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    氯化鋰聯(lián)合hUC-MSCs移植對(duì)阿爾茨海默病小鼠的治療作用

    2016-04-19 07:21:26馬珊珊王欣欣宋及時(shí)黃團(tuán)結(jié)關(guān)方霞1
    關(guān)鍵詞:氯化鋰阿爾茨海默病小鼠

    孟 楠,馬珊珊,王欣欣,姚 寧,邢 衢,宋及時(shí),黃團(tuán)結(jié),關(guān)方霞1,#

    1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州450052 2)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450001

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    氯化鋰聯(lián)合hUC-MSCs移植對(duì)阿爾茨海默病小鼠的治療作用

    孟楠1),馬珊珊2),王欣欣1),姚寧2),邢衢2),宋及時(shí)2),黃團(tuán)結(jié)2),關(guān)方霞1,2)#

    1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州4500522)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450001

    關(guān)鍵詞氯化鋰;Wnt/β-catenin通路;干細(xì)胞移植;阿爾茨海默?。恍∈?/p>

    摘要目的:研究氯化鋰(LiCl)聯(lián)合人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)移植對(duì)阿爾茨海默病小鼠(APP+轉(zhuǎn)基因小鼠)的干預(yù)作用。方法:PCR鑒定為APP+轉(zhuǎn)基因小鼠40只隨機(jī)分為4組:APP+組、hUC-MSCs移植組、LiCl注射組、聯(lián)合處理組(LiCl注射+hUC-MSCs移植)。處理1個(gè)月后,Morris水迷宮檢測(cè)小鼠的認(rèn)知水平,酶標(biāo)儀法和分光光度法檢測(cè)小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)小鼠海馬組織中Wnt/β-catenin通路相關(guān)因子的表達(dá)。結(jié)果:與APP+組比較,LiCl注射組APP+小鼠逃避潛伏期縮短,穿越平臺(tái)次數(shù)增多,平臺(tái)所在象限停留時(shí)間延長(zhǎng),MDA含量下降,小鼠海馬組織中β-catenin、c-Myc mRNA和蛋白表達(dá)量增加,GSK-3β mRNA和蛋白表達(dá)量降低(P均<0.05); hUC-MSCs移植可使APP+小鼠血清中SOD活性升高(P均<0.05),其他指標(biāo)的變化與LiCl注射組相同;LiCl注射聯(lián)合hUC-MSCs移植對(duì)平臺(tái)所在象限停留時(shí)間、MDA含量、c-Myc蛋白表達(dá)的影響具有協(xié)同效應(yīng)(P<0.05)。結(jié)論:LiCl聯(lián)合 hUC-MSCs移植對(duì)APP+轉(zhuǎn)基因小鼠具有明顯的治療作用。

    Effect of lithium chloride combined with hUC-MSCs transplantation on Alzheimer's disease mouse

    MENGNan1),MAShanshan2),WANGXinxin1),YAONing2),XINGQu2),SONGJishi2),HUANGTuanjie2),GUANFangxia1,2)

    1)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)StemCellLaboratory,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

    Key wordslithium chloride;Wnt/β-catenin pathway;stem cell transplantation;Alzheimer′s disease;mouse

    AbstractAim: To research the effects of lithium chloride(LiCl) combined with human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs) transplantation on Alzheimer's disease model mice(APP+transgenic mice) and the potential mechanism. Methods: A total of 40 APP+mice identified by PCR were allocated into 4 groups randomly:APP+group, hUC-MSCs group, LiCl group and LiCl combined with hUC-MSCs group.After 1 month, all mice were to study the learning and memory ability by Morris water maze test, the activity of superoxide dismutase(SOD) and the concentration of malonaldehyde(MDA) in the serum were determined by microplate spectrophotometer and ultraviolet spectrophotometer, the mRNA and proteins associated with Wnt/β-catenin pathway were detected by qRT-PCR and Western blot. Results: Compared with APP+group, the escaping latency was significantly shorter, the times of crossing platform was significantly increased and the time spent in the platform quadrant was significantly longer,MDA concentration was decreased,the expressions of β-catenin and c-Myc mRNA and proteins in the hippocampus tissue were increased, while GSK-3β mRNA and proteins expression was decreased in LiCl group; in hUC-MSCs group,the changing trend of the indexes mentioned above were similar with the LiCl group, and the activity of SOD in serum increased; hUC-MSCs transplantation and LiCl had synergistic effects on the time spent in the platform quadrant, MDA concentration and c-Myc protein expression(P<0.05). Conclusion: LiCl combined with hUC-MSCs transplantation has therapeutic effects on APP+transgenic mice.

    阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是與年齡直接相關(guān)的癡呆類型,影響著全世界約3 500萬人口,預(yù)計(jì)到2050年患者將達(dá)到1億[1]。因此,AD是世界范圍內(nèi)亟待解決的健康問題[2]。隨著干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,關(guān)于干細(xì)胞治療AD的研究也越來越多。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)具有取材方便、低免疫原性、倫理學(xué)爭(zhēng)議小[3]等特點(diǎn)。前期研究[4]發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs移植可以明顯改善APP+轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,但其分子機(jī)制尚不明確。研究[5]顯示激活Wnt/β-catenin通路可以促進(jìn)成人腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生,調(diào)節(jié)突觸形成與發(fā)育。氯化鋰(lithium chloride,LiCl)是Wnt/β-catenin通路激活劑,可以直接抑制GSK-3β,促進(jìn)β-catenin在細(xì)胞內(nèi)累積[6]。此外,LiCl作為治療雙相情感障礙最重要的藥物[7],在臨床應(yīng)用已有100多年,其安全性已得到有效證實(shí)。因此,該研究以APP+轉(zhuǎn)基因小鼠為模型,觀察LiCl聯(lián)合hUC-MSCs移植對(duì)AD的治療作用,并初步探討其分子機(jī)制。

    1材料與方法

    1.1試劑及儀器hUC-MSCs由課題組前期凍存。DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自寶信生物科技有限公司,胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gemini公司,LiCl購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,DNA小提試劑盒、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司,APP、GSK-3β、β-catenin、c-Myc引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,兔抗人GSK-3β、β-catenin、c-Myc多克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,血清SOD活性測(cè)定試劑盒及血清MDA含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司。

    1.2APP+轉(zhuǎn)基因小鼠的來源及鑒定4月齡清潔級(jí)APP695v717I轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物所。剪取小鼠尾巴約0.5 cm,用DNA小提試劑盒提取DNA,PCR擴(kuò)增APP基因(擴(kuò)增引物為:5’-CCCTGAACCTGAAACATAAAAT-3’和5’-GC TACGAAAATCCAACCTACAA-3’,產(chǎn)物大小284 bp),瓊脂糖凝膠電泳。經(jīng)PCR鑒定,共獲得40只APP+小鼠。

    1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理將APP+轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為APP+組、hUC-MSCs移植組、LiCl注射組、聯(lián)合處理組,每組10只。hUC-MSCs移植組:APP+小鼠尾靜脈注射細(xì)胞濃度為5×106mL-1的第3代hUC-MSCs細(xì)胞懸液0.2 mL;LiCl注射組:APP+小鼠每天腹腔注射0.03 g/kg的LiCl,連續(xù)注射1個(gè)月;聯(lián)合處理組:APP+小鼠先尾靜脈注射hUC-MSCs細(xì)胞懸液,再連續(xù)1個(gè)月每天腹腔注射LiCl;APP+組:尾靜脈注射0.2 mL生理鹽水。

    1.4小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)定小鼠用Morris水迷宮水池直徑120 cm,平臺(tái)直徑9 cm,分為4個(gè)象限,平臺(tái)所在象限為第一象限,水池內(nèi)水不透明,水溫控制在19~20 ℃,水放至淹沒平臺(tái)1 cm,每個(gè)象限最長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間為60 s,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后在平臺(tái)上停留10 s,擦干,回籠。每只小鼠每天在不同象限固定位置入水,連續(xù)訓(xùn)練5 d,3次/d;第6天開始進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn),即撤去平臺(tái),分別從4個(gè)象限將小鼠于訓(xùn)練時(shí)的固定位置放入水池中,觀察并利用攝像采集器記錄小鼠游泳軌跡,統(tǒng)計(jì)穿越平臺(tái)次數(shù)、逃避潛伏期(即第一次到達(dá)平臺(tái)所在位置所用時(shí)間)和平臺(tái)所在象限停留時(shí)間。

    1.5小鼠血清SOD活性、MDA含量的測(cè)定Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,各組分別隨機(jī)選取3只小鼠,活體心臟取血,3 000 r/min離心5 min,收集上清,-80 ℃保存。根據(jù)試劑盒說明書推薦方法,采用酶標(biāo)儀法測(cè)定小鼠血清SOD活性,采用分光光度法檢測(cè)血清MDA含量。

