蟲草菌粉對(duì)急性百草枯中毒大鼠肺損傷的治療及相關(guān)機(jī)制

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【摘 要】 目的：觀察蟲草菌粉對(duì)急性百草枯中毒大鼠肺損傷的治療作用及相關(guān)機(jī)制。方法：選用健康成年SD大鼠112只（雌雄各半），隨機(jī)分為A、B、C、D組。A組（健康對(duì)照組）7只，B組（單純?nèi)径窘M）35只，C組（蟲草菌粉治療組）35只，D組（蟲草菌粉對(duì)照組）35只。B、C組給予一次PQ 20mg/Kg腹腔注射，A、D組給予一次等量生理鹽水腹腔注射。C、D組每日給予蟲草菌粉5g/kg灌胃。觀察4組大鼠狀況、病理學(xué)變化與相關(guān)指標(biāo)水平變化。結(jié)果：A、C、D組大鼠各時(shí)間點(diǎn)精神狀態(tài)、活動(dòng)度均表現(xiàn)良好，呼吸平穩(wěn)；C組與A、D組比較。大鼠狀況與病理學(xué)變化明顯，各指標(biāo)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；經(jīng)蟲草菌粉灌胃，C組與B組比較癥狀明顯改善；且C組大鼠肺組織損傷程度、血清中MDA、SOD、GSH-Px水平，C組肺濕/干重比值（W/D）、肺損傷肺組織中α1-AT水平均顯著優(yōu)于B組（P<0.05）。結(jié)論：蟲草菌粉對(duì)PQ中毒引起的急性肺損傷有較好的治療作用，可清除氧自由基，提高機(jī)體抗氧化損傷、抑制脂質(zhì)過氧化，可促進(jìn)α1-AT表達(dá)，減輕PQ中毒引起的肺組織損傷。

【關(guān)鍵詞】 百草枯中毒；蟲草菌粉；肺損傷

【中圖分類號(hào)】R595.4 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）05-0081-03

百草枯（PQ）有著良好的除草效果，且使用范圍廣泛，但中毒死亡率極高，對(duì)醫(yī)療工作者提出了巨大的挑戰(zhàn)。PQ中毒致死量小，肺組織中毒物濃度最高，因此肺損傷最為嚴(yán)重，患者多死于呼吸窘迫綜合征，死亡率可高達(dá)85%～95%[1]。目前治療百草枯中毒的中成藥還比較少。蟲草菌粉是從新鮮冬蟲夏草中分離得到菌絲體，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌絲體的干燥粉末，開展蟲草菌粉對(duì)急性百草枯中毒大鼠肺損傷研究可為開拓臨床應(yīng)用范圍和指導(dǎo)臨床實(shí)踐、增加適應(yīng)癥，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)[2]。實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制PQ急性中毒大鼠模型，觀察蟲草菌粉對(duì)PQ中毒所致急性肺損傷的治療作用及機(jī)制，以便采取中西醫(yī)結(jié)合以及其他綜合治療措施，延長患者壽命。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 健康成年SD大鼠112只（雌雄各半），體質(zhì)量250～300g，由贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。20%百枯草原液（先正達(dá)（中國）投資有限公司）；蟲草菌粉（批號(hào)：040801，江西金水寶制藥有限公司）。MDA試劑盒（批號(hào)：20101022）、SOD試劑盒（批號(hào)：20101025），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（批號(hào)：20101025）均購自南京建成生物工程研究所。α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）蛋白抗體、免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 分組及給藥 選用健康成年SD大鼠112只，隨機(jī)分為A、B、C、D組。A組：健康對(duì)照組7只；B組：?jiǎn)渭內(nèi)径窘M35只；C組：蟲草菌粉治療組35只；D組：蟲草菌粉對(duì)照組35只。B、C組給予一次PQ20mg/Kg腹腔注射，A、D組給予一次等量生理鹽水腹腔注射。C、D組每日給予蟲草菌粉5g/kg灌胃，A、B組每日給予等量生理鹽水灌胃。

