鵬鵬，梁文輝

（1.青島明月海藻集團有限公司，海藻活性物質(zhì)國家重點實驗室，山東青島 266400；2.青島明月藍海生物科技有限公司，山東青島 266400）

根瘤菌是一類革蘭陰性菌，這類菌廣泛的分布于土壤中并能與豆科植物共生，通過侵染豆科植物根部形成根瘤，固定空氣中的分子氮，可為植物提供充足的氮素營養(yǎng)[1]，還可降低因施用化肥引起的環(huán)境污染。土壤中氮素70%來自生物固氮，而根瘤菌與豆科植物的共生固氮體系所固定的氮量就占到了約總量的65%[2-3]。草產(chǎn)業(yè)在國民經(jīng)濟和農(nóng)牧業(yè)發(fā)展中起基礎(chǔ)性作用[4]，紫花苜蓿是豆科植物，因具有廣泛的適應性和優(yōu)良的生態(tài)效應，品質(zhì)優(yōu)良且產(chǎn)量高，在我國的農(nóng)牧業(yè)中占有重要地位[5-6]。苜蓿根瘤菌這一共生固氮體系的穩(wěn)定高效是栽培苜蓿獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵因素[7]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，科學家對苜蓿根瘤菌的研究越來越深入，從單純的固氮領(lǐng)域延伸至生理、生化、生態(tài)領(lǐng)域，同時也對固氮菌劑、菌肥的開發(fā)利用進行了大量探索[8-9]。本研究對豆科植物根瘤菌的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，不僅能夠降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量，還可減少工業(yè)氮肥施用量，減輕環(huán)境污染[10]，具有重要的經(jīng)濟、生態(tài)效益。

1 材料和方法

1.1 菌種

本研究所用菌種M2為本實驗室自行篩選鑒定得到，液體菌種20%甘油-20℃保存。

1.2 常用儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司，LRH-150B）、超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，SW-CJ-2F）、電熱旋轉(zhuǎn)式恒溫搖床（江蘇太倉市實驗設(shè)備廠，THZ-D）、渦旋振蕩器（澳門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.3 試劑

蔗糖、酵母粉、豆餅粉、甘露醇、氯化鈉、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCO3、NaOH、HCl、pH試紙。

1.4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方

YMA培養(yǎng)基：甘露醇10 g/L，酵母粉0.8 g/L，氯化 鈉 0.1 g/L，KH2PO40.25 g/L，K2HPO40.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCO33.5 g/L。

1.5 最適溫度的選擇

設(shè)置溫度梯度 26，28，30，32，34 ℃。甘油保存的液體菌種于冰盒中融化，取500 μL菌液加入到50 mL YMA液體培養(yǎng)基（滅菌前pH值7.0）中，180 r/min恒溫搖床振蕩培養(yǎng)36 h后，鏡檢無雜菌即進行稀釋涂布計數(shù)。

1.6 最適pH值的選擇

設(shè)置YMA培養(yǎng)基滅菌前pH值梯度6.5，7.0，7.5，8.0，8.5。甘油保存的液體菌種于冰盒中融化，取500 μL菌液加入到50 mL YMA液體培養(yǎng)基中，180 r/min，30℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)36 h后，鏡檢無雜菌即進行稀釋涂布計數(shù)。

1.7 最佳轉(zhuǎn)速的選擇

設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速梯度 140，160，180，200，220 r/min。甘油保存的液體菌種于冰盒中融化，取500 μL菌液加入到50 mL YMA液體培養(yǎng)基（滅菌前pH值7.5）中，30℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)36 h后，鏡檢無雜菌即進行稀釋涂布計數(shù)。

1.8 優(yōu)化培養(yǎng)基

用蔗糖代替YMA培養(yǎng)基中成本較高的甘露醇，添加豆餅粉作氮源，設(shè)置蔗糖和豆餅粉的不同用量及比例，設(shè)6組處理。分別是：（1）蔗糖10 g/L+豆餅粉2 g/L；（2）蔗糖 10 g/L+豆餅粉 4 g/L；（3）蔗糖 16 g/L+豆餅粉 2 g/L；（4）蔗糖 16 g/L+豆餅粉 4 g/L；（5）蔗糖 20 g/L+豆餅粉2 g/L；（6）蔗糖20 g/L+豆餅粉4 g/L。在最適溫度、pH值及最適轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)36 h后計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株在不同培養(yǎng)溫度條件下生長情況

