面神經(jīng)損傷大鼠面神經(jīng)核團(tuán)中NT-4 mRNA 蛋白質(zhì)表達(dá)變化及意義

王　斐　尹浩軍　李　英　周紅星

武警湖北總隊(duì)醫(yī)院內(nèi)二科　武漢　430064

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面神經(jīng)損傷大鼠面神經(jīng)核團(tuán)中NT-4 mRNA 蛋白質(zhì)表達(dá)變化及意義

王斐尹浩軍李英周紅星

武警湖北總隊(duì)醫(yī)院內(nèi)二科武漢430064

【摘要】目的 分析面神經(jīng)損傷大鼠面神經(jīng)核團(tuán)中神經(jīng)營養(yǎng)素-4(NT-4)mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)變化及意義。方法選取50只Wistar大鼠，所有大鼠右側(cè)制造面神經(jīng)骨管內(nèi)擠壓傷模型，左側(cè)作為自身對照。分別于處理后第1天、第7天、第14天、第21天、第28天采用原位雜交及免疫組化檢測大鼠面神經(jīng)核團(tuán)中NT-4 mRNA表達(dá)細(xì)胞數(shù)情況，并采用計(jì)算機(jī)圖像分析測定其灰度，NT-4蛋白表達(dá)樣本進(jìn)行γ計(jì)數(shù)。結(jié)果正常大鼠面神經(jīng)核團(tuán)有較少NT-4表達(dá)。面神經(jīng)損傷大鼠面神經(jīng)核團(tuán)中的NT-4 mRNA含量及NT-4蛋白表達(dá)均明顯升高，高于正常大鼠。面神經(jīng)損傷大鼠面神經(jīng)核團(tuán)中的NT-4 mRNA含量及NT-4蛋白表達(dá)均于受損初期迅速增高，至損傷后14 d達(dá)最高值，隨后逐漸降低。結(jié)論面神經(jīng)損傷可刺激大鼠面神經(jīng)核團(tuán)NT-4 mRNA含量及NT-4蛋白的表達(dá)，其變化趨勢為先迅速上升后逐漸下降，提示NT-4 mRNA含量及NT-4蛋白表達(dá)對面神經(jīng)損傷的恢復(fù)具有重要意義。

【關(guān)鍵詞】面神經(jīng)核團(tuán)；損傷；Wistar大鼠；神經(jīng)營養(yǎng)素-4

面神經(jīng)損傷是臨床上最常見的顱神經(jīng)損傷類型之一，可導(dǎo)致嚴(yán)重的顏面部感覺運(yùn)動功能異常[1]。利用腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子治療和修復(fù)面神經(jīng)損傷是臨床研究的熱點(diǎn)，對面神經(jīng)損傷后相關(guān)營養(yǎng)因子的變化及其表達(dá)具有重要價值[2～3]。本研究利用大鼠建立面神經(jīng)損傷，測定其損傷后不同時段的NT-4 mRNA和蛋白表達(dá)情況，與自身正常側(cè)對比，探討其變化趨勢及病理生理作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料選取成年健康的Wistar大鼠50只由上海義森生物科技有限公司提供，雄性25只，雌性25只，體質(zhì)量200～300 g，大鼠均在相同條件下喂養(yǎng)，飼料均為普通顆粒飼料。所有大鼠實(shí)驗(yàn)分組及模型建立前均檢查面神經(jīng)情況，確認(rèn)大鼠觸須活動和瞬目反射正常后建立模型。實(shí)驗(yàn)試劑：鼠疫組化染色試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，TRlzol試劑由北京明陽科華生物科技有限公司提供，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由杭州主諾生物技術(shù)有限公司提供，兔抗鼠NT-4多克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2方法

1.2.1分組及建立模型：50只大鼠均建立面神經(jīng)損傷模型：采用10%水合氯醛(3 mL/kg)進(jìn)行腹腔注射全麻，操作過程中維持體溫。于大鼠右耳后方作切口，切開皮下組織后暴露面神經(jīng)，根據(jù)面神經(jīng)走行至徑乳孔方向，夾碎面神經(jīng)垂直段與水平段交界處顳骨，封閉傷口，縫合。所有大鼠左側(cè)作為自身對照，麻醉切開與右側(cè)相同，暴露面神經(jīng)后不進(jìn)行碎骨處理，封閉傷口，縫合。利用隨機(jī)數(shù)表法將所有大鼠分為第1天、第7天、第14天、第21天、第28天5個小組，每組10只。各組大鼠建立模型后混合喂養(yǎng)。

