鎘脅迫對(duì)青菜幼苗某些生理特性以及基因組多態(tài)性的影響

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（淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省資源植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽淮北235000）

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鎘脅迫對(duì)青菜幼苗某些生理特性以及基因組多態(tài)性的影響

張?jiān)品?，陳楚，陳晨，束良?/p>

（淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省資源植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽淮北235000）

摘要：以青菜品種“蘇州青”為試材，采用生理生化方法和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)，研究了鎘（Cd）脅迫對(duì)青菜幼苗相關(guān)生理特性以及基因組多態(tài)性的影響。結(jié)果表明：不同濃度（1、5、10、20、40 mg·L(-1)）的Cd處理20 d后，青菜幼苗的鮮重、根伸長(zhǎng)受到顯著抑制，葉片的葉綠素以及蛋白質(zhì)含量下降，丙二醛含量和細(xì)胞膜透性增加。選用8條寡核苷酸引物（10 bp）對(duì)青菜幼苗基因組DNA進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，對(duì)照組的RAPD圖譜中可分辨出55條譜帶，Cd脅迫后的RAPD圖譜發(fā)生改變，呈現(xiàn)譜帶的增加、缺失和熒光強(qiáng)度的改變，并且與Cd濃度劑量-效應(yīng)相關(guān)。隨著Cd濃度的增加，幼苗葉片基因組的模板穩(wěn)定性逐步下降，并且RAPD多態(tài)性與青菜幼苗的生理指標(biāo)具有顯著的相關(guān)性。以上結(jié)果表明，利用RAPD技術(shù)獲得的DNA多態(tài)性變化譜帶可作為檢測(cè)Cd對(duì)青菜毒性效應(yīng)的生物標(biāo)記物。

關(guān)鍵詞：青菜；鎘脅迫；生理特性；RAPD；DNA多態(tài)性

張?jiān)品?，陳楚，陳晨，?鎘脅迫對(duì)青菜幼苗某些生理特性以及基因組多態(tài)性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 35（3）：432-439.

ZHANG Yun-fang, CHEN Chu, CHEN Chen, et al. Effects of cadmium stresses on physiological characteristics and genomic DNA polymorphism of Brassica chinensis L. seedlings[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2016, 35（3）: 432-439.

鎘（Cd）是一種相對(duì)稀有的重金屬元素，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛，是電鍍、冶金、塑料以及電子元件等生產(chǎn)的重要原料。隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，工業(yè)“三廢”和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥、化肥的廣泛使用，導(dǎo)致農(nóng)田和水體受Cd污染的情況日益嚴(yán)峻。Cd是環(huán)境中移動(dòng)性和生物毒性最強(qiáng)的重金屬之一[1]，據(jù)全國(guó)第二次污灌普查顯示，Cd污染面積占重金屬污染超標(biāo)土壤面積的59.6%[2]。Cd不僅影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且經(jīng)食物鏈可富集于人體內(nèi)，導(dǎo)致肝、腎器官的功能損傷，誘發(fā)心血管疾病及癌癥[3]。20世紀(jì)60年代日本發(fā)生的“痛痛病”就是典型的慢性Cd中毒事例，國(guó)內(nèi)近年發(fā)現(xiàn)的“鎘米”和“鎘菜”事件，反映出我國(guó)糧食和蔬菜的重金屬安全問題，已引起人們的高度重視。為此，進(jìn)行Cd污染的診斷與治理研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，監(jiān)測(cè)環(huán)境污染脅迫已從宏觀轉(zhuǎn)向微觀，通過分子水平檢測(cè)能快速診斷污染物對(duì)生物體的遺傳毒害。前人研究表明，Cd對(duì)于生物的遺傳毒性主要是造成細(xì)胞DNA的損傷，引起染色體畸變，改變DNA的甲基化水平導(dǎo)致基因的表達(dá)與調(diào)控發(fā)生紊亂等[4-6]。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)可以檢測(cè)整個(gè)基因組的多態(tài)性，反映基因組的特征，已廣泛應(yīng)用于植物的品種分類、分子進(jìn)化以及遺傳圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域[7]。近來RAPD技術(shù)也被用于研究重金屬污染對(duì)植物基因組DNA的遺傳損傷，已有大麥[8]、蠶豆[9]、草莓[10]、菜豆[11]、擬南芥[12-13]及谷子[14]等相關(guān)報(bào)道，均表明RAPD變化譜帶可以作為檢測(cè)重金屬污染毒性的潛在生物標(biāo)記物。