將在不同溫度條件下培養(yǎng)的M2菌株發(fā)酵液培養(yǎng)36 h后取樣鏡檢，稀釋涂布計數(shù)，結(jié)果如圖1。

從圖1中可以看出，該菌的最適培養(yǎng)溫度為30℃，在此溫度條件下菌數(shù)最多。

2.2 菌株在不同pH值條件下生長情況

將不同pH值條件培養(yǎng)的M2菌株發(fā)酵液培養(yǎng)36 h后取樣鏡檢，無雜菌稀釋涂布計數(shù)，結(jié)果如圖2。

從圖2中可以看出，該菌在滅菌前培養(yǎng)基pH值7.5的條件下生長狀況最佳。酸或堿性條件下的菌數(shù)均受到影響。

2.3 菌株在不同培養(yǎng)轉(zhuǎn)速條件下生長情況

前面確定最適pH值和溫度后，設(shè)定不同轉(zhuǎn)速梯度進行試驗，培養(yǎng)36 h后取樣進行稀釋涂布計數(shù)，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，設(shè)定轉(zhuǎn)速180 r/min時，菌生長情況最佳。

2.4 配方優(yōu)化結(jié)果

對6組配方培養(yǎng)的發(fā)酵液進行計數(shù)結(jié)果統(tǒng)計，結(jié)果如圖4所示。

從圖4中可以看出，優(yōu)化后的配方均提高了發(fā)酵液菌數(shù)，其中以處理（5）（蔗糖20 g/L+豆餅粉2 g/L）的配方菌數(shù)最高，可穩(wěn)定在90×108cfu/mL。

3 結(jié)論與討論

本研究通過對苜蓿根瘤菌M2進行溫度、pH值、轉(zhuǎn)速的選擇及發(fā)酵配方的優(yōu)化，得出了該菌培養(yǎng)的最適溫度為30℃，培養(yǎng)基滅菌前的最佳pH值為7.5，發(fā)酵轉(zhuǎn)速最佳設(shè)定為180 r/min，在YMA培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進行優(yōu)化后，最適的培養(yǎng)配方為：蔗糖20 g/L，豆餅粉2 g/L，酵母粉0.8 g/L，氯化鈉 0.1 g/L，KH2PO40.25 g/L，K2HPO40.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCO33.5 g/L。在該條件和配方下，M2的液體發(fā)酵的菌數(shù)可以穩(wěn)定在90×108cfu/mL。相對于甘露醇來說，蔗糖和豆餅粉的成本較低，取材和來源廣泛，利用蔗糖和豆餅粉極大地提高了產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本，為大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。

參考文獻：

［1］沈世華，荊玉祥.中國生物固氮研究現(xiàn)狀和展望［J］.科學通報，2003，48（6）：532-540.

［2］陳丹明，曾昭海，隋新華，等.紫花苜蓿高效共生根瘤菌的篩選［J］.草業(yè)科學，2002，19（6）：27-31.

［3］Zabran H H.Rhizobium-legume symbiosis and nitrogen fixation under severe condition and in arid climate［J］.Microbiol Mol Biol Rev，1999，63：968-989.

［4］馬興祥，劉明春，尹 東.祁連山草原氣候和草地資源開發(fā)利用［J］.草原與草坪，2000（3）：37-39.

［5］周 敏.中國苜蓿栽培史初探［J］.草原與草坪，2004（1）：44-46.

［6］Zhang Y J，Shen Y X.Development potential and planting mode of alfalfa in farming regions of southern China［J］.Grassland&Turf，2010，41：35-143.

［7］史曉霞，師尚禮，楊 晶，等.豆科植物根瘤菌分類研究進展［J］.草原與草坪，2006（1）：12-17.

［8］師尚禮.苜蓿根瘤菌固氮研究進展及淺評［J］.中國草地學報，2005，27（5）：63-68.

［9］師尚禮.紫花苜蓿根瘤菌研究進展［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2005，40（2）：262-267.

［10］寧國贊，李元芳，劉惠琴，等.我國豆科牧草根瘤菌選育及應用研究的進展（1981～1988年）［J］.中國草地學報，1989（3）：68-73.