1.2.2標(biāo)本處理及染色觀察：①NT-4 mRNA灰度測定采用RT-PCR測定：分別于各小組相應(yīng)時間處死大鼠，進(jìn)行標(biāo)本制備觀察。大鼠處死后剪開原模型建立切口，采集10只大鼠腦干面神經(jīng)核團(tuán)水平標(biāo)本。將標(biāo)本置于-80 ℃冰箱封存。利用玻璃勻漿器將標(biāo)本于液氮中研碎，并加入TRlzol試劑處理，提取總RNA。采用紫外分光光度計(jì)測定濃度后行反轉(zhuǎn)錄處理。PCR擴(kuò)增處理提取的mRNA，并于1.5%～2.0%瓊脂糖電泳池中電泳，暗室照相后對特異性增條帶進(jìn)行光密度掃描，計(jì)算平均灰度[4-5]。②NT-4 mRNA陽性細(xì)胞數(shù)采用組織原位雜交測定：處死與上述相同，獲得標(biāo)本后保存于液氮中，并利用鼠NT-4 mRNA堿基序列為模版，進(jìn)行漂浮法原位雜交，完成后進(jìn)行染色。光鏡500倍視野下觀察mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)目[6]。③面神經(jīng)核團(tuán)NT-4蛋白采用γ計(jì)數(shù)進(jìn)行測定：處死與上述相同，在放大鏡觀察下使用電鉆和絞骨鉗分離大鼠腦干面神經(jīng)核團(tuán)，并保存清潔測試管內(nèi)，對樣本進(jìn)行γ計(jì)數(shù)，測定NT-4陽性細(xì)胞數(shù)[7]。

2結(jié)果

2.1面神經(jīng)損傷后大鼠面神經(jīng)核團(tuán)NT-4 mRNA陽性細(xì)胞數(shù)情況觀察大鼠面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)核團(tuán)NT-4 mRNA陽性細(xì)胞數(shù)。可見大鼠損傷側(cè)的面神經(jīng)NT-4 mRNA陽性細(xì)胞數(shù)呈先上升后下降的趨勢，于第14天達(dá)到高峰。且大鼠損傷側(cè)第7天、第14天、第21天、第28天的面神經(jīng)核團(tuán)NT-4 mRNA陽性細(xì)胞數(shù)均明顯高于正常側(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　面神經(jīng)損傷后大鼠面神經(jīng)核團(tuán)NT-4 mRNA陽性細(xì)胞數(shù)比較　±s，個)

2.2面神經(jīng)損傷后大鼠面神經(jīng)核團(tuán)NT-4 mRNA灰度情況比較觀察大鼠面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)核團(tuán)NT-4 mRNA灰度情況。可見損傷側(cè)的面神經(jīng)核團(tuán)NT-4 mRNA灰度呈先上升后下降的趨勢，于第14天達(dá)到高峰。且大鼠損傷側(cè)第7天、第14天、第21天、第28天的面神經(jīng)核團(tuán)NT-4 mRNA灰度均明顯高于正常側(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3面神經(jīng)損傷后大鼠面神經(jīng)核團(tuán)NT-4蛋白情況比較大鼠損傷側(cè)的面神經(jīng)核團(tuán)NT-4蛋白γ計(jì)數(shù)呈先上升后下降的趨勢，于第14天達(dá)到高峰。且大鼠損傷側(cè)第7天、第14天、第21天、第28天的面神經(jīng)核團(tuán)NT-4蛋白γ計(jì)數(shù)均明顯高于正常側(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表 2　面神經(jīng)損傷后大鼠面神經(jīng)核團(tuán)NT-4 mRNA

表3　面神經(jīng)損傷后大鼠面神經(jīng)核團(tuán)NT-4蛋白γ計(jì)數(shù)情況比較　±s，cpm)

