紅景天苷體外灌流對(duì)大鼠心肌細(xì)胞膜鈉通道電流的影響

黃媛恒，謝劍，黃創(chuàng)明，韋仙琴，林心媚，劉芳銘，李映新

(1廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530021；2廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院)

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紅景天苷體外灌流對(duì)大鼠心肌細(xì)胞膜鈉通道電流的影響

黃媛恒1，謝劍1，黃創(chuàng)明1，韋仙琴1，林心媚1，劉芳銘1，李映新2

(1廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530021；2廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院)

摘要：目的觀察紅景天苷體外灌流對(duì)SD大鼠心肌細(xì)胞膜鈉通道電流(INa)的影響。方法 SD大鼠頸部脫臼處死后，開胸剪斷主動(dòng)脈并取下心臟，采用Langendorff 逆行主動(dòng)脈灌流法急性分離SD大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞，置于培養(yǎng)皿，以電極外液灌流沖洗。置入微電極，充灌電極內(nèi)液，采用全細(xì)胞模式的膜片鉗技術(shù)檢測(cè)INa，電流穩(wěn)定后灌注紅景天苷100 μmol/L，再次檢測(cè)INa。繪制電流-電壓關(guān)系(I-V)曲線、穩(wěn)態(tài)激活曲線及穩(wěn)態(tài)失活曲線，觀察灌流前后大鼠心肌細(xì)胞INa及相關(guān)曲線的變化。結(jié)果紅景天苷灌流后INa幅值增加。紅景天苷灌流后INa I-V曲線下移，但不改變I-V曲線形狀、最大激活電位和反轉(zhuǎn)電位。紅景天苷灌流前后INa密度最大峰值分別為(-29.71±4.37)、(-58.66±8.21)pA/pF，灌流前后相比，P<0.05。紅景天苷灌流前后INa穩(wěn)態(tài)失活曲線的半數(shù)失活電壓分別為(-66.67±1.57)、(-61.45±1.57)mV，半數(shù)失活電壓向正值方向移動(dòng)，斜率因子分別為-10.23±1.30、-7.71±1.12，灌流前后半數(shù)失活電壓相比，P<0.05。紅景天苷灌流前后INa穩(wěn)態(tài)激活曲線半數(shù)激活電壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 紅景天苷體外灌流可使SD大鼠心肌細(xì)胞膜INa的I-V曲線下移，增加電流幅值，該作用可能與紅景天苷增加鈉通道失活電位、抑制電流失活有關(guān)。

關(guān)鍵詞：紅景天苷；心肌細(xì)胞；細(xì)胞膜離子通道；鈉通道；鈉通道電流；全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

紅景天是景天科景天屬多年生草本植物，有益氣活血、通脈止痛功效[1]，其主要活性成分為紅景天苷。研究[2~8]發(fā)現(xiàn)，紅景天苷具有抗氧化應(yīng)激、改善微循環(huán)、增加缺血-再灌注心臟冠脈血流量、增強(qiáng)心肌收縮力、抗心律失常、改善缺血心肌功能等多種作用。心肌細(xì)胞電生理異常是心肌缺血-再灌注損傷及再灌注后心律失常發(fā)生的分子機(jī)制之一。紅景天苷可抑制心肌缺血損傷后動(dòng)作電位幅度下降，推測(cè)此作用與鈉通道電流(INa)的增加有關(guān)，但尚未經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。2015年1~8月，我們分離大鼠心肌細(xì)胞，體外給予紅景天苷灌流，觀察灌流前后INa變化，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料SPF級(jí)SD大鼠6只，雌雄不限，體質(zhì)量(200±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。紅景天苷(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)20131121，HPLC≥98%)，Ⅱ型膠原酶、MgAIP、EGTA(Sigma公司)，BSA(Gibico公司)(Sigma公司)，HEPES(Amresco公司)，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。無(wú)鈣臺(tái)氏液(mmol/L)：NaCl 136，KCl 5.4，MgC12·6H2O 1.0，NaH2PO4·2H2O 0.33，HEPES 10，Glucose 10，用NaOH調(diào)至pH 7.4。消化液為含Ⅱ型膠原酶10 mg、BSA 10 mg的無(wú)鈣臺(tái)氏液(30 mL)。KB液(mmol/L)：KOH 70，KCl 40，KH2PO420，MgC12·6H2O 3.0，HEPES 10，Tauringe 20，EGTA 0.5，L-glutamic acid 50，Glucose 10，用KOH調(diào)至pH 7.4。電極外液(mmol/L)：NaCl 20， CsCl 120，MgCl21，CaCl20.5，Glucose 10，HEPES 10，用CsOH調(diào)至pH 7.4；電極內(nèi)液(mmol/L)：NaCl 5， CsCl 20，CsF 110，MgCl21，HEPES 5，EGTA 5，MgATP 5，用CsOH調(diào)至pH 7.2。EPC10放大器(HEKA公司)，P-97拉制儀(Sutter公司)，玻璃電極(武漢微探科學(xué)儀器有限公司)。

