乙肝相關(guān)性肝癌組織中HBx和CEACAM1的表達(dá)水平及意義

王宏利，沙小瑩，郭雅玲，張新昀,羅改云

(西安市第八醫(yī)院 肝病6科,陜西 西安710061)

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乙肝相關(guān)性肝癌組織中HBx和CEACAM1的表達(dá)水平及意義

王宏利，沙小瑩，郭雅玲，張新昀,羅改云

(西安市第八醫(yī)院 肝病6科,陜西 西安710061)

摘要：目的研究HBx和CEACAM1在乙肝相關(guān)性肝癌組織中的表達(dá)水平，以期為肝癌發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)和防治策略。方法收集本院血清乙肝病毒表面抗原(HBVsAg)陽(yáng)性的原發(fā)性肝癌患者癌組織標(biāo)本80例，采用免疫組化法檢測(cè)HBx和CEACAM1的表達(dá)水平；采用Western blot和RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染乙肝病毒(HBV)X基因的人肝細(xì)胞株(PcDNA3-X/HL-7702細(xì)胞)、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的人肝細(xì)胞株(PcDNA3/HL-7702細(xì)胞)及未表達(dá)乙肝病毒(HBV)X基因的人肝細(xì)胞株(HL-7702細(xì)胞)中HBx和CEACAM1的表達(dá)水平。結(jié)果HBx和CEACAM1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，兩者的相關(guān)系數(shù)為-0.248；PcDNA3-X/HL-7702細(xì)胞中CEACAM1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于HL-7702細(xì)胞和 PcDNA3/HL-7702細(xì)胞(P=0.000)。結(jié)論HBx能夠通過抑制CEACAM1的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：HBx；CEACAM1；乙肝相關(guān)性肝癌組織；表達(dá)

(ChinJLabDiagn,2016,20:0384)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)在世界范圍內(nèi)傳播，據(jù)估計(jì)全球HBV感染者及攜帶者達(dá)3.5億之多，其中約有1.3億人在我國(guó)。全國(guó)每年約有30萬(wàn)人死于慢性肝病，因肝癌死亡的約有18萬(wàn)人，肝癌在我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率中排第3位。在誘發(fā)肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的眾多因素中，HBV感染占80%以上。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，慢性HBV感染者中HCC發(fā)生的高危性比非HBV感染者高約200倍。隨著對(duì)HBV和原發(fā)性肝細(xì)胞癌的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)HBV中的x基因表達(dá)產(chǎn)物HBx在肝癌形成過程中起著關(guān)鍵的作用。癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子l(CEACAMl)是癌胚抗原(CEA)超家族成員。在一些免疫細(xì)胞及上皮細(xì)胞中均可以檢測(cè)到CEACAM1的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn),CEACAM1在不同的惡性腫瘤類型中發(fā)揮著不同的作用。相比于正常組織，CEACAM1在乳腺癌、前列腺癌中表達(dá)下降，而在肺腺癌、黑色素瘤中起促癌作用，CEACAM1在肝癌中發(fā)揮作用的機(jī)制已有較多報(bào)道，但國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道CEACAM1在乙肝相關(guān)性肝癌組織中與HBx的相關(guān)作用機(jī)制。本文通過乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌組織的病理標(biāo)本和轉(zhuǎn)染乙肝病毒(HBV)x基因的人肝細(xì)胞株兩部分試驗(yàn)，檢測(cè)HBx和CEACAM1的表達(dá)水平，分析HBx 和CEACAM1之間表達(dá)的相關(guān)性，研究HBx和CEACAM1在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1肝癌組織收集本院2012年1月至2014年4月血清乙肝病毒表面抗原(HBVsAg)陽(yáng)性的原發(fā)性肝癌患者癌組織標(biāo)本80例，均為手術(shù)病例，術(shù)前未進(jìn)行化療、放療及其他輔助治療。

1.1.2細(xì)胞和質(zhì)粒肝細(xì)胞HL-7702由西安交大醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究室惠贈(zèng)。空質(zhì)粒PcDNA3由武漢晶賽生物工程有限公司合成，重組質(zhì)粒PcDNA3-X/HL-7702細(xì)胞及空質(zhì)粒PcDNA3/HL-7702細(xì)胞由本研究室構(gòu)建并保存。