青菜（Brassica chinensis L.）在我國(guó)栽培廣泛，是居民消費(fèi)最多的葉類蔬菜之一，而人類攝入的重金屬可能與葉菜類蔬菜所吸收累積的重金屬有關(guān)[15]。Cd對(duì)青菜幼苗的生長(zhǎng)和生理特性影響已有相關(guān)報(bào)道，水培或盆栽條件下的試驗(yàn)結(jié)果均表明，低濃度Cd處理對(duì)于青菜幼苗的生長(zhǎng)影響不大，而高濃度Cd脅迫會(huì)明顯抑制青菜幼苗的生長(zhǎng)，降低葉片的葉綠素含量及抗氧化能力，加劇細(xì)胞膜脂的過氧化[16-18]。陸文妹[16]研究指出，青菜對(duì)Cd的富集能力較強(qiáng)，低濃度Cd污染下青菜的生長(zhǎng)不受影響，但葉片中Cd含量已超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 2762—2005）中所規(guī)定的最高Cd限值0.2 mg·kg-1。因此，在Cd污染土壤中種植的青菜存在較高的食用風(fēng)險(xiǎn)，而目前缺乏快速評(píng)價(jià)青菜Cd污染的方法。本研究應(yīng)用RAPD技術(shù)和生理生化方法，檢測(cè)和分析了不同濃度的Cd脅迫下青菜幼苗的生理響應(yīng)以及基因組多態(tài)性的變化，并通過RAPD圖譜構(gòu)建污染評(píng)價(jià)體系，從而探討Cd脅迫對(duì)青菜生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中青菜Cd污染的早期預(yù)警和診斷提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

供試青菜（Brassica chinensis L.）品種為“蘇州青”，購自淮北市種子公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1材料的培養(yǎng)及處理

青菜種子用0.5% NaClO消毒20 min，經(jīng)滅菌水反復(fù)沖洗，再放入墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，恒溫培養(yǎng)箱中25℃催芽。選取萌發(fā)一致的種子播種于蛭石：砂=1：1（V/V）的混合基質(zhì)中，智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，晝夜溫度為28℃/22℃，光照/黑暗為12 h/12 h，光強(qiáng)120 μmol·m-2·s-1，先用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌，后用完全Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌。培養(yǎng)到兩葉一心時(shí)，分別用含有0（CK）和1、5、10、20、40 mg·L-1Cd的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌，Cd以CdCl2·2.5H2O形式加入。處理20 d后，取青菜上部完全展開的葉片提取基因組DNA以及測(cè)定相關(guān)的形態(tài)和生理指標(biāo)。

1.2.2青菜幼苗形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定

取不同Cd濃度處理下的青菜幼苗各30株，用直尺測(cè)量幼苗的最大根長(zhǎng)，并稱量幼苗的鮮重。鮮重和根的抑制率按下式計(jì)算：抑制率=（1-x/y）×100%，其中y為對(duì)照組幼苗的平均鮮重或平均根長(zhǎng)，x為各處理組幼苗的平均鮮重或平均根長(zhǎng)。

采用SPSS 13.0軟件中的Duncan氏法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

1.2.3青菜幼苗生理指標(biāo)的測(cè)定

葉綠素含量的測(cè)定采用浸提法[19]；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照Bradford方法[20]；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法[21]；質(zhì)膜透性以相對(duì)電導(dǎo)率表示[22]。所有指標(biāo)數(shù)據(jù)均為三次重復(fù)，采用SPSS 13.0軟件中的Duncan氏法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

1.2.4青菜幼苗基因組DNA的提取與RAPD分析

稱0.2 g青菜葉片，液氮研磨，采用CTAB法提取DNA[23]，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260和A280，并計(jì)算A260/A280，以檢測(cè)DNA的濃度和純度。

