Fe3+離子與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜分析

郝長春, 徐國慶, 王天月, 馮　盈,

亓翠玉, 高　峰, 孫文遠, 孫潤廣

(陜西師范大學 物理學與信息技術(shù)學院, 陜西 西安 710119)

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Fe3+離子與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜分析

郝長春, 徐國慶, 王天月, 馮盈,

亓翠玉, 高峰, 孫文遠, 孫潤廣

(陜西師范大學 物理學與信息技術(shù)學院, 陜西 西安 710119)

摘要：利用熒光光譜法和紫外吸收光譜法在298、306和313 K的溫度下研究了Fe(3+)與牛血清白蛋白(BSA)在生理緩沖液(pH=7.4,Tris-HCl)中的相互作用。實驗結(jié)果表明: BSA受到Fe(3+)的作用發(fā)生靜態(tài)猝滅過程, 并得到相互作用的結(jié)合常數(shù)K、結(jié)合位點數(shù)n以及相應的熵和焓等熱力學參數(shù)。進一步發(fā)現(xiàn)：Fe(3+)與BSA主要通過靜電力發(fā)生相互作用，吉布斯自由能變?yōu)樨撝嫡f明相互作用發(fā)生結(jié)合是自發(fā)過程, 能量轉(zhuǎn)移理論計算得到結(jié)合距離r為5.10 nm。同步熒光光譜實驗表明Fe(3+)誘導BSA構(gòu)象發(fā)生變化。

關(guān)鍵詞:牛血清白蛋白; 熒光猝滅; 熱力學參數(shù); 同步熒光光譜

PACS: 32.50.+d

在哺乳動物循環(huán)系統(tǒng)中, 血清白蛋白是含量最多的蛋白質(zhì)之一。它的重要功能是可以運輸脂肪酸, 每個血清白蛋白分子最多可運輸7個脂肪酸分子[1]。血清白蛋白廣泛存在于血液中, 且容易提取, 因而血清白蛋白是最早被研究的蛋白質(zhì)。牛血清白蛋白(BSA)作為理想的模型常被用來研究藥物、配體、金屬離子等物質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。BSA分子含有582個氨基酸分子, 17個二硫鍵, 16酪氨酸殘基和2個色氨酸殘基[2]。金屬離子廣泛存在于自然界中, 可以通過空氣、水、土壤、食物等途徑進入機體。鐵是一種過渡金屬元素, 人體中含有3~5 g, 是一種必需的微量元素。它是血紅蛋白、酶和一些免疫系統(tǒng)的化學物質(zhì)中重要的組成部分。研究結(jié)果表明, 鐵可以提高機體的免疫力, 增加中性白細胞和吞噬細胞的吞噬能力[3-5]。金屬離子對蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學功能起著關(guān)鍵性的作用。研究金屬離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用是生命科學的重要內(nèi)容, 是化學和生命科學研究的前沿領(lǐng)域, 許多人類的疾病與金屬離子-蛋白質(zhì)的異常相互作用相關(guān)。

熒光光譜法具有敏感度高、檢測速度快、方法簡單的特點, 常被用來研究蛋白質(zhì)分子與外源物質(zhì)間的相互作用。通過測量BSA固有熒光強度的變化來分析物質(zhì)對BSA熒光團的猝滅機理。本文在298、306和313 K的溫度下, 利用熒光光譜和紫外可見吸收光譜研究Fe3+與BSA相互作用的機理。結(jié)果表明Fe3+與BSA發(fā)生結(jié)合形成復合體結(jié)構(gòu)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白(BSA)從Sigma公司購買。FeCl3、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、HCl等化學物質(zhì)購于天津試劑公司。其他化學試劑均為分析純, 實驗用水為二次蒸餾水。

TU-1810型紫外可見分光光度計(北京普析通用有限責任公司); QM-40穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀(美國PTI公司), 75 W氙燈和水浴恒溫控制。所有激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度設(shè)定為2.0 nm。

1.2 實驗方法

BSA溶于Tris-HCl(pH=7.4)中形成10-5mol/L的溶液。配10-4mol/L的FeCl3溶液。將3 mL的BSA 溶液加入到10 mL的試管內(nèi), 在不同的試管中分別加入100、200、300、400、500、 600、 700、800、900和1 000 μL 的Fe3+溶液。然后加入Tris-HCl緩沖液定容至10 mL, 反應1 h。在激發(fā)波長為280 nm, 溫度分別為298、306、313 K的條件下測量熒光發(fā)射光譜在300~500 nm范圍內(nèi)的強度。固定BSA溶液的濃度, 依次滴加一定量的FeCl3溶液, 同步掃描Δλ分別為15和60 nm的熒光激發(fā)光譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1熒光猝滅