1.2心肌細(xì)胞分離大鼠頸部脫臼處死，迅速開胸，剪斷主動(dòng)脈并取下心臟，按主動(dòng)脈逆行插管將心臟掛于Langendorff裝置灌流，流速8 mL/min，灌流液持續(xù)通氧并保持出口處37 ℃恒溫。以無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流至流出液澄清，再用消化液灌流至心臟松軟，即刻剪取心室部分組織于KB液中吹打并過(guò)200目篩網(wǎng)，過(guò)濾液自然沉降后棄上清液，加入新鮮KB液復(fù)懸，于-4 ℃冰箱保存，用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

1.3紅景天苷灌流方法及心肌INa檢測(cè)吸取心肌細(xì)胞懸液于培養(yǎng)皿中靜置，待細(xì)胞貼壁后，用電極外液灌流沖洗5 min，流速1.5 mL/min。微電極經(jīng)拉制儀三步拉制而得，充灌電極內(nèi)液后電阻為2~5 MΩ，采用全細(xì)胞模式的膜片鉗技術(shù)記錄INa。采用保持電位為-90 mV、指令電壓為-120~+25 mV、時(shí)程為50 ms、階躍為5 mV的刺激程序引出一內(nèi)向電流，該電流能被30 μmol/L河豚毒素阻斷，證實(shí)為INa。待電流穩(wěn)定后，以相同流速轉(zhuǎn)換含100 μmol/L紅景天苷的電極外液灌流沖洗細(xì)胞5 min。通過(guò)Pulsefit軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換輸出。

1.4INa相關(guān)曲線的繪制分別于紅景天苷灌流前后繪制相關(guān)曲線。①采用Sigmaplot軟件繪制電流-電壓關(guān)系(I-V)曲線。②穩(wěn)態(tài)激活曲線由I-V曲線數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成膜電導(dǎo)并作圖獲得；用Boltzmann方程G/Gmax=1/{1+exp[-(V-V1/2)/k]}對(duì)曲線進(jìn)行擬合，其中G為各個(gè)電壓下的膜電導(dǎo)，Gmax為最大膜電導(dǎo)，V1/2為半數(shù)激活電壓，k為斜率因子。③由雙脈沖刺激獲得穩(wěn)態(tài)失活曲線；雙脈沖刺激參數(shù)：保持電位-90 mV，先給-120~+30 mV、階躍為10 mV、時(shí)程為50 ms的條件脈沖，然后緊跟一去極化至10 mV、持續(xù)時(shí)間10 ms的測(cè)試脈沖；用Boltzmann方程I/Imax=1/{1+exp[(V-V1/2)/k]}對(duì)激活曲線進(jìn)行擬合，其中I為測(cè)試脈沖引出峰電流值，V1/2為半數(shù)失活電壓，k為斜率因子。