3討論

染色后各組大鼠著色情況比較發(fā)現(xiàn)，正常面神經(jīng)核團(tuán)可觀察到分布較廣泛的藍(lán)紫色信號。通過高倍鏡觀察可見，神經(jīng)元細(xì)胞核周和胞漿有明顯著色，其中核膜著色最明顯，部分神經(jīng)元細(xì)胞胞漿與胞核之間有明顯界限。與相關(guān)研究中可通過免疫組化染色觀察神經(jīng)營養(yǎng)素表達(dá)情況的結(jié)論相符[8-9]。同時觀察到NT-mRNA藍(lán)紫色信號在腹側(cè)核最明顯，且主要為大多角形的神經(jīng)元細(xì)胞，部分周圍膠質(zhì)細(xì)胞染色染色相對較淺。觀察還發(fā)現(xiàn)，在藍(lán)紫色信號區(qū)域可見較明顯棕黃色著色物質(zhì)，高倍鏡觀察可見明顯胞漿著色，且胞核無明顯染色。此為NT-4蛋白，與NT-4 mRNA分布位置基本一致，是重要的神經(jīng)營養(yǎng)素。

在對大鼠損傷后第1天NT-4 mRNA染色觀察中發(fā)現(xiàn)，損傷與未損傷兩側(cè)面神經(jīng)核團(tuán)染色情況比較差異并不明顯，說明在面神經(jīng)損傷初期大鼠的NT-4 mRNA含量情況變化并不明顯。研究[10-11]指出，在面神經(jīng)損傷的最初期，其營養(yǎng)因子的mRNA的變化并不明顯，隨著時間的推移出現(xiàn)代償性增高。在面神經(jīng)損傷第7天進(jìn)行染色觀察，發(fā)現(xiàn)面神經(jīng)損傷側(cè)的神經(jīng)元著色信號明顯增加。損傷側(cè)500倍視野NT-4 mRNA陽性細(xì)胞數(shù)為(39.31±5.42)個，正常側(cè)為(34.21±4.33)個，損傷側(cè)NT-4 mRNA陽性細(xì)胞數(shù)更多，濃度更高。同時，在對蛋白質(zhì)表達(dá)情況的觀察中也發(fā)現(xiàn)，損傷側(cè)NT-4蛋白陽性γ計(jì)數(shù)為(1 192.5±128.1)cpm，明顯高于正常側(cè)的(914.5±128.4)cpm。結(jié)果證明，在面神經(jīng)損傷后第7天，損傷側(cè)的NT-4 mRNA含量及蛋白表達(dá)情況均明顯高于正常側(cè)。

研究顯示，腦神經(jīng)損傷后，多種神經(jīng)營養(yǎng)因子如NT-3和NT-4等均可能出現(xiàn)不同程度的反應(yīng)性增加[12]。尤其是在神經(jīng)損傷部位其分泌和表達(dá)情況最明顯，而作為神經(jīng)修復(fù)重要部位的神經(jīng)核團(tuán)，神經(jīng)營養(yǎng)素的高表達(dá)具有重要意義[13]。面神經(jīng)損傷后的神經(jīng)修復(fù)需要NT-4等大量相關(guān)促神經(jīng)生長因子作用，因此，在面神經(jīng)核團(tuán)處NT-4的高表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)[14]。

隨著損傷時間的不斷推移，本研究中大鼠面神經(jīng)損傷側(cè)的NT-4 mRNA含量呈逐漸升高后下降的趨勢。研究顯示，大鼠面神經(jīng)損傷后，面神經(jīng)核團(tuán)將分泌大量營養(yǎng)因子促進(jìn)其功能恢復(fù)[15]。第14、21、28 d的染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，損傷組大鼠的面神經(jīng)NT-4 mRNA陽性細(xì)胞數(shù)于損傷后先上升，至第14天達(dá)到高峰，而后不斷下降。在這一變化過程中大鼠損傷側(cè)的面神經(jīng)核團(tuán)NT-4 mRNA陽性細(xì)胞數(shù)均明顯高于正常側(cè)。但在損傷后第28天的染色結(jié)果分析中發(fā)現(xiàn)，二者陽性細(xì)胞數(shù)比較并無明顯差異。在對NT-4 mRNA電泳帶灰度情況比較中也得出相同結(jié)論，說明損傷后面神經(jīng)核團(tuán)NT-4 mRNA陽性細(xì)胞數(shù)增加，且NT-4 mRNA的總含量明顯上升，于損傷后28 d方恢復(fù)至正常水平。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)損傷后面神經(jīng)核團(tuán)中，神經(jīng)營養(yǎng)素的表達(dá)的變化趨勢與其mRNA濃度情況變化相一致。

