棉花枯萎病菌培養(yǎng)條件的研究

劉冬梅

摘 要：以棉花枯萎菌為試驗(yàn)材料，研究不同溫度、pH值對枯萎菌菌落生長速度和菌絲生長狀態(tài)的影響，目的在于進(jìn)一步了解枯萎菌的極限生長條件，以期明確棉花枯萎病菌生理生態(tài)特性，為棉花枯萎病的檢疫檢測和綜合治理提供依據(jù)。結(jié)果表明，供試菌株的最適生長溫度為28 ℃，最高極限生長溫度為35 ℃，最低極限生長溫度為10 ℃。在25～28 ℃范圍內(nèi)菌落生長速度無明顯變化，但生長狀態(tài)有變化。溫度為34 ℃時(shí)，生長受到明顯抑制。供試菌株生長的最適pH值為7～12，最高極限生長pH值為13，最低極限生長pH值為4。

關(guān)鍵詞：棉花；枯萎菌；培養(yǎng)條件；溫度；pH

中圖分類號：S562 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.04.026

Abstract： In order to study the effects of different temperature and pH on the rate of mycelium growth and conidia production， Anyang Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectumusing was used as experimental material.The purpose is to shed light on the utmost limit of growth condition of Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum， make clear the physiological and ecological properties of it and provide foundations for quarantine detection and comprehensive treatment. The results showed that the range of temperature was from 10 ℃ to 35 ℃ for the mycelium growth of Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum， and the optimum temperature was 28 ℃.There was not a distinct variations on the rate of mycelium growth at the range from 25 ℃ to 28 ℃，but growth state had some variations. Growth was inhibited obviously at the temperature of 34 ℃， pH was from 4 to 13，with the optimum being 7 to 12.

Key words： cotton；Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum；culture condition；temperature；pH

棉花枯萎病是重要土傳病害，由尖孢鐮刀菌（Fusarium owysporum f.sp. vasinfecturn）引起 [1-3]。棉花枯萎病是世界性病害，給棉花生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[4]。棉花枯萎病菌是植物病害中系統(tǒng)浸染、土壤傳播、抗逆性強(qiáng)、致病性變異較大的病原菌之一，極難防治 [5]。

目前，我國各大棉區(qū)已普遍發(fā)生。棉花枯萎病從子葉期開始就可發(fā)病，病株矮小，蕾鈴脫落率高，單株結(jié)鈴數(shù)下降，鈴質(zhì)量減輕，棉纖維強(qiáng)度下降，從而影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)[6]。病害嚴(yán)重的1～2片真葉時(shí)即可造成死苗，花蕾期發(fā)病高峰時(shí)可成片死苗。

目前，關(guān)于棉花黃萎病的研究很多，而枯萎病的研究很少。雖然棉花枯萎病和黃萎病的病原不同，但都作用于植株的維管束，侵染過程類似。所以人們往往從黃萎的角度來理解枯萎，而棉花枯萎病和黃萎病之間存在很多差異。棉花枯萎病菌可在土壤中或棉株殘?bào)w上進(jìn)行腐生生活，又可在棉株內(nèi)進(jìn)行寄生生活。既能隨運(yùn)輸工具遠(yuǎn)距離傳播，又能隨作業(yè)、流水近距離擴(kuò)散，造成病菌在土壤中不斷擴(kuò)散和積累，加重發(fā)病率和危害程度。病菌可在土壤中存活6～7年，厚垣孢子存活甚至長達(dá)15年。病菌由棉苗根尖侵入棉株，在導(dǎo)管中大量繁殖的菌絲及棉株受病菌刺激產(chǎn)生的物質(zhì)，阻礙水分運(yùn)輸；小型孢子隨棉株體液向上擴(kuò)散至全株，破壞棉株細(xì)胞，影響棉株生長發(fā)育。

關(guān)于棉花枯萎菌的生物學(xué)特性已有一些研究。本試驗(yàn)?zāi)康脑谟谶M(jìn)一步了解枯萎菌的極限生長條件，以期明確棉花枯萎病菌生理生態(tài)特性，為棉花枯萎病的檢疫檢測和綜合治理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 由中國農(nóng)科院棉花研究所植保室（植物與微生物互作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）保存。