1.3 標(biāo)本采集與檢測(cè) B組、C組分別于染毒后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d各取5只大鼠心臟取血處死，留取血標(biāo)本，測(cè)定丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）。A組、D組也在相同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定以上指標(biāo)，測(cè)定方法按試劑盒說明進(jìn)行。同時(shí)，以上各組均取大鼠整個(gè)左肺，用濾紙吸干血漬，分析天平稱重后放入80℃恒溫烤箱烘烤24h，計(jì)算肺濕/干重比值（W/D），右肺前葉組織制備病理切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（HE），在400倍光鏡下進(jìn)行病理觀察。應(yīng)用免疫組化法，PQ中毒急性肺損傷肺組織中α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）的表達(dá)（肺組織石蠟切片免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)α1-AT蛋白表達(dá)，按試劑盒說明書操作）。采樣方法：心臟取血處死大鼠，采血收集血樣并取出左、右肺，采血注射器及試管均在實(shí)驗(yàn)前用500u/ml肝素濕潤。α1-AT免疫組化染色陽性切片與40HP物鏡下挑選10個(gè)視野觀測(cè)陽性細(xì)胞胞漿平均吸光度（OD），以其單位面積相對(duì)含量反應(yīng)染色強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理分析，計(jì)量資料均采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用LSD最小顯著差法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 A組與D組大鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)如常，能夠自由進(jìn)食飲水。B組大鼠在腹腔注射PQ 2h開始出現(xiàn)精神差，萎靡不振，伴有不同程度的毛發(fā)松散、瞇眼、步態(tài)蹣跚與拱背。1d后出現(xiàn)四肢末端、口唇紫紺，呼吸加快加深，并隨著時(shí)間的延長而加重；3～7d后出現(xiàn)觸之反應(yīng)差，靜伏，呼吸急促或點(diǎn)頭樣呼吸，甚至呼吸窘迫情況，全身出現(xiàn)明顯紫紺；14d后存活的大鼠癥狀開始逐漸減輕，并恢復(fù)正常；21d后存活大鼠再次出現(xiàn)呼吸頻率加快、氣促，個(gè)別大鼠死亡前出現(xiàn)呼吸困難、紫紺等缺氧癥狀，其余無明顯紫紺。C組與B組比較，大鼠各時(shí)間點(diǎn)精神狀態(tài)、活動(dòng)度均表現(xiàn)良好，呼吸平穩(wěn)，癥狀明顯改善。

2.2 大鼠肺組織病理學(xué)變化 A組與D組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺臟表面呈粉紅色，質(zhì)軟富有彈性，表面光滑。B組大鼠1d肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔可見少量炎性細(xì)胞滲出，表面僅見散在點(diǎn)狀出血；3d肺泡結(jié)構(gòu)可辨認(rèn)，肺泡壁局部增厚，肺泡腔大量炎性細(xì)胞滲出；7d肺組織中表現(xiàn)出巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，部分肺泡腔有透明膜形成，充滿水腫液，肺泡壁斷裂，嚴(yán)重的有彌漫性肺出血，甚至結(jié)構(gòu)消失，隨著時(shí)間的延長，肺組織損傷程度逐漸加重；14d出現(xiàn)部分肺泡間隔纖維性增厚，肺泡結(jié)構(gòu)不清，肺泡腔內(nèi)充滿炎性細(xì)胞滲出，但較之前減少，可見膠原纖維增生；21d大部分肺泡明顯塌陷，形成纖維細(xì)胞進(jìn)一步增多；28d肺明顯形成纖維化，肺泡腔、肺間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，且生成大量纖維細(xì)胞；35d大鼠肺纖維化病灶數(shù)明顯增多。蟲草菌粉干預(yù)的C組大鼠肺組織損傷比B組顯著更輕。

2.3 血清中MDA、SOD、GSH-Px測(cè)定比較 各時(shí)間點(diǎn)四組大鼠血清中MDA、SOD、GSH-Px水平見表1-3。

2.4 大鼠肺濕/干重比值（W/D）、肺損傷肺組織中α1-AT水平 A組W/D值：（2.44±0.16），B組W/D值：（5.05±1.31），C組W/D值：（3.87±1.00），D組W/D值：（2.68±0.13）。B組與C組W/D值均顯著與A組與D組（P<0.01），且C組W/D值顯著低于B組（P<0.01）。