10 bp RAPD隨機(jī)引物，Taq DNA聚合酶以及dNTPs購自上海生物工程股份有限公司。PCR反應(yīng)總體積25 μL，體系中含有10×PCR Buffer 2.5 μL，25mmol·L-1MgCl22.5 μL，dNTPs混合物1 μL（4種成分均為2.5 mmol·L-1），5 U·μL-1Taq DNA聚合酶0.2 μL，10 μmol·L-1隨機(jī)引物1 μL，100 ng基因組DNA，加滅菌水至25 μL。RAPD隨機(jī)引物序列如表1所示。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，39℃退火60 s，72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10 min，PCR產(chǎn)物4℃保存待用。RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon-1600，上海天能）拍照保存，后續(xù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析基因組模板的穩(wěn)定性?；蚪M模板穩(wěn)定性（GTS）的計(jì)算：

GTS=（1-A/N）×100%

式中A為處理組幼苗的RAPD多態(tài)性譜帶數(shù)，N為對(duì)照組的總譜帶數(shù)。多態(tài)性譜帶數(shù)指與對(duì)照組相比，處理組新出現(xiàn)的和消失的RAPD譜帶之和[24]。

表1　8條RAPD隨機(jī)引物的堿基序列（5'-3'）Table 1 Sequences of 8 RAPD primers used in experiment（5'-3'）

2　結(jié)果與分析

2.1Cd脅迫對(duì)青菜幼苗根長(zhǎng)以及鮮重的影響

由表2可見，Cd處理抑制了青菜幼苗的生長(zhǎng)，顯著降低了幼苗的鮮重和根長(zhǎng)。隨著Cd處理濃度的增加，Cd對(duì)幼苗鮮重和根長(zhǎng)的抑制率顯著增強(qiáng)（P＜0.05），分別為19.6%～74.9%和14.6%～59.3%。表明幼苗鮮重和根長(zhǎng)的抑制與Cd濃度之間存在劑量效應(yīng)關(guān)系，并且在相同Cd濃度處理下，Cd對(duì)幼苗鮮重的抑制大于根長(zhǎng)，如在40 mg·L-1Cd脅迫下，幼苗鮮重抑制率達(dá)到74.9%，而根長(zhǎng)的抑制率為59.3%。

2.2Cd脅迫對(duì)青菜幼苗葉片葉綠素及可溶性蛋白含量的影響

由圖1和圖2可知，1～40 mg·L-1Cd處理青菜幼苗后，葉片的葉綠素和蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢(shì)，并顯著低于對(duì)照（P＜0.05），葉綠素含量分別比對(duì)照下降25.0%、32.0%、51.9%、72.1%和91.1%，蛋白質(zhì)含量分別比對(duì)照下降17.8%、32.9%、52.1%、64.4%和86.5%。表明葉綠素和蛋白質(zhì)含量下降的幅度與Cd處理濃度之間存在正相關(guān)性。

表2　Cd脅迫對(duì)于青菜幼苗的根長(zhǎng)以及鮮重的影響Table 2 Effects of cadmium stresses on root length and fresh weight of Brassica chinensis seedlings

圖1　Cd脅迫對(duì)青菜幼苗葉片葉綠素含量的影響Figure 1 Effects of cadmium stresses on chlorophyll content of Brassica chinensis seedlings

圖2　Cd脅迫對(duì)青菜幼苗葉片蛋白質(zhì)含量的影響Figure 2 Effects of cadmium stresses on protein content of Brassica chinensis seedlings

2.3Cd脅迫對(duì)青菜幼苗葉片膜透性和丙二醛含量的影響

由圖3和圖4可知，1～40 mg·L-1Cd處理青菜幼苗后，幼苗葉片的膜透性和丙二醛含量呈遞增趨勢(shì)，并且顯著高于對(duì)照（P＜0.05）。葉片的膜透性分別比對(duì)照增加61.8%、158.3%、211.6%、279.1%和344.5%，丙二醛含量分別比對(duì)照增加61.8%、142.0%、247.1%、 332.6%和510.8%。表明膜透性和丙二醛含量的增加幅度與Cd處理濃度正相關(guān)。

2.4Cd脅迫對(duì)青菜幼苗葉片基因組RAPD圖譜的影響

選用的8條10 bp寡核苷酸序列引物均能擴(kuò)增出特異穩(wěn)定的PCR產(chǎn)物。對(duì)照青菜幼苗基因組DNA 的RAPD圖譜可以分辨出55條清晰的譜帶，分子量大小在150～2500 bp之間（圖5）。1～40 mg·L-1Cd處理青菜幼苗后，葉片基因組DNA的RAPD圖譜發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為譜帶的缺失和增加，以及熒光強(qiáng)度的減弱或增強(qiáng)（圖5）。