BSA分子含有3個固有的熒光殘基：色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸, 在相同條件下三者熒光強度之比為100∶9∶0.5。苯丙氨酸的量子產(chǎn)率較低, 由于從酪氨酸到色氨酸的有效能量轉(zhuǎn)移和熒光內(nèi)濾效應, 因此酪氨酸實驗中觀察強度變化不明顯, 所以確定色氨酸對BSA熒光發(fā)射貢獻最大。

實驗中，為了消除內(nèi)濾效應產(chǎn)生的熒光猝滅, 可以通過下面公式[6]對熒光強度進行修正：

Fcor=Fobs×e(Aex+Aem)/2。

(1)

Fcor和Fobs是糾正后和實驗觀察到的熒光強度。Aex和Aem是猝滅劑和BSA在激發(fā)和發(fā)射波長時的吸收強度。

圖1給出了在溫度為298 K、pH=7.4 的Tris-HCl緩沖液環(huán)境下, Fe3+對BSA的影響?？梢钥闯? 隨著Fe3+濃度的增加, BSA的熒光強度明顯減弱, 這表明BSA與Fe3+之間發(fā)生了相互作用。

圖1　Fe3+對BSA的熒光猝滅光譜

其中a—k代表c(Fe3+)分別為：0、10、20、30、40、

50、60、70、80、90、100 μmol/L

注:T=298 K,λex=280 nm。

由圖1的數(shù)據(jù)作出F/F0的值和Fe3+的濃度的關(guān)系圖(見圖2), 它們之間具有良好的線性關(guān)系。計算出在296、301和 307 K3個溫度下的雙分子猝滅過程速率常數(shù)Kq(見表1)。Kq值遠大于最大擴散碰撞的動態(tài)猝滅常數(shù)2.0×1010L/(mol·s), 因此可以斷定Fe3+對BSA的熒光猝滅過程可能是靜態(tài)猝滅而非動態(tài)猝滅。

熒光猝滅通常分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅常用Stern-Volmer方程[7]描述

(2)

其中:F0和F是BSA在有無猝滅劑情況下的強度;Q是猝滅劑的濃度;Ksv是Stern-Volmer猝滅常數(shù);Kq是猝滅速率常數(shù);τ0是BSA的平均壽命, 當猝滅劑不存在時其數(shù)值通常為5ns。Stern-Volmer方程可以通過F0/ F和Q圖像的線性回歸確定Ksv的值如表1所示。

圖2 在不同溫度下Fe3+對BSA猝滅的Stern-Volmer圖

注：λex=280 nm,λem=346 nm,c(BSA)= 3×10-6mol/L。

表1 在不同溫度下BSA-Fe3+系統(tǒng)

2.2Fe3+和BSA之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點的分析

靜態(tài)猝滅可以用方程(3)來描述。對于靜態(tài)猝滅,結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點n都可由double-logarithm方程中l(wèi)g[F0-F)/F]和lgQ的斜率和截距[8]求出

(3)

圖3給出了在不同溫度下Fe3+對BSA猝滅過程中l(wèi)g[(F0-F)/F]和lgQ關(guān)系的圖, 同時可以獲

圖3　在不同溫度下Fe3+ 對BSA猝滅

得BSA-Fe3+系統(tǒng)的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù), 如表2所示。結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)隨著溫度的升高而降低。這一現(xiàn)象表明在298 K環(huán)境下BSA-Fe3+的結(jié)合能力比在306 K和313 K的環(huán)境下高。Fe3+-BSA的化合物穩(wěn)定性隨著溫度的升高而逐漸降低。這一現(xiàn)象表明,此反應是吸熱反應。

表2　BSA和Fe3+的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)

2.3Fe3 +與BSA相互作用的熱力學分析和

相互作用力

氫鍵、靜電力、范德華力和疏水相互作用是小分子與蛋白相互作用的原因。判斷分子間相互作用的方法是通過熱力學參數(shù)的變化來分析。計算方程[9]如下：

(4)