2.5 四組大鼠肺損傷組織中α1-AT水平對(duì)比 對(duì)比觀察四組大鼠肺損傷組織中α1-AT水平。見表4。

3 討論

PQ是一種高效能的非選擇性接觸型除草劑，對(duì)人畜具有很強(qiáng)毒性，贛南地區(qū)百草枯在農(nóng)村應(yīng)用廣泛，臨床工作中PQ中毒患者屢見不鮮。肺是主要靶器官，PQ中毒可導(dǎo)致“PQ肺”，早期表現(xiàn)為急性肺損傷（ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），后期出現(xiàn)肺泡內(nèi)和肺間質(zhì)纖維化，是PQ中毒致死的主要原因，其中單純因肺部損傷死亡所占的比例達(dá)50%～70%[3]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在腹腔注射PQ 2h開始出現(xiàn)精神差，萎靡不振，伴有不同程度的毛發(fā)松散、瞇眼、步態(tài)蹣跚與拱背。1d后出現(xiàn)四肢末端、口唇紫紺，呼吸加快加深，并隨著時(shí)間的延長而加重；3d后出現(xiàn)觸之反應(yīng)差，靜伏，呼吸急促，甚至呼吸窘迫情況；7d與14d，表現(xiàn)為為急性肺損傷；21～35d大鼠急性損傷基本緩解，同時(shí)現(xiàn)肺纖維化。C組與B組比較，大鼠各時(shí)間點(diǎn)精神狀態(tài)、活動(dòng)度均表現(xiàn)良好，呼吸平穩(wěn)，癥狀明顯改善；而經(jīng)組織病理觀察，大鼠PQ中毒后肺組織中表現(xiàn)出巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，部分肺泡腔有透明膜形成，充滿水腫液，肺泡壁斷裂，嚴(yán)重的有彌漫性肺出血，甚至結(jié)構(gòu)消失，隨著時(shí)間的延長，肺組織損傷程度逐漸加重。

PQ中毒所致的急性肺損傷目前無特效解毒藥物，研究主要在氧自由基損傷方面展開，抗氧化劑維生素C、維生素E、色甘酸鈉、還原型谷胱甘肽都曾經(jīng)用于治療PQ中毒急性肺損傷[4]，但效果都不確切。研究表明[5]，蟲草菌粉在肺組織炎性及纖維化疾病中有一定的治療作用。超氧化物歧化酶（SOD）與谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）廣泛存在于需氧物體，均為構(gòu)成肺內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化酶性保護(hù)系統(tǒng)的主要酶，是體內(nèi)最重要的自由基清除劑，其活性間接反映了機(jī)體清除自由基的能力。丙二醛（MDA）是機(jī)體內(nèi)氧自由基代謝過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，反映了機(jī)體脂質(zhì)過氧化自由基的存在與過氧化反應(yīng)的程度[4]。PQ進(jìn)入體內(nèi)后，經(jīng)自由基損傷作用造成肺組織氧化性損傷，因此對(duì)SOD、GSH-Px活性、MDA濃度的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)能夠反映機(jī)體清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化損傷的能力[4-5]。研究結(jié)果表明，PQ中毒大鼠血清的SOD、GSH-Px活性顯著下降，MDA濃度顯著升高，該改變可能與PQ在體內(nèi)代謝中生成活性氧自由基過程有關(guān)，在PQ進(jìn)入體內(nèi)后先產(chǎn)生氧離子，在SOD的作用下形成H2O2，中毒早期血漿中SOD活力顯著下降，而中毒中晚期SOD活力稍有升高。GSH-Px活性隨著時(shí)間的延長呈顯著下降，可能與PQ中毒后期H2O2較多有關(guān)[6]，迅速形成的大量的OH-將大量消耗GSH-Px。給予PQ中毒大鼠以蟲草菌粉治療，血清中MDA含量明顯下降，而SOD活性明顯升高，結(jié)果提示蟲草菌粉可通過清除氧自由基，提高機(jī)體抗氧化損傷、抑制脂質(zhì)過氧化，達(dá)到PQ對(duì)肺組織損傷的作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)，在急性肺損傷模型中，內(nèi)毒素組α1-AT 活性明顯低于對(duì)照組，可能因急性肺損傷造成彈性蛋白酶、胰蛋白酶大量釋放，造成蛋白酶與抑制劑比例失衡，ARDS患者注射α1-AT抑制彈性蛋白酶的活性，可減輕內(nèi)毒素引起的肺組織損傷[6]。本研究結(jié)果表明，百草枯中毒大鼠血清肺組織中α1-AT水平在中毒7d后顯著下降，而采用蟲草菌粉可促進(jìn)α1-AT表達(dá)，減輕PQ中毒引起的肺組織損傷。

綜上所述，蟲草菌粉在PQ急性中毒中有較好的治療作用，治療作用與減輕自由基損傷，促進(jìn)α1-AT表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2015.12.25）