2結(jié)果

2.1紅景天苷灌流前后大鼠心肌細(xì)胞INa及I-V曲線變化紅景天苷灌流后INa幅值增加。紅景天苷灌流后INa I-V曲線下移，但不改變I-V曲線形狀、最大激活電位和反轉(zhuǎn)電位。灌流前INa的電流密度在膜電位-40 mV達(dá)到最大峰值[(-29.71±4.37)pA/pF]，灌流后電流密度最大峰值為(-58.66±8.21)pA/pF，灌流前后電流密度最大峰值相比，P<0.05。見圖1。

2.2紅景天苷灌流前后大鼠心肌細(xì)胞INa穩(wěn)態(tài)激活曲線變化紅景天苷灌流前后INa穩(wěn)態(tài)激活曲線V1/2分別為(-54.90±0.18)、(-53.66±0.21)mV，k分別為2.30±0.17、2.84±0.19，灌流前后V1/2相比，P>0.05。見圖2。

圖1　紅景天苷灌流前后INa I-V曲線變化

圖2　紅景天苷灌流前后INa穩(wěn)態(tài)激活曲線變化

2.3紅景天苷灌流前后大鼠心肌細(xì)胞INa穩(wěn)態(tài)失活曲線變化紅景天苷灌流前后INa穩(wěn)態(tài)失活曲線V1/2分別為(-66.67±1.57)、(-61.45±1.57)mV，V1/2向正值方向移動(dòng)，k分別為-10.23±1.30、-7.71±1.12，灌流前后V1/2相比，P<0.05。

圖3　紅景天苷灌流前后INa穩(wěn)態(tài)失活曲線變化

3討論

缺血-再灌注損傷可使心肌細(xì)胞各種離子通道和離子交換體的功能平衡被打破，導(dǎo)致心肌細(xì)胞離子濃度和能量失衡，刺激心室結(jié)構(gòu)重塑和功能改變[9]。研究[10]發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌細(xì)胞缺氧時(shí)INa減小，復(fù)氧后INa進(jìn)一步降低。另有研究[11~15]表明，缺氧可使INa減小，隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，鈉通道的激活和失活時(shí)間也延長(zhǎng)，再灌注后雖然INa激活時(shí)間恢復(fù)較快，但失活時(shí)間并不立即恢復(fù)?？焘c通道活性的降低使鈉離子快速內(nèi)流受阻，心肌興奮性降低、興奮性恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞靜息電位下降可降低動(dòng)作電位0相除極上升速度，導(dǎo)致沖動(dòng)傳導(dǎo)減慢，繼而引起心肌細(xì)胞各種離子通道功能異常，易誘發(fā)折返性心律失常[16]。

紅景天苷是高原藏藥紅景天的主要活性成分。紅景天苷可明顯提高缺氧/復(fù)氧和氧化損傷的心肌細(xì)胞存活率，降低培養(yǎng)液中LDH、CK水平[17]；還能改善急性血瘀模型大鼠的血液流變學(xué)，增加缺血-再灌注后大鼠離體冠脈血流，增強(qiáng)心肌收縮力[2~5]。多項(xiàng)研究[6~8]表明，紅景天苷還有防治心律失常的作用，能通過(guò)不同途徑對(duì)心肌缺血-再灌注損傷進(jìn)行干預(yù)。紅景天苷可抑制心肌缺血損傷后動(dòng)作電位幅度下降和動(dòng)作電位復(fù)極時(shí)間縮短。

本研究采用膜片鉗技術(shù)記錄大鼠心肌細(xì)胞INa，并給予紅景天苷灌流，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紅景天苷灌流后INa幅值增高，I-V曲線下移，但不改變I-V曲線的基本形狀，提示紅景天苷在不同膜電位水平對(duì)INa的作用是一致的。