    1.6小鼠海馬組織中Wnt通路相關(guān)基因mRNA的檢測(cè)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,各組分別選取3只小鼠,處死后取出腦組織,分離出海馬,組織勻漿。根據(jù)說明書設(shè)定的程序采用qRT-PCR檢測(cè)Wnt通路相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。以小鼠GAPDH為內(nèi)參。Trizol裂解法提取組織總RNA,分光光度計(jì)測(cè)RNA濃度,然后于-80 ℃條件下分裝保存;取500 ng總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,以此為模板,進(jìn)行熒光定量PCR。引物序列及產(chǎn)物大小見表1。反應(yīng)結(jié)束后觀察擴(kuò)增曲線和溶解曲線,采用比較CT法(ΔΔCT)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每組3個(gè)復(fù)孔,每個(gè)目的mRNA重復(fù)測(cè)定3次。

    表1 引物序列及產(chǎn)物

    1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù),應(yīng)用析因設(shè)計(jì)的方差分析對(duì)4組小鼠的水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果、海馬組織中Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)水平、血清中SOD活性及MDA含量進(jìn)行比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

    2結(jié)果

    2.14組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較見表2。與APP+組相比,其他3組小鼠的逃避潛伏期縮短,穿越平臺(tái)次數(shù)以及平臺(tái)所在象限停留時(shí)間均增加,且聯(lián)合處理組改變更為明顯。

    表2 4組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試結(jié)果

    2.24組小鼠血清SOD活性及MDA含量的比較

    見表3。與APP+組相比,hUC-MSCs移植使小鼠血清中SOD活性增加,MDA含量下降,LiCl注射對(duì)血清中SOD活性無明顯影響;但可使MDA含量降低,且與hUC-MSCs移植存在協(xié)同作用。

    2.34組小鼠海馬組織中Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因mRNA的表達(dá)見表4。LiCl注射和hUC-MSCs移植可使APP+小鼠海馬組織中β-catenin、c-Myc mRNA表達(dá)量升高, GSK-3β mRNA表達(dá)量下降,但兩者之間無交互作用。

    表3 4組小鼠血清SOD活性及MDA含量的比較

    表4 4組小鼠海馬組織中

    2.44組小鼠海馬組織中Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的表達(dá)見圖1、表5。

    APP+:APP+組;MSC:hUC-MSCs移植組;Li:LiCl注射組;Li+M:聯(lián)合處理組。圖1 4組小鼠海馬組織中Wnt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

    組別nGSK-3ββ-cateninc-MycAPP+組31.44±0.040.60±0.030.39±0.02hUC-MSCs移植組31.28±0.021.20±0.030.84±0.03LiCl注射組30.85±0.051.44±0.071.12±0.02聯(lián)合處理組30.62±0.062.15±0.061.96±0.06F注射(P)166.917(<0.001)328.284(<0.001)590.151(<0.001)F移植(P)8.576(0.008)177.072(<0.001)286.769(<0.001)F交互(P)2.638(0.120)1.225(0.281)25.228(<0.001)

    由圖1、表5可以看出,LiCl注射和hUC-MSCs移植可增強(qiáng)小鼠海馬組織中β-catenin、c-Myc蛋白的表達(dá), 降低GSK-3β蛋白的表達(dá),兩者聯(lián)合處理對(duì)c-Myc蛋白表達(dá)的影響具有協(xié)同作用。

    3討論

    前期研究[8]發(fā)現(xiàn)LiCl對(duì)脊髓損傷大鼠具有修復(fù)作用,但是LiCl對(duì)AD的治療作用國(guó)內(nèi)尚無報(bào)道。該研究顯示,LiCl腹腔注射能明顯提高APP+轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知能力,與文獻(xiàn)[9-10]結(jié)論一致;而且與單獨(dú)治療組相比,hUC-MSCs移植聯(lián)合LiCl的治療效果更明顯。

    AD的一種病理機(jī)制為自由基引起的過氧化損傷。有研究[11]顯示,干細(xì)胞移植可以有效降低阿爾茨海默病小鼠血清中過氧化終末產(chǎn)物MDA的含量,增加血清中SOD活性。此次實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了該項(xiàng)結(jié)論。該研究結(jié)果顯示,LiCl腹腔注射能有效降低APP+小鼠血清MDA含量,但無提高SOD活性的作用;LiCl聯(lián)合hUC-MSCs對(duì)MDA含量的影響具有協(xié)同作用