表3表明，1～40 mg·L-1Cd處理青菜幼苗后，葉片基因組DNA的RAPD圖譜中的多態(tài)性譜帶增加，多態(tài)性值（P/總譜帶數(shù)）分別為16.4%、25.5%、29.1%、30.9%和36.4%，與Cd處理濃度正相關(guān)。圖6表明，1～40 mg·L-1Cd處理青菜幼苗后，葉片基因組模板穩(wěn)定性（GTS）呈下降趨勢(shì)，依次為83.6%、74.5%、70.9%、69.1%和63.6%，與Cd處理濃度負(fù)相關(guān)。

2.5Cd脅迫下青菜幼苗生理指標(biāo)與DNA多態(tài)性的相關(guān)性

圖3　Cd脅迫對(duì)青菜幼苗葉片質(zhì)膜透性的影響Figure 3 Effects of cadmium stresses on leaf membrane permeability of Brassica chinensis seedlings

圖4　Cd脅迫對(duì)青菜幼苗葉片丙二醛含量的影響Figure 4 Effects of cadmium stresses on leaf malondialdehyde content of Brassica chinensis seedlings

圖5　Cd脅迫對(duì)青菜幼苗葉片基因組RAPD圖譜的影響Figure 5 Effects of cadmium stresses on RAPD profiles of genomic DNA from leaves of Brassica chinensis seedlings

圖6　Cd脅迫對(duì)青菜幼苗葉片基因組穩(wěn)定性的影響Figure 6 Effects of cadmium stresses on stability of genome template of Brassica chinensis seedlings

表3　Cd脅迫下青菜幼苗葉片基因組多態(tài)性的變化Table 3 Changes of genomic DNA polymorphism in Brassicachinensis seedlings under Cd stresses

表4表明，1～40 mg·L-1Cd處理青菜幼苗后，葉片的葉綠素含量、蛋白質(zhì)含量與DNA多態(tài)性條帶數(shù)和變化條帶數(shù)間呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01），而丙二醛含量、膜透性與DNA多態(tài)性條帶數(shù)和變化條帶數(shù)間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）。

表4　Cd脅迫下青菜幼苗生理指標(biāo)與DNA多態(tài)性的相關(guān)性Table 4 Correlation between physiological characteristics and DNA polymorphism in Brassica chinensis seedlings under Cd stresses

3　討論

植物遭受Cd毒害后，主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩，葉片卷曲失綠，生物量降低等癥狀[25]，Cd毒害的生理機(jī)制可能是Cd結(jié)合和取代蛋白分子中的自由巰基和金屬輔因子致使蛋白變性或失活[25]，誘發(fā)氧化脅迫反應(yīng)致使細(xì)胞生理代謝紊亂[26-27]，干擾植物對(duì)其他離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)致使?fàn)I養(yǎng)虧缺、離子失衡[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，在1～40 mg·L-1Cd處理20 d后，青菜幼苗的鮮重、根長(zhǎng)、葉綠素以及蛋白質(zhì)含量均逐漸降低，而丙二醛含量和細(xì)胞膜透性逐漸增加，表明Cd濃度越大，對(duì)青菜幼苗的毒害抑制效應(yīng)越強(qiáng)，與前人的研究結(jié)果相似。任安芝等[18]研究表明，溶液培養(yǎng)條件下，Cd濃度超過0.9 mmol·L-1時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Cd毒性急劇增強(qiáng)，致使青菜的膜透性增加，葉綠素含量降低。陸文妹[16]盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，土壤中Cd濃度超過25 mg·kg-1時(shí)，青菜的生長(zhǎng)受到明顯抑制，葉片的抗氧化酶活性降低，脂質(zhì)過氧化損傷加劇。本研究雖然以蛭石和砂石的混合物作為培養(yǎng)基質(zhì)，與溶液培養(yǎng)或土培不同，且在Cd處理的濃度和時(shí)間上也有差異，但研究結(jié)果與前人的相似，均表明Cd對(duì)于青菜的生理毒害呈現(xiàn)濃度-劑量效應(yīng)。這在大麥、蠶豆以及草莓中也有相應(yīng)的研究結(jié)果[8-10]。也有研究表明，Cd濃度對(duì)菜豆幼苗的蛋白質(zhì)含量、擬南芥幼苗的葉綠素和蛋白質(zhì)含量均表現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象[11-12]。這可能是低濃度Cd處理時(shí)，葉片組織的蛋白質(zhì)合成優(yōu)于分解，含量因而上升；高濃度Cd處理時(shí)，葉片組織受到Cd毒害已超過生物體的適應(yīng)能力，蛋白質(zhì)的合成反應(yīng)受到抑制，含量因而下降[12]。不同研究中，Cd處理引起的蛋白質(zhì)、葉綠素含量變化趨勢(shì)不同，可能是與各試驗(yàn)選用Cd處理的濃度、時(shí)間以及植物對(duì)Cd的耐受性有關(guān)。

