回藥失羂剌知丸抗大鼠腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

左艷麗　賈孟輝　于凌志　王佩佩　劉麗　蘇丹　李占濤

【摘 要】 目的：觀察回藥失荅剌知丸對(duì)大鼠腦缺血再灌注后腦組織中Fas及FasL表達(dá)的影響，探討失荅剌知丸治療腦缺血性疾病的機(jī)制。方法：SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、金納多組、失荅剌知丸低濃度組、失荅剌知丸中濃度組、失荅剌知丸高濃度組，局灶性腦缺血再灌注模型制備成功后分別于12h、24h、72h取材，采用干濕重法測(cè)腦含水量，免疫熒光法觀察Fas陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量，TUNEL和免疫組化法觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況及FasL表達(dá)的變化。結(jié)果：與假手術(shù)組相比，缺血再灌注損傷后腦含水量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量及Fas、FasL的表達(dá)明顯增高（P<0.01，P<0.05）；與模型組比較，用藥組各時(shí)段腦含水量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量及Fas、FasL的表達(dá)均減弱（P<0.05），以失荅剌知丸高濃度組的表達(dá)減弱顯著（P<0.01）。結(jié)論：失荅剌知丸能夠有效減輕腦組織水腫，抑制Fas、FasL的表達(dá)，其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制可能與抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 失荅剌知丸；腦缺血；Fas；FasL

【中圖分類(lèi)號(hào)】R743 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）05-0073-04

Abstract：Objective： To observe the effect of expression of Fas and FasL in the hippocampus of ischemia-reperfusion injury rats brain tissue by taking Shida Lazhi Wan， and to explore Shida Lazhi Wan mechanism for the treatment of cerebral ischemic diseases. Methods： SD male rats were randomly divided into 6 groups： sham group，the ischemia reperfusion model group （hereinafter referred to as the model group），JinNaDuo group，Shida Lazhi Wan low concentration group， Shidalazhiwan medium concentration group，Shida Lazhi Wan high concentration group， After focal cerebral ischemia models were established，at 12h、24h、72h，neurons apoptosis，wet and dry weight measured brain water content， immunofluo-rescence techniques to measure Fas expression，TUNEL and immunohistochemical method to observe neuronal apoptosis and the change of FasL expression. Result： To compared with the sham operation group，after ischemia-reperfusion injury ， brain water、number of nerve cell apoptosis and Fas、FasL expression were significantly increased（P<0.01， P<0.05）；compared with the model group， every treatment groups brain water number、nerve cell apoptosis and Fas、FasL expression were recede （P<0.05），especially Shida Lazhi Wan high concentration group Reduce significantly （P<0.01）. Conclusion：Shida Lazhi Wan can ？reduce brain water effectively， inhibition of Fas and FasL express， its nerve protection mechanism may be related to inhibition of neural cell apoptosis.