    目前,干細(xì)胞治療AD的可能機(jī)制主要有細(xì)胞替代[12]、介導(dǎo)清除β淀粉樣蛋白、分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs移植可以促進(jìn)β-catenin、c-Myc的表達(dá),降低GSK-3β的表達(dá),表明hUC-MSCs移植可能通過激活Wnt/β-catenin通路,從而提高APP+轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知能力。LiCl也可以通過激活Wnt/β-catenin通路對(duì)AD起到治療作用[6]。此次試驗(yàn)證實(shí)了上述結(jié)論,但兩者聯(lián)合應(yīng)用雖然可以改善相關(guān)指標(biāo),但是并無明顯的協(xié)同作用??赡艿脑?yàn)椋孩賹?shí)驗(yàn)的樣本量有限,可能還不足以揭示兩者之間的協(xié)同作用。②LiCl和hUC-MSCs對(duì)AD的聯(lián)合治療作用可能并不僅僅通過激活Wnt/β-catenin通路實(shí)現(xiàn),或者由于其他因素的干擾導(dǎo)致兩者對(duì)Wnt/β-catenin通路的協(xié)同作用表現(xiàn)不明顯。

    綜上所述,hUC-MSCs移植可以激活Wnt/β-catenin通路,提高血清SOD活性,降低血清MDA含量,改善APP+小鼠的認(rèn)知能力;LiCl腹腔注射亦可激活Wnt/β-catenin通路,降低血清中MDA含量,對(duì)AD起到治療作用;兩者聯(lián)合治療效果有協(xié)同增強(qiáng)的趨勢(shì),具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

    參考文獻(xiàn)

    [1]INESTROSA NC,VARELA-NALLAR L.Wnt signaling in the nervous system and in Alzheimer′s disease[J].J Mol Cell Biol,2014,6(1):64

    [2]MAYEUX R.S1-03-05 Epidemiology of Alzheimer's disease[J].Neurobiology of Aging,2004,25(Suppl2):S6

    [3]MOSHREFI M,YARI N,NABIPOUR F,et al.Transplantation of differentiated umbilical cord mesenchymal cells under kidney capsule for control of type I diabetes in rat[J].Tissue Cell,2015,47(4):395

    [4]崔淵博,馬珊珊,姚寧,等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)老年癡呆小鼠腦、肝組織中衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2015,50(1):25

    [5]VARELA-NALLAR L,INESTROSA NC.Wnt signaling in the regulation of adult hippocampal neurogenesis[J].Front Cell Neurosci,2013,7:100

    [6]TOLEDO EM,INESTROSA NC.Activation of Wnt signaling by lithium and rosiglitazone reduced spatial memory impairment and neurodegeneration in brains of an APPswe/PSEN1DeltaE9 mouse model of Alzheimer's disease[J].Mol Psychiatry,2010,15(3):272

    [7]KAGAYA A,OKADA A,TAWARA Y,et al.Lithium chloride inhibits thrombin-induced intracellular calcium mobilization in C6 rat glioma cells[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2000,24(1):85

    [8]張立群.帶神經(jīng)干細(xì)胞的周圍神經(jīng)移植聯(lián)合氯化鋰治療大鼠脊髓損傷的研究[D].福州:福建醫(yī)科大學(xué),2013.

    [9]YAN Y,MA T,GONG K,et al.Adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation promotes adult neurogenesis in the brains of Alzheimer's disease mice[J].Neural Regen Res,2014,9(8):798

    [10]DE FERRARI GV,CHACN MA,BARRA MI,et al.Activation of Wnt signaling rescues neurodegeneration and behavioral impairments induced by beta-amyloid fibrils[J].Mol Psychiatry,2003,8(2):195

    [11]崔淵博.高表達(dá)Sirt2人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)APP~+鼠的抗衰老作用及機(jī)制研究[D].鄭州:鄭州大學(xué),2014.

    [12]HERLENIUS E,THONABULSOMBAT C,FORSBERG D,et al.Functional stem cell integration assessed by organotypic slice cultures[J].Curr Protoc Stem Cell Biol,2012(2):13

    [13]MA T,GONG K,AO Q,et al.Intracerebral transplantation of adipose-derived mesenchymal stem cells alternatively activates microglia and ameliorates neuropathological deficits in Alzheimer's disease mice[J].Cell Transplant,2013,22(Suppl 1):S113

    [14]OH SH,KIM HN,PARK HJ,et al.Mesenchymal stem cells increase hippocampal neurogenesis and neuronal differentiation by enhancing the Wnt signaling pathway in an Alzheimer's disease model[J].Cell Transplant,2015,24(6):1097

    中圖分類號(hào)R592

    #通信作者,女,1969年2月生,博士,教授,研究方向:干細(xì)胞與神經(jīng)修復(fù),E-mail:guanfangxia@126.com

    doi:10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.005

    *國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目81471306,U1404313;河南省高??萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目15IRTSTHN022;河南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃項(xiàng)目154

    200510008

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