1.1.3主要試劑及抗體免疫組化SP試劑盒( 北京中杉生物技術(shù)公司) ，小鼠抗人HBx單克隆抗體( NeoMarkers 公司) ，兔抗人CEACAM1 單克隆抗體( 美國(guó)Epitomics 公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔二抗(北京中杉金橋公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(北京中杉金橋公司)；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone 公司)、G418培養(yǎng)基、PBS溶液、RNA 提取試劑盒(華美公司)，Trizol試劑(美國(guó) Invitrogen 公司)，XhoI、HindIII 內(nèi)切酶(TaKaRa 公司)，2*Taq PCR Master(北京天根生物有限責(zé)任公司)，TaqDNA聚合酶(美國(guó)Promega公司)，RT-PCR試劑盒(TaKaRa 公司)，引物(上海生工生物工程有限公司合成)；小鼠抗β-actin mAb 及蛋白Marker( Sigma)， PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京碧云天公司)，5xTBE緩沖液(鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司)，5xloading buffer(南京凱基生物有限公百)，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1免疫組化法標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋并烘干后，利用SP法檢測(cè)，按試劑盒說明書步驟進(jìn)行，以PBS溶液代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。免疫組化反應(yīng)物陽(yáng)性僅表現(xiàn)細(xì)胞核著藍(lán)色者為陰性，胞膜、胞質(zhì)或胞核呈棕黃色者為陽(yáng)性。標(biāo)本經(jīng)免疫組化法檢測(cè)HBx和CEACAM1表達(dá)后陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)參考劉凱歌等實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)[1]。

1.2.2細(xì)胞的培養(yǎng)培養(yǎng)HL-7702細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基,含有10%胎牛血清。培養(yǎng)cDNA3-X/HL-7702 細(xì)胞、PcDNA3/HL-7702細(xì)胞含有200 μg/ml G418的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(混合有10%的胎牛血清),在37℃孵箱5% CO2條件下培養(yǎng),根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況,2-3天換細(xì)胞培養(yǎng)液1次。

1.2.3RT-PCR(1)RNA的提取[2]：參考孫長(zhǎng)宇實(shí)驗(yàn)中的RNA提取方法，即通過裂解細(xì)胞、抽提蛋白、沉淀RNA、洗滌和重懸等步驟提取RNA。重懸干燥后的RNA低溫保存用于RT-PCR。(2)逆轉(zhuǎn)錄PCR：按 TaKaRa 試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以lug的總RNA為模板,oligo(dT)15為引物,總反應(yīng)體積為20 μl。結(jié)束反應(yīng)后,將反轉(zhuǎn)錄得到的3種細(xì)胞cDNA樣品各1 μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(3)RT-QPCR：取肝細(xì)胞HL-7702、重組質(zhì)粒PcDNA3-X/HL-7702細(xì)胞、空質(zhì)粒PcDNA3/HL-7702細(xì)胞3種細(xì)胞cDNA各1 μl作模板,采用PCR法檢測(cè)HBx和CEACAM1基因外顯子mRNA表達(dá)水平。

本研究參考朱健康的實(shí)驗(yàn)，采用SYBR Green I的檢測(cè)模式進(jìn)行熒光定量。PCR反應(yīng)條件為95℃變性10分鐘,循環(huán)參數(shù):95℃變性15 s,60℃退火30 s,2℃延伸1 min,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán),72℃延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后確定每組的Ct值(cycle threshold),與本組的內(nèi)參照β-actin的Ct值比較后,可獲得各種檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。檢測(cè)所用的引物序列見表1。

表1　檢測(cè)所用的引物序列

1.2.4Western blotting檢測(cè)法[3]：用Western blotting檢測(cè)肝細(xì)胞HL-7702、重組質(zhì)粒PcDNA3-X/HL-7702細(xì)胞、空質(zhì)粒PcDNA3/HL-7702細(xì)胞3種細(xì)胞X蛋白和CEACAM1蛋白表達(dá)水平差異，以小鼠抗人HBx單克隆抗體，兔抗人CEACAM1 單克隆抗體為一抗，取內(nèi)參為GADPH,以辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔二抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗為二抗。參考申利紅的實(shí)驗(yàn)，通過總蛋白的提取、SDS-PAGE膠制備、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗反應(yīng)、二抗反應(yīng)和ECL曝光等步驟進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用χ2檢驗(yàn)評(píng)價(jià)HBx和CEACAM1表達(dá)的相關(guān)性及HBx和CEACAM1表達(dá)與患者病理學(xué)特征的相關(guān)性。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1在乙肝相關(guān)性肝癌組織中HBx和CEACAM1的表達(dá)