Keywords：Shida Lazhi Wan；ischemia reperfusion；Fas；FasL

隨著人口老齡化進(jìn)程的加速，高血壓、冠心病等相關(guān)危險(xiǎn)因素的增加，腦血管疾病的發(fā)病率也逐年攀升，對(duì)人類(lèi)的生命健康和生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重的威脅。其中，缺血性腦血管疾病最為常見(jiàn)，約占腦血管疾病的80%左右[1]。目前，臨床上最常用的是在有限的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行溶栓等治療以達(dá)到恢復(fù)腦血管血液供應(yīng)的目的，但有可能造成腦組織的進(jìn)一步損傷，即腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷機(jī)制龐雜，相互交聯(lián)，有研究表明，細(xì)胞凋亡在其發(fā)病進(jìn)程中擔(dān)任著至關(guān)重要的角色。細(xì)胞凋亡多發(fā)生于腦缺血急性期，主要出現(xiàn)在缺血半暗帶區(qū)和對(duì)缺血缺氧敏感的海馬、齒狀回和大腦皮質(zhì)[2]，神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量的多少?zèng)Q定著腦組織梗死體積的大小。細(xì)胞凋亡是一個(gè)有嚴(yán)格程序控制的可逆過(guò)程，因此，著力于調(diào)控其機(jī)制，限制其進(jìn)一步發(fā)展，對(duì)減小腦梗死體積以及神經(jīng)功能恢復(fù)等具有重大意義[3]。失荅剌知丸作為回醫(yī)藥治療腦缺血性疾病的傳統(tǒng)、經(jīng)典方藥，前期系列研究業(yè)也表明：失荅剌知丸可以調(diào)節(jié)細(xì)胞抗凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K-AKT通路的活性，上調(diào)PI3K和AKT的表達(dá)，通過(guò)抑制促凋亡分子的活化，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4]。Fas/FasL 是目前研究較為清楚的死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在正常大腦中維持免疫抑制狀態(tài)，當(dāng)腦缺血發(fā)生后，F(xiàn)as與FasL交聯(lián)，參與并促進(jìn)腦缺血再灌注所引起的腦組織損傷[5]。為進(jìn)一步探討失荅剌治丸保護(hù)缺血再灌注損傷腦組織的作用機(jī)制，筆者開(kāi)展失荅剌治丸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織FasL表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD大鼠，雄性，80只，SPF級(jí)，體重（280±50）g，購(gòu)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)：SCXK（寧）2011-0001，所有大鼠均在同一動(dòng)物房?jī)?nèi)常規(guī)飼養(yǎng)3d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物 失荅剌知丸（出自《回回藥方考釋》）：柴胡30g，黑訶子30g，蘆薈60g，元胡6g，石菖蒲6g，番鹽6g，藥西瓜9g，松蕈9g，安息香9g，阿魏9g，砂糖15g，干姜3g，胡椒3g，蓽撥3g，白芥子3g，蕓香3g，巴豆9g，共計(jì)213g，以上所有藥物切制、煎煮后放置于恒溫水浴鍋中分別濃縮至低濃度1.112 g/ml、中濃度2.223g/ml、高濃度4.446g/ml的藥液，置于4 ℃冰箱備用。金納多（銀杏葉提取物，德國(guó)威瑪舒培公司）臨用前配制成1.04mg/ml的混懸液。

1.3 試劑 水合氯醛（批號(hào)：2636-4A，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，臨用前配成濃度為10%的水合氯醛溶液）；兔抗大鼠Fas抗體（批號(hào)：BA0048）、兔抗大鼠FasL抗體（批號(hào)：BA0148）、山羊抗兔IgG（批號(hào)：BA1128）、濃縮型正常山羊血清（批號(hào)：AR1009）均為博士德生物公司產(chǎn)品。

1.4 儀器 FX4-2型電熱恒溫干燥箱（Shella公司）：BT224S 型電子天平（Sartorious公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥 80只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、金納多組、失荅剌知丸低濃度組、失荅剌知丸中濃度組、失荅剌知丸高濃度組，后5組采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈阻塞-再灌注模型，并分為術(shù)后12、24、72h三個(gè)亞組，共16組，每組5只。SD大鼠給藥量為1ml/100g，用藥組分別給予相應(yīng)藥物，于造模前30min第一次灌胃，以后每天2次，直至取材；假手術(shù)組、模型組給予相應(yīng)濃度的生理鹽水。

2.2 模型制備 參照改良的Longa法[6]，利用線栓阻塞大鼠大腦中動(dòng)脈，造成腦缺血2h后再灌注模型。10%的水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位，沿頸部正中線切開(kāi)，依次鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，將直徑為0.24mm的線栓自頸外動(dòng)脈小切口處插入至頸內(nèi)動(dòng)脈，直至感到輕微阻力，長(zhǎng)度約為18±2mm，用手術(shù)縫合線將頸外動(dòng)脈小切口和線栓尾端一起結(jié)扎，阻斷血流2h后實(shí)行再灌注，待大鼠清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分≥2分者作為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組鈍性剝離頸內(nèi)外動(dòng)脈后縫合傷口。

2.3 取材 各組分別于術(shù)后12h 、24h、72h取材，10%水合氯醛過(guò)量麻醉大鼠，經(jīng)心尖生理鹽水沖洗，再換用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行灌注固定，取出全腦，切取缺血側(cè)大腦海馬區(qū)，常規(guī)石蠟包埋，余腦組織放于凍存管保存在液氮內(nèi)。

2.4 腦含水量測(cè)定 采用干濕質(zhì)量法測(cè)定缺血側(cè)含水量，于各時(shí)間點(diǎn)麻醉大鼠，快速斷頭取腦，將待測(cè)腦組織濾紙擦去表面水分，稱(chēng)取濕質(zhì)量后置于100℃電烤箱24h，稱(chēng)取干質(zhì)量。腦含水量 =（m濕質(zhì)量-m干質(zhì)量）/m濕質(zhì)量×100%。