1.1.2 主要儀器 電子天平，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋，酸度儀，721型分光光度計(jì)等。

1.2 方 法

1.2.1 查氏（Gzapek）培養(yǎng)基的配制 查氏培養(yǎng)基（Gzapek）的配制參照錢寸柔（1999）等[7]。

1.2.2 極限溫度摸索方法 將固體培養(yǎng)基在121 ℃、1.1 kg·cm-2 的壓力下高溫高壓滅菌20 min。然后將滅菌后的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿約20 mL。供試菌株在Gzapek平板上28 ℃恒溫培養(yǎng)6 d，用打孔器和接種針沿菌落邊緣取直徑為1 cm的菌絲塊分別移植于Gzapek平板中央，即一點(diǎn)法[8]，置于4，18，25，28，32，34，35，36 ℃下培養(yǎng)，分別做4次重復(fù)。并分別于第2、3、4、5、6、7天測定記載各個(gè)處理的菌落直徑，并記錄菌落色澤、菌絲密度等。

1.2.3 極限pH值摸索方法 固體培養(yǎng)基滅菌前，用1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl分別調(diào)至pH值為2，3，4，5，7，9，11，12，13，并在121 ℃、1.1 kg·cm-2 的壓力下高溫高壓滅菌20 min（其中pH值為2，3，4，5的培養(yǎng)基沒有凝固，仍為液體培養(yǎng)基）。然后將滅菌后的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿內(nèi)約20 mL。用打孔器和接種針取供試菌株菌絲塊（直徑為1 cm）置于不同pH值的Gzapek平板中央，分別做4次重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)。并分別于第2、3、4、5、6、7天測定記載各個(gè)處理的菌落直徑，并記錄菌落色澤、菌絲密度。

液體培養(yǎng)基滅菌前，用1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl分別調(diào)至pH值為2，3，5，7，9，11，12，分別取100 mL培養(yǎng)基倒入250 mL三角瓶中，做3次重復(fù)。并在121 ℃、1.1 kg·cm-2 的壓力下高溫高壓滅菌20 min，而后取供試菌株菌絲塊（直徑為1 cm）置于不同pH值的液體培養(yǎng)基中，28 ℃130 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)至第5天[9]，分別取約5 mL的菌液，用四層紗布過濾后，在595 nm處，用分光光度計(jì)測其OD值。此后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至第18 天，分別取約30 mL的菌液，放入預(yù)先稱量好的干凈的三角瓶中，在80 ℃的干燥箱中烘干，稱其干質(zhì)量，并記錄其干質(zhì)量。

1.2.4 極限溫度摸索方法 將固體培養(yǎng)基在121 ℃、1.1 kg·cm-2的壓力下高溫高壓滅菌20 min。然后將滅菌后的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿內(nèi)約20 mL。用加液槍取振蕩培養(yǎng)14 d的枯萎菌液0.2 mL分別移植于Gzapek平板中央，置于4，18，25，28，32，36 ℃下培養(yǎng)，分別做4次重復(fù)。并于第3、4天觀察菌落生長狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對病菌生長的影響

由表1及圖1可知，供試菌株在Gzapek培養(yǎng)基上以28 ℃生長最快，第7天已長滿平板。在10～35 ℃均能生長，且菌絲在第4～5天生長明顯加快。34 ℃時(shí)生長明顯受到抑制，在低于10 ℃和高于35 ℃時(shí)不能生長。由圖1還可看出菌株在25～28 ℃范圍內(nèi)，生長速度比較平穩(wěn)，幾乎成直線狀態(tài)，生長無明顯變化。菌株在32 ℃條件下，生長速度也比較平穩(wěn)，幾乎成直線狀態(tài)，但生長速度明顯較28 ℃減慢。菌株在34 ℃條件下，生長速度明顯受到抑制，但最終也會長滿平板。菌株在18 ℃條件下，在第2天時(shí)，菌落邊緣有少量的菌絲，菌斑直徑增長不是太明顯。但在第2～3天中生長速度明顯較以后幾天快，在第5～6天，菌斑直徑已經(jīng)接近32 ℃條件下的菌斑直徑。預(yù)計(jì)18 ℃條件下生長的菌株會比32 ℃條件下的菌株先長滿平板。35 ℃條件下培養(yǎng)的菌株，在培養(yǎng)的前5 d幾乎不生長，只在菌落的邊緣出現(xiàn)極少量的菌絲，在第6天時(shí)可看到菌斑直徑的增大。