采用免疫組化法檢測(cè)80例乙肝相關(guān)性肝癌患者癌組織中HBx和CEACAM1蛋白的表達(dá)水平(圖1和圖2)，HBx表達(dá)陽(yáng)性率為72.50%(58/80)，CEACAM1表達(dá)陽(yáng)性率為67.50%(54/80)；HBx表達(dá)陽(yáng)性者中CEACAM1表達(dá)陽(yáng)性35例，HBx表達(dá)陰性者中CEACAM1表達(dá)陽(yáng)性19例，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，HBx和CEACAM1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，兩者的相關(guān)系數(shù)r為-0.248(P<0.05)，見表2。

圖1乙肝相關(guān)性肝癌中CEACAM1陽(yáng)性表達(dá)(SP法×400)圖2乙肝相關(guān)性肝癌中HBx陽(yáng)性表達(dá)(SP法×400)

表2　CEACAM1和HBx表達(dá)的相關(guān)性

2.2HBx和CEACAM1的表達(dá)與乙肝相關(guān)性肝癌臨床病理特征關(guān)系

HBx和CEACAM1的表達(dá)均與最大腫瘤直徑、血管侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P<0.05),與性別、年齡不甚相關(guān)，此外，HBx還與腫瘤數(shù)目(單發(fā)、多發(fā))有關(guān)(P<0.05)，見表3。

2.3RT-PCR檢測(cè)3種細(xì)胞HBx和CEACAM1基因外顯子mRNA表達(dá)水平

以β-actin為內(nèi)參，獲得各基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，PcDNA3-X/HL-7702細(xì)胞中HBx基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于HL-7702細(xì)胞和 PcDNA3/HL-7702細(xì)胞(P=0.000)，CEACAM1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于HL-7702細(xì)胞和 PcDNA3/HL-7702細(xì)胞(P=0.000)，HL-7702細(xì)胞和 PcDNA3/HL-7702細(xì)胞中HBx和CEACAM1基因外顯子mRNA相對(duì)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表3　HBx和CEACAM1的表達(dá)與乙肝相關(guān)性肝癌臨床病理特征關(guān)系

“*”P<0.05；r為相關(guān)系數(shù)。

表4　三種細(xì)胞中HBx和CEACAM1基因外顯子mRNA相對(duì)表達(dá)量平均值

2.4Western blotting檢測(cè)3種細(xì)胞x蛋白和CEACAM1蛋白的表達(dá)

PcDNA3-X/HL-7702細(xì)胞中出現(xiàn)HBx蛋白，HL-7702細(xì)胞和 PcDNA3/HL-7702細(xì)胞中無(wú)HBx蛋白形成。PcDNA3-X/HL-7702細(xì)胞中CEACAM1蛋白灰度明顯低于HL-7702細(xì)胞和 PcDNA3/HL-7702細(xì)胞，見圖3、圖4。其中1為PcDNA3-X/HL-7702細(xì)胞組，2為PcDNA3/HL-7702細(xì)胞組，3為HL-7702細(xì)胞組。

3討論

HBV的x基因是HBV基因組4個(gè)開放讀碼框中的最小一段，其表達(dá)蛋白HBx含有154個(gè)氨基酸，分子量為17 kD，HBx具有廣泛的轉(zhuǎn)錄激活功能和非特異性反式激活作用。在細(xì)胞核內(nèi)， HBx可能通過蛋白—蛋白間的相互作用與轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，直接或間接作用于基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。研究表明，除此之外，HBx還有反式抑制作用。細(xì)胞癌變的基本特征是細(xì)胞調(diào)節(jié)紊亂，造成促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)因素和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡因素之間的失平衡。近年來，越來越多的證據(jù)表明HBx可以與肝細(xì)胞核內(nèi)外的大量蛋白分子發(fā)生相互作用，造成肝細(xì)胞調(diào)節(jié)紊亂，包括影響癌基因、抑癌基因的表達(dá)及活性，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞癌變。

圖3　Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中HBx蛋白表達(dá)

圖4　Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中CEACAM1蛋白表達(dá)

癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子 1(CEACAMl)是一種跨膜糖蛋白,被認(rèn)為是癌胚抗原(CEA)家族成員之一,屬于免疫球蛋白超家族。近年來研究表明，CEACAM1在不同的腫瘤中發(fā)揮的作用不同，在某些腫瘤中起抑制作用，而在另外一些腫瘤中起促進(jìn)作用。也有研究發(fā)現(xiàn)，CEACAM1可分為胞漿CEACAM1和胞膜CEACAM1[4]，認(rèn)為其中胞膜CEACAM1具有抑制癌癥的作用，而胞漿CEACAM1則具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生與發(fā)展的作用，解釋了CEACAM1在不同腫瘤中表達(dá)水平的差異在于胞膜CEACAM1和胞漿CEACAM1的相對(duì)多少。