綜上所述，面神經(jīng)損傷后，面神經(jīng)核團(tuán)NT-4 mRNA含量增高，促使NT-4蛋白的表達(dá)。損傷后其變化趨勢為先迅速上升后逐漸下降，NT-4 mRNA含量及NT-4蛋白表達(dá)對面神經(jīng)損傷的恢復(fù)具有重要意義。損傷后可使用外源性神經(jīng)營養(yǎng)素提高恢復(fù)效果，改善癥狀。

4參考文獻(xiàn)

[1]張微，孫運(yùn)花，史慶衛(wèi)，等.電針對面神經(jīng)損傷兔面神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的影響[J].針刺研究，2012，37(4):296-301.

[2]孫運(yùn)花，李瑛，彭曉華等.急性期電針對面神經(jīng)損傷模型兔的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，22(11):2 776-2 777.

[3]張微，孫運(yùn)花，彭曉華等.面神經(jīng)損傷實(shí)驗(yàn)動物模型的自愈性研究[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2012，19(1):49-52.

[4]惠蓮，劉鳳嘯，袁婧，等.FK506對大鼠面神經(jīng)損傷后面運(yùn)動神經(jīng)元凋亡及bcl-2，bax表達(dá)的影響[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，42(7):608-611.

[5]Makwana M.Regulation and function of neuronal GTP-Ras in facial motor nerve regeneration[J].J Neurochem，2009，108(6):1 453-1 463.

[6]張麗麗，王海波，樊兆民，等.不同損傷模式下面神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu)及神經(jīng)營養(yǎng)因子Ⅲ的改變[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2011，25(2):78-81.

[7]Satar B.Protein profiling of anastomosed facial nerve treated with mesenchymal stromal cells[J].Cytotherapy，2012，14(5):522-528.

[8]王卒平，劉啟蒙，況勇，等.人神經(jīng)營養(yǎng)素4治療大鼠坐骨神經(jīng)損傷效果觀察[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(4):20-23.

[9]于動震，張立立，黃永京，等.2周和6周冷水游泳運(yùn)動對大鼠海馬中神經(jīng)營養(yǎng)素家族及其mRNA表達(dá)水平的影響[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2013，28(9):817-821.

[10]白晶，房紹寬，張影，等.實(shí)驗(yàn)性阿爾茨海默模型大鼠海馬內(nèi)病理和PCNAmRNA表達(dá)的變化及rLent/NT4-NAP對其的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15(11):1 807-1 809.

[11]馬昌科，沈憶新.嗅鞘細(xì)胞移植修復(fù)大鼠及人類脊髓損傷的Meta分析[J].中國脊柱脊髓雜志，2013，23(10):905-911.

[12]Kimura H.PACAP facilitate the nerve regeneration factors in the facial nerve injury[J].Regul Pept，2004，123(1-3):135-138.

[13]徐勤業(yè)，屈振宇，蔣紅衛(wèi)，等.應(yīng)用纖維蛋白膠和醫(yī)用OB膠修復(fù)兔面神經(jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2012，28(5):554-557.

[14]王巍，王建平.大鼠面神經(jīng)壓榨損傷對面神經(jīng)核神經(jīng)元p27蛋白表達(dá)的影響[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，40(10):894-896.

[15]魏海剛，邱雅，李蜀光，等.NTN/PGLA導(dǎo)管修復(fù)面神經(jīng)缺損對兔面運(yùn)動神經(jīng)元的保護(hù)作用[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2011，27(1):29-33.

(收稿2015-03-03)

【中圖分類號】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)04-0038-03