ΔG=ΔH-TΔS。

(5)

Ka是方程(3)中的連接常數(shù),T是熱力學溫度,R是氣體常數(shù)。通過方程(4)可以計算出焓變ΔH和熵變ΔS的關(guān)系圖,見圖4所示。吉布斯自由能的變化ΔG可以通過方程(5)獲得。Fe3+與BSA相互作用過程中熱力學參數(shù)ΔH、ΔS和ΔG的數(shù)值見表3。從表3中可以看出ΔH<0, ΔS>0這說明了靜電力是Fe3+和BSA之間的主要內(nèi)在結(jié)合力；而ΔG<0說明Fe3+和BSA的反應是自發(fā)形成。

圖4　Fe3+和BSA結(jié)合的Van′t Hoff圖

T/KΔH/(kJ·mol-1)ΔS/(J·(mol·K)-1)ΔG/(kJ·mol-1)R2298——-31.343—306-268.059794.325-24.9890.9997313——-19.428—

2.4Fe3+對BSA構(gòu)象的影響

同步熒光光譜可以用于研究蛋白質(zhì)隨著周圍環(huán)境的構(gòu)象變化過程。當發(fā)射波長和激發(fā)波長差值Δλ=15 nm時顯示酪氨酸殘基的特征熒光,當Δλ=60 nm時, 可以觀察到色氨酸殘基的特征熒光[10-11]。

BSA-Fe3+系統(tǒng)的同步熒光光譜如圖5所示。對于Fe3+系統(tǒng)來說, 酪氨酸殘基的位置沒有改變,但色氨酸殘基的位置發(fā)生了紅移,這意味著色氨酸殘基周圍親水環(huán)境的極性增大, 說明BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化。

A.Δλ=15 nmB.Δλ=60 nm

圖5不同F(xiàn)e3+濃度下BSA的同步熒光光譜

Fig.5The synchronous fluorescence spectra of BSA at various concentrations of Fe3+

其中a—k代表c(Fe3+)分別為:0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5、12.0、13.5、15.0 μmol/L

注：T=298 K,pH=7.40,c(BSA)=3×10-6mol/L。

3 結(jié)論

本文通過熒光光譜和紫外可見吸收光譜研究了BSA與金屬離子Fe3+之間的相互作用。結(jié)果表明, Fe3+的猝滅機制為靜態(tài)猝滅。分子間相互作用力是靜電力, 且反應自發(fā)進行。猝滅劑Fe3+的存在,導致BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化。

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〔責任編輯 李博〕

Fluorescence characterization of the interaction between Fe3+and bovine serum albumin

HAO Changchun, XU Guoqing, WANG Tianyue, FENG Ying,QI Cuiyu, GAO Feng, SUN Wenyuan, SUN Runguang

(School of Physics and Information Technology, Shaanxi Normal University,Xi′an 710119, Shaanxi, China)

Abstract:The interaction of Fe(3+ )with bovine serum albumin (BSA) in physiological buffer (pH=7.4, Tris-HCl) was studied by fluorescence and UV-vis absorption spectroscopy at 298, 306 and 313 K. The quenching mechanism of bovine serum albumin by Fe(3+ )was found to be a static quenching process. The binding constant K and number of binding sites n were measured by fluorescence quenching method. The thermodynamic parameters such as entropy change (ΔS), enthalpy change (ΔH) and Gibbs free-energy change (ΔG) for the reaction were also obtained. The electrostatic force played a major role for Fe(3+)-BSA, and the Gibbs free-energy change (ΔG) were always negative indicated that the binding was spontaneous process(r=5.10 nm). From the synchronous fluorescence spectra, it can be found that the binding of Fe(3+ )with BSA induced the conformational changes in BSA.

Keywords:bovine serum albumin; fluorescence quenching; thermodynamic parameters; the synchronous fluorescence spectra

中圖分類號:O561.1

文獻標志碼:A

基金項目：國家自然科學基金(21402114,11544009); 中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(GK201402010,GK201505037); 大學生勤助科研項目(KY2015YB48,KY2015YB47)

收稿日期：2015-11-10

doi:10.15983/j.cnki.jsnu.2016.02.223

文章編號：1672-4291(2016)02-0033-04

第一作者： 郝長春, 男, 博士, 副教授,研究方向為生物物理學。E-mail: haochangchun@snnu.edu.cn