本研究結(jié)果表明，在80例乙肝相關(guān)性肝癌組織中，HBx與CEACAM1呈負(fù)相關(guān)(r=-0.248，P<0.05)，說明HBx可能是通過抑制胞膜CEACAM1的表達(dá)水平，促進(jìn)肝癌的發(fā)生。HBx和CEACAM1的表達(dá)均與最大腫瘤直徑、血管侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等肝癌病理學(xué)特征有關(guān)(P<0.05)，說明二者均與腫瘤的嚴(yán)重程度相關(guān)，其中HBx與最大腫瘤直徑、血管侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈正相關(guān)，CEACAM1與最大腫瘤直徑及TNM分期呈負(fù)相關(guān)，但與血管侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，表明HBx為腫瘤促進(jìn)因子，而CEACAM1作用不確定，有可能為腫瘤抑制因子。本研究通過構(gòu)建表達(dá)乙肝病毒(HBV)x基因的人肝細(xì)胞株：構(gòu)建重組質(zhì)粒PcDNA3-X，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將PcDNA3-X及空質(zhì)粒PcDNA3導(dǎo)入肝細(xì)胞HL-7702中G418選擇培養(yǎng)，并用RT-PCR和Western blotting進(jìn)行HBx基因和CEACAM1基因表達(dá)檢測(cè)鑒定。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，(HBV)x基因成功轉(zhuǎn)入肝細(xì)胞HL-7702中，并穩(wěn)定表達(dá)，而轉(zhuǎn)染后的肝細(xì)胞HL-7702中CEACAM1基因表達(dá)明顯下降，其mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于HL-7702細(xì)胞和 PcDNA3/HL-7702細(xì)胞(P=0.000)；Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，PcDNA3成功導(dǎo)入HL-7702細(xì)胞，且在x基因的存在下，CEACAM1蛋白表達(dá)明顯下降，此結(jié)果與免疫組化法得出的結(jié)果相一致，進(jìn)一步證明了HBx抑制CEACAM1的表達(dá)。

通過乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌組織病理標(biāo)本和轉(zhuǎn)染乙肝病毒(HBV)X基因的人肝細(xì)胞株兩部分試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HBx為腫瘤促進(jìn)因子，CEACAM1在乙肝相關(guān)性肝癌中可能作為腫瘤抑制因子， HBx能夠抑制CEACAM1的表達(dá)，則表明HBx能通過影響抑癌因子的活性來導(dǎo)致癌細(xì)胞的發(fā)生，這與Feitelson，Sohn等的研究相一致[5-10]。

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Expression level and significance of CEACAM1 and HBx in HBV related liver cancer tissue

WANGHong-li,SHAXiao-ying,GUOYa-ling,etal.

(SixDepartmentofLiverDisease,Xi'anEighthHospital,Xi'an710061，China)

Abstract:ObjectiveTo study the expression level of HBx and CEACAM1 in HBV related cancer tissue,so as to provide new theoretical basis and prevention strategies for the pathogenesis of liver cancer.Methods80 Cancer tissue samples were collected from 80 patients with primary liver cancer,whose HBV Surface Antigen(HBVsAg)were positive in our hospital.Immunohistochemical methods were used to detect the expression of HBx and CEACAM1 in pathologic specimen of liver Cancer tissue samples.Using Western blot and RT-PCR to detect the expression of HBx and CEACAM1 in the normal human liver cell lines which had no expression of the X gene of hepatitis b virus(HBV)(HL-7702 cells),and the human liver cell lines of transfection the X gene of hepatitis b virus(HBV)(PcDNA3-X/HL-7702 cells)and empty plasmid(PcDNA3/HL-7702 cells).ResultsNegative correlation were found in the expression of HBx and CEACAM1 whose related phi coefficient is-0.248;The relative expression of CEACAM1 mRNA of PcDNA3-X/HL-7702 cells were significantly lower than the amount of the HL-7702 cells and PcDNA3/HL-7702 cells(P=0.000).ConclusionHBx can promote the occurrence of liver cancer by inhibiting the expression of CEACAM1.

Key words:HBx;CEACAM1;HBV related liver cancer tissue;Expression

(收稿日期：2015-03-19)

作者簡(jiǎn)介：王宏利(1973-)，男， 本科學(xué)歷，副主任醫(yī)師，從事乙肝相關(guān)肝癌方面的研究。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R735.7

文章編號(hào)：1007-4287(2016)03-0384-05

基金項(xiàng)目：陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014K11-01-01-15)