Cd的遺傳毒性主要是損傷基因組DNA。前人研究表明，Cd與DNA鏈上的堿基相互作用生成8-羥基脫氧鳥苷，引起DNA鏈斷裂[29]，損傷DNA修復(fù)系統(tǒng)[30]，導(dǎo)致DNA損傷和突變，而應(yīng)用RAPD技術(shù)可以有效檢測(cè)DNA損傷和突變的位點(diǎn)[31]。與微核試驗(yàn)、彗星電泳試驗(yàn)等傳統(tǒng)的遺傳毒性檢測(cè)方法相比，RAPD技術(shù)可以檢測(cè)出生物細(xì)胞DNA的臨時(shí)變化，因而更加靈敏[31]。雖然RAPD技術(shù)的重現(xiàn)性、可靠性存在疑問，但通過篩選引物和優(yōu)化PCR反應(yīng)體系能夠克服這些缺點(diǎn)，仍可在短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定可靠的研究結(jié)果[32]。本研究主要采用前期試驗(yàn)篩選出的8條隨機(jī)引物來評(píng)價(jià)Cd污染造成的青菜基因組DNA損傷，結(jié)果表明，Cd脅迫下青菜幼苗的RAPD圖譜發(fā)生了明顯變化，包括RAPD譜帶發(fā)生增加、缺失以及熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)、減弱等，并且RAPD多態(tài)性與Cd濃度之間存在劑量效應(yīng)。這與劉宛等[8]、李慧等[10]、呂金印等[11]在大麥、草莓、菜豆中的研究結(jié)果相似。

Cd脅迫下RAPD圖譜的變化主要是因?yàn)榛蚪MDNA受損后，與引物結(jié)合的模板DNA片段會(huì)發(fā)生缺失、插入、堿基突變或位點(diǎn)序列改變等，導(dǎo)致擴(kuò)增片段的大小、片段數(shù)發(fā)生了改變，RAPD譜帶出現(xiàn)質(zhì)差與量差的現(xiàn)象[32-34]。本文研究中，隨著Cd處理濃度的增高，RAPD圖譜中新增和缺失的條帶逐漸增多（表3）。Cd濃度為1～5 mg·L-1時(shí)，RAPD譜帶中新增、消失的DNA條帶數(shù)比較接近；Cd濃度為10 mg·L-1和40 mg·L-1時(shí)，RAPD譜帶中消失的DNA條帶數(shù)超過新增的DNA條帶數(shù)；當(dāng)Cd濃度為20 mg·L-1，RAPD譜帶中新增的DNA條帶數(shù)卻又超過消失的DNA條帶數(shù)。這可能是Cd處理后青菜葉片基因組的損傷形式較多，導(dǎo)致RAPD條帶新增、消失的變化較為復(fù)雜，不完全相依Cd濃度的變化，其中機(jī)理有待深入研究。同樣，隨著Cd處理濃度的增高，RAPD圖譜中熒光強(qiáng)度發(fā)生改變的條帶數(shù)也逐漸增加。當(dāng)Cd處理濃度為1～20 mg·L-1時(shí)，RAPD譜帶中大多數(shù)條帶的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，主要是因?yàn)镃d處理后青菜DNA序列發(fā)生改變，導(dǎo)致與引物互補(bǔ)結(jié)合的互補(bǔ)位點(diǎn)增多，擴(kuò)增片段由此而增加；而Cd濃度繼續(xù)增加為40 mg·L-1時(shí)，DNA損傷加劇，與引物互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)減少，擴(kuò)增片段由此而減少。Gupta等[35]研究指出，RAPD圖譜的變化趨勢(shì)可以衡量基因組模板DNA的穩(wěn)定性。本文研究表明，Cd脅迫對(duì)青菜幼苗基因組穩(wěn)定性造成了較大影響，隨著Cd濃度的增高，RAPD圖譜中新增和缺失的條帶逐漸增多（表3），基因組穩(wěn)定性逐步下降（圖6），與幼苗的鮮重、根長(zhǎng)、葉綠素以及蛋白質(zhì)含量的變化趨勢(shì)相似，進(jìn)一步的相關(guān)分析表明，RAPD多態(tài)性與青菜幼苗的生理指標(biāo)具有顯著的相關(guān)性（表4）。這說明，利用RAPD技術(shù)所獲得的DNA多態(tài)性變化條帶可以作為檢測(cè)Cd對(duì)植物遺傳毒性效應(yīng)的生物標(biāo)記物。