2.5 腦組織病理學(xué)觀察 待測(cè)腦組織切片后經(jīng)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織結(jié)構(gòu)的變化。

2.6 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè) 標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，嚴(yán)格按TUNEL檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作。以胞核內(nèi)有棕黃色顆粒者為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，在400倍鏡下隨機(jī)選取梗死灶周邊五個(gè)不重疊的視野拍照并計(jì)數(shù)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.7 免疫熒光法檢測(cè)Fas表達(dá) 待測(cè)腦組織經(jīng)過(guò)常規(guī)包埋、切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、復(fù)溫、山羊血清封閉、滴加兔抗大鼠抗體、滴加山羊抗兔熒光二抗、封片、熒光顯微鏡下觀察，假手術(shù)組對(duì)照使用PBS緩沖液代替一抗，余相同，所有步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。每個(gè)標(biāo)本取 3 張切片，每張切片取3 個(gè)互不重疊部位，應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡掃描（掃描參數(shù)：激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，檢測(cè)的發(fā)射光波長(zhǎng)518nm），計(jì)數(shù)400×視野下熒光陽(yáng)性細(xì)胞，取平均值。

2.8 免疫組化法檢測(cè)FasL表達(dá) 標(biāo)本切片為6mm，經(jīng)常規(guī)二甲苯和梯度酒精脫蠟水化，枸櫞酸鈉緩沖液抗原修復(fù)，3% H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加10%的山羊血清封閉1h，滴加一抗4℃冰箱過(guò)夜，陰性對(duì)照組加PBS緩沖液，次日取出37℃復(fù)溫1h，PBS緩沖液沖洗3遍×5min，滴加二抗室溫置放1h，DAB染色，PBS緩沖液沖洗3遍×5min，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。以胞質(zhì)或胞核內(nèi)有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片在400倍鏡下隨機(jī)選取梗死灶周邊5個(gè)不重疊的視野拍照，并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，使用單因素方差分析法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 腦含水量測(cè)定 與假手術(shù)組相比，各組各時(shí)間點(diǎn)腦含水量均明顯增高（P<0.01）；與模型組相比，各用藥組各時(shí)間點(diǎn)腦含水量均明顯降低（P<0.01）；與金納多組比較，失荅剌知丸中濃度及高濃度組腦含水量有不同程度的降低（P<0.05或P<0.01）；同組別72h相比，失荅剌知丸高濃度組減少更加明顯（P<0.01）。見(jiàn)表 1。

3.2 病理學(xué)觀察 假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)正常，大小均勻，排列整齊，層次分明；模型組大鼠神經(jīng)形元態(tài)明顯異常，大小不均，神經(jīng)元皺縮，排列紊亂，層次不清，多數(shù)細(xì)胞核呈現(xiàn)三角形或錐形；失荅剌知丸低劑量神經(jīng)元細(xì)胞較紊亂，多數(shù)皺縮變形，大小欠均勻；金納多組及失荅剌知丸中濃度組大多數(shù)神經(jīng)元形態(tài)欠規(guī)則，有皺縮現(xiàn)象，層次欠清晰，且各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元形態(tài)區(qū)別不明顯；失荅剌知丸高濃度組大鼠大多數(shù)神經(jīng)元形態(tài)正常，存有少量皺縮神經(jīng)元，層次較清晰，且正常神經(jīng)元比例隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，以失荅剌知丸組72h組較明顯。

3.3 各組缺血側(cè)海馬區(qū)Fas表達(dá)比較 Fas蛋白主要位于神經(jīng)細(xì)胞膜上，在本實(shí)驗(yàn)中標(biāo)記為綠色，與假手術(shù)組相比，各組各時(shí)間點(diǎn)Fas表達(dá)均明顯增高（P<0.01）；與模型組相比，各用藥組各時(shí)間點(diǎn)Fas蛋白表達(dá)明顯減少（P<0.01）；與金納多組比較，失荅剌知丸中劑量組各時(shí)間點(diǎn)FasL蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），失荅剌知丸高劑量組各時(shí)間點(diǎn)Fas蛋白表達(dá)有所減少（P<0.05），尤以72h組減少明顯（P<0.01）。見(jiàn)表2。

