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    二甲雙胍對宮頸癌Hela細胞Twist及E-cadherin表達的影響及機制

    2016-04-18 00:46:55湯軼孫曉紅
    山東醫(yī)藥 2016年9期
    關(guān)鍵詞:白細胞介素6二甲雙胍上皮

    湯軼,孫曉紅

    (南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院,湖南衡陽421000)

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    二甲雙胍對宮頸癌Hela細胞Twist及E-cadherin表達的影響及機制

    湯軼,孫曉紅

    (南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院,湖南衡陽421000)

    摘要:目的觀察二甲雙胍處理后宮頸癌Hela細胞JAK/STAT3信號通路調(diào)節(jié)靶基因Twist及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標志物E-cadherin的表達變化,并探討其機制。方法 宮頸癌Hela細胞培養(yǎng)后分別經(jīng)IL-6(IL-6組)、二甲雙胍(二甲雙胍組)及IL-6+二甲雙胍(IL-6+二甲雙胍組)處理48 h,未處理細胞作對照組,觀察各組細胞形態(tài)學(xué)變化,檢測細胞壞死情況,Western blotting法檢測p-STAT3、Twist及E-cadherin蛋白表達,RT-PCR法檢測Twist、E-cadherin mRNA表達。結(jié)果IL-6組Hela細胞向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變,而IL-6+二甲雙胍組Hela細胞未向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變且細胞壞死。IL-6組、IL-6+二甲雙胍組p-STAT3、Twist、E-cadherin蛋白表達及Twist、E-cadherin mRNA表達與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05),而二甲雙胍組以上指標與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 二甲雙胍可通過阻斷JAK/STAT3信號通路降低宮頸癌Hela細胞Twist及E-cadherin的表達。

    關(guān)鍵詞:宮頸腫瘤;二甲雙胍;白細胞介素6;JAK/STAT3信號通路;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

    在腫瘤細胞中,多種因素可持續(xù)激活JAK/STAT3信號通路,促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。細胞因子如IL-6,通過激活STAT3,促進腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),增強腫瘤細胞對免疫系統(tǒng)的侵襲作用[1~3]。腫瘤細胞EMT特征性表現(xiàn)是E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達缺失,最終使細胞黏附能力下降,侵襲和遷移能力增強。近年來研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍具有抗腫瘤作用及降低腫瘤發(fā)病風(fēng)險,并能提高腫瘤患者的存活率[4~8]。但是,二甲雙胍的抗腫瘤機制尚不完全清楚。2014年1~10月,本研究觀察二甲雙胍對宮頸癌Hela細胞Twist及E-cadherin表達的影響,并探討其機制。

    1材料與方法

    1.1材料RPMI1640(Hyclone),胎牛血清(四季青公司),胰蛋白酶、RIPA裂解液(碧云天公司),人IL-6(Peprotech),二甲雙胍(Sigma),死活細胞染色試劑盒(凱基);單克隆抗體Twist、E-cadherin、p-stat3(Abcam),RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒(Qiagen);CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma);倒置顯微鏡 IX71、熒光顯微鏡(Olympus);生物安全柜(Thermo Scientific);逆轉(zhuǎn)錄及PCR儀(Bio-Rad)。

    1.2Hela細胞培養(yǎng)Hela細胞由南華大學(xué)腫瘤研究所提供,用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng),待細胞長滿6孔板后,分別采用含50 ng/mL IL-6(IL-6組)、10 mmol/L二甲雙胍(二甲雙胍組)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,先用含50 ng/mL IL-6的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,再用含10 mmol/L二甲雙胍(IL-6+二甲雙胍組)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,對照組則采用單純培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

    1.3細胞染色各組細胞處理48 h,按死活細胞染色試劑盒要求進行染色,活細胞呈現(xiàn)綠色熒光,壞死細胞呈現(xiàn)橙色熒光,熒光顯微鏡下觀察各組細胞染色情況。

    1.4細胞p-STAT3、Twist及E-cadherin蛋白表達檢測采用Western blotting法。各組細胞處理48 h,提取總蛋白,測定蛋白濃度,上樣,跑膠,轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗孵育,洗膜,二抗孵育,顯色,成像。用Image Lab軟件測量目標蛋白條帶的灰度值,與內(nèi)參的灰度值進行比較,取對比值作為目標蛋白相對表達量。以上實驗重復(fù)3次取均值。

    1.5細胞Twist、E-cadherin mRNA表達檢測采用RT-PCR法。各組細胞處理48 h,按照試劑盒要求提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并按以下條件進行PCR:95℃ 5 min, 95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s,擴增40個循環(huán)。其中GAPDH為內(nèi)參基因, Twist引物序列F:5′-CGTTTCCAGGAGGCCTGGCG-3、R:5′-GCGAGA-CTGGCGAGCTGGAC-3;E-cadherin引物序列F:5′-GGGTTATTCCTCCCATCAGC-3、R:5′- ATTCGGGCTTGTTGTCATTC-3;GAPDH引物序列F:5′-CTTCTA-CAATGAGCTGCGTG-3,R:5′-TCATGAGGTAGTCAGT-CAGG-3。以2-ΔΔCt公式計算Twist、E-cadherin mRNA相對表達量。