4　結(jié)論

（1）隨著Cd處理濃度的增加，青菜幼苗的生長(zhǎng)受到抑制，葉片的葉綠素以及蛋白質(zhì)含量下降，丙二醛含量和細(xì)胞膜透性增加。

（2）以篩選的8條引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，獲得多態(tài)性條帶，其中對(duì)照青菜的葉片基因組DNA共獲得55條RAPD譜帶。Cd脅迫后的RAPD圖譜發(fā)生改變，呈現(xiàn)出譜帶的增加、缺失和熒光強(qiáng)度的改變，并且與Cd濃度劑量-效應(yīng)相關(guān)，葉片基因組的模板穩(wěn)定性隨著Cd濃度的增加逐步下降。RAPD多態(tài)性與青菜幼苗的生理指標(biāo)具有顯著的相關(guān)性。

（3）RAPD譜帶可以作為監(jiān)測(cè)青菜生長(zhǎng)遭受重金屬污染傷害的生物標(biāo)記物，結(jié)合生理生化指標(biāo)可以為青菜品種的Cd污染毒性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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Effects of cadmium stresses on physiological characteristics and genomic DNA polymorphism of Brassica chinensis L. seedlings

ZHANG Yun-fang, CHEN Chu, CHEN Chen, SHU Liang-zuo
（School of Life Sciences, Huaibei Normal University, Anhui Key Laboratory of Resources and Plant Biology, Huaibei 235000, China）

Abstract：Cadmium（Cd）is a toxic trace pollutant that can easily be taken up by vegetable crops. The effects of Cd stresses on some physiological characteristics and genomic DNA polymorphism in Brassica chinensis cultivar "Suzhouqing" seedlings were studied by random amplified polymorphic DNA（RAPD）technique and physiological tests. Results showed that treating plants with 1, 5, 10, 20 and 40 mg·L(-1)Cd for 20 days inhibited fresh weight and root elongation of seedlings, decreased chlorophyll content and total soluble protein content, but increased malondialdehyde content and electrolyte leakage. Using 8 oligonucleotide primers（10 bp）to amplify the genomic DNA of the seedlings by polymerase chain reaction, 55 clear RAPD bands were detected in normal seedlings. Compared with the control, the RAPD profiles of Cd-exposed seedlings showed new bands, lost normal bands, altered band intensities. In addition, DNA polymorphism was dosedependent. The genomic DNA template stability decreased with increasing Cd concentrations, and the genomic DNA polymorphism of Brassica chinensis was positively correlated with some physiological characteristics under Cd stresses. In conclusion, the DNA polymorphisms detected by RAPD technique could be used as a biomarker for detecting the genotoxic effects of Cd on Brassica chinensis.

Keywords：Brassica chinensis; Cd stress; physiological characteristics; RAPD ; DNA polymorphism

作者簡(jiǎn)介：張?jiān)品迹?977—），女，講師，主要從事遺傳毒理學(xué)研究。E-mail: chuyun2001@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31572202）；安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2011Z335）；淮北師范大學(xué)青年科研項(xiàng)目（700569）；安徽省省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410373051）

收稿日期：2015-10-13

中圖分類號(hào)：X503.231

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-2043（2016）03-0432-08

doi:10.11654/jaes.2016.03.004