3.4 對(duì)大鼠腦缺血再灌注TUNEL凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的影響 從表3看出，與假手術(shù)組比較，模型組及各用藥組各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)有顯著增高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)有減少（P<0.05或P<0.01），以24h、72h凋亡細(xì)胞數(shù)減少尤為明顯（P<0.01）；失荅剌知丸組24h、72h組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于金納多組（P<0.01）。見(jiàn)表3。

3.5 對(duì)腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)FasL表達(dá)的影響 從表4可以看出，與假手術(shù)組比較，模型組及各用藥組各時(shí)間點(diǎn)FasL蛋白表達(dá)明顯增高（P<0.01）；與模型組比較，各用藥組各時(shí)間點(diǎn)FasL蛋白表達(dá)明顯減少（P<0.01）；與金納多組比較，失荅剌知丸中劑量組各時(shí)間點(diǎn)FasL蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（P>0.05），失荅剌知丸高劑量組各時(shí)間點(diǎn)FasL蛋白表達(dá)有所減少（P<0.05或P<0.01），尤以72h組減少明顯（P<0.01）。見(jiàn)表4。

4 討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷主要與興奮性氨基酸、自由基損傷、血腦屏障破壞、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等機(jī)制有關(guān)[7-8]。這些機(jī)制彼此重疊，互為因果，相互聯(lián)系，產(chǎn)生一系列快速級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致腦組織的損傷[9]。在這個(gè)復(fù)雜的過(guò)程中，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡被認(rèn)為是腦缺血再灌注損傷的主要環(huán)節(jié)，因此調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞凋亡成為治療缺血性腦病的關(guān)鍵所在。FasL在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵的作用。Fas被稱(chēng)為死亡受體分子，屬于腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）/神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Nerve growth factor，NGF）受體家族，是促細(xì)胞凋亡的最重要分子之一。FasL作為Fas的天然配體與3個(gè)Fas 分子結(jié)合，促使死亡結(jié) 構(gòu)域（DD）聚集后結(jié)Fas 的相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（FADD），進(jìn)而通過(guò)引起Caspase 酶聯(lián)反應(yīng)致使細(xì)胞凋亡[10]。抑制因促凋亡系統(tǒng)Fas/FasL的激活而產(chǎn)生的生物學(xué)作用是發(fā)揮保護(hù)腦組織的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。已有大量研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥可以減輕腦缺血再灌注損傷后促凋亡因子的表達(dá)[12-13]。

失荅剌知丸出自《回回藥方》，是防治腦血管疾病的經(jīng)典方劑，由柴胡、黑訶子、蘆薈、元胡、石菖蒲、藥西瓜、阿魏、 安息香、干姜、胡椒、蓽撥、白芥子、蕓香等藥組成，以芳香通竅，利痰化濕，祛寒通絡(luò)為治療原則，運(yùn)用大量芳香藥以加強(qiáng)血管通透性、增強(qiáng)藥物透過(guò)血腦屏障[14]，治療腦卒中后骨節(jié)疼痛，口眼歪斜，半身不遂等癥狀。研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，對(duì)缺血缺氧敏感的海馬區(qū)腦含水量及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的數(shù)量迅速增加，于24h達(dá)到高峰，72h后下降。較模型組比較，各用藥組腦含水量及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的數(shù)量均有所減少，但不同濃度的失荅剌知丸下調(diào)水平有所差別，以失荅剌知丸高劑量組效果明顯，說(shuō)明長(zhǎng)期服用高濃度的失荅剌知丸可以通過(guò)抗凋亡以達(dá)到有效治療和緩解腦缺血再灌注損傷后引起的腦組織損傷。Fas、FasL在腦組織缺血后，迅速表達(dá)促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞凋亡，擴(kuò)大了梗死體積，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，不同濃度的失荅剌知丸較模型組相比，能夠明顯下調(diào)海馬區(qū)Fas、FasL蛋白表達(dá)，較金納多組相比，高劑量失荅剌知丸阻抑Fas、FasL蛋白表達(dá)作用更強(qiáng)。由此可見(jiàn)，失荅剌知丸可以通過(guò)降低Fas、FasL蛋白表達(dá)以減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，為臨床回醫(yī)藥防治缺血性腦血管疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2015.12.22）