    2結(jié)果

    2.1各組細胞形態(tài)學(xué)變化Hela細胞經(jīng)處理48 h,對照組細胞橢圓形,緊密排列;IL-6組細胞間隙明顯增寬,細胞呈紡錘狀和長梭形,排列散亂,可見Hela細胞向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變;二甲雙胍組細胞形態(tài)圓形,細胞成團堆積,較多凋亡細胞漂??;IL-6+二甲雙胍組細胞形態(tài)圓形、長梭形,細胞核疏松,細胞成團漂浮。

    2.2各組細胞染色結(jié)果Hela細胞經(jīng)處理48 h,對照組、IL-6組只有少量細胞壞死,二甲雙胍組有較多細胞壞死,而IL-6+二甲雙胍組全為壞死細胞(細胞成片漂浮)。

    2.3各組細胞p-STAT3、Twist及E-cadherin蛋白表達比較見表1。

    表1 各組細胞p-STAT3、Twist及E-cadherin蛋白

    注:與對照組比較,*P<0.05。

    2.4各組細胞Twist、E-cadherin mRNA表達比較見表2。

    表2 各組細胞Twist、E-cadherin mRNA

    注:與對照組比較,*P<0.05。

    3討論

    在腫瘤細胞中,細胞因子、生長因子、炎癥因子等通過改變腫瘤微環(huán)境,調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),影響腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。腫瘤微環(huán)境中重要的炎癥因子,能通過與相應(yīng)受體特異性結(jié)合,調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo),通過持續(xù)激活JAK/STAT3信號通路調(diào)節(jié)靶基因Twist及EMT相關(guān)標志物蛋白如E-cadherin表達,導(dǎo)致細胞向間質(zhì)表型改變,促進腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移[1~3]。本研究發(fā)現(xiàn),用重組人IL-6處理宮頸癌Hela細胞,出現(xiàn)細胞間隙增寬,呈紡錘狀或長梭形,細胞核顏色變深,誘導(dǎo)Hela細胞向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變。在蛋白及基因表達水平,我們發(fā)現(xiàn),用IL-6處理Hela細胞后,STAT3磷酸化水平升高,并使相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Twist蛋白及基因表達上調(diào),EMT相關(guān)標志蛋白E-cadherin蛋白及基因表達下調(diào),與相關(guān)研究[9]結(jié)果一致。

    二甲雙胍是臨床廣泛應(yīng)用的抗2型糖尿病藥物。有研究報道,二甲雙胍能通過阻斷JAK/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)節(jié)細胞凋亡及自噬相關(guān)基因的表達,調(diào)節(jié)與肝腫瘤細胞、乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及蛋白的表達而逆轉(zhuǎn)EMT,抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移,最終抑制腫瘤進展[3,10]。在肝癌細胞中,二甲雙胍和蛋白激酶(AMPK)激活劑都能抑制IL-6誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),并且能通過腺苷-磷酸激活A(yù)MPK途徑調(diào)節(jié)IL-6/gp130/JAK/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo),從而調(diào)節(jié)促炎癥因子的表達[11~13]。本研究發(fā)現(xiàn),IL-6+二甲雙胍組宮頸癌Hela細胞形態(tài)由狹長變圓,細胞核松散,出現(xiàn)核碎裂,壞死細胞大量漂浮,比單獨使用二甲雙胍對Hela細胞凋亡的促進作用更顯著??梢?,單獨使用二甲雙胍處理Hela細胞,不能明顯降低STAT3磷酸化水平、Twist蛋白及Twist mRNA表達、上調(diào)E-cadherin蛋白及mRNA表達。IL-6處理Hela細胞后加入二甲雙胍,使STAT3磷酸化水平降低、Twist蛋白及mRNA表達降低,逆轉(zhuǎn)Hela細胞EMT,與文獻報道一致;但是E-cadherin蛋白及mRNA表達較對照組不升反降,與文獻研究結(jié)果相反。我們分析,用IL-6、二甲雙胍聯(lián)合處理宮頸癌Hela細胞,通過抑制JAK/STAT3信號通路,誘導(dǎo)細胞壞死,導(dǎo)致總體細胞量減少,使細胞總蛋白及總mRNA減少,最終導(dǎo)致E-cadherin蛋白及mRNA表達降低。以上研究結(jié)果證明,二甲雙胍以JAK/STAT3信號通路為靶點,阻斷JAK/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制宮頸癌細胞EMT。

    綜上所述, IL-6能促進Hela細胞向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變,而二甲雙胍可通過JAK/STAT3信號通路逆轉(zhuǎn)宮頸癌Hela細胞EMT,為臨床二甲雙胍治療宮頸癌提供了新思路,但其具體機制及可行性還有待進一步研究證明。

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    (收稿日期:2015-10-11)

    中圖分類號:R737.33

    文獻標志碼:A

    文章編號:1002-266X(2016)09-0031-03

    doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.011

    通信作者:孫曉紅(E-mail:csxtt@sina.com)

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