由圖2知，在28，32，34 ℃時(shí)菌絲顏色均為白色，且菌絲濃密。在25 ℃時(shí)菌絲也為白色，但菌絲較28，32，34 ℃時(shí)稀疏，菌落中央呈透明狀，邊緣為白色較濃密的菌絲。而在18 ℃時(shí)菌落前7 d呈淺粉色，并且菌落呈透明狀，菌絲生長的不太旺盛，但此后觀察發(fā)現(xiàn)菌落邊緣會出現(xiàn)白色菌絲，以至長滿整個(gè)平板。

2.2 pH值對病菌生長的影響

由表2及圖3可知，供試菌株在pH值為4～13的Gzapek培養(yǎng)基上均能生長，供試菌株對pH值的要求不是太苛刻。最適pH值為7～12，且pH值為7，9，11時(shí)的菌斑直徑與pH12時(shí)的幾乎無差異，在pH值2，3時(shí)，各菌株均停止生長。由圖2還可看出，菌株在pH值為7～13范圍內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，在第2～3天時(shí)的生長速度比此后幾天快。

由圖4可知：pH值為11，12時(shí)比pH值為7，9的菌絲濃密。pH值為13時(shí)，菌斑直徑與pH值為7～12的差異不大。但其菌絲呈透明狀，菌絲量很少，表現(xiàn)為生長受到明顯抑制。

3 討 論

棉花枯萎菌菌絲較長且濃密，接種時(shí)用打孔器打孔，并輔以接種針接種。雖然所取直徑精確度高，但其操作極為不便，并且容易造成污染。若在長有菌株的平皿上，用米尺量其長寬分別為1 cm，并用記號筆標(biāo)記，再用刀片和鑷子取菌塊，則更為方便，省時(shí)，且可減少污染。

在極限溫度和極限pH值的摸索中，先設(shè)計(jì)較大梯度，觀察其生長狀況。再在其較大梯度之間設(shè)計(jì)幾個(gè)梯度，可以很快捷有效的找出其最適條件和極限條件。本試驗(yàn)以查氏培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，得出28 ℃為最適溫度，在10～35 ℃范圍內(nèi)均可生長。這一點(diǎn)和前人用PDA培養(yǎng)基所得結(jié)果基本一致，但前人論述在pH值4～10范圍的PDA培養(yǎng)基上均能生長，最適pH值為6～7[10]。本試驗(yàn)用查氏培養(yǎng)基得出pH值4～13范圍內(nèi)枯萎菌均能生長，最適pH值為7～12。這可能與供試菌株，試驗(yàn)設(shè)備以及試驗(yàn)操作過程有一定的關(guān)系。

在接種固體培養(yǎng)基時(shí)，最好不用液體的菌液。因?yàn)榫翰粫还腆w培養(yǎng)基立即吸收，在倒置培養(yǎng)中，會導(dǎo)致菌液向固體培養(yǎng)基的周緣流動，以致于不能正確測量菌斑直徑，而且容易造成污染。

棉花枯萎菌菌絲聚集成團(tuán)狀，不利于其毒素的釋放，不能利用常規(guī)分析釋放外毒素的菌株的分析方法分析。如測其菌液的OD值，對棉花枯萎菌不能使用。查氏（Gzapek）培養(yǎng)基有一定的重量，用稱其干質(zhì)量的方法分析枯萎菌的生長狀況，試驗(yàn)結(jié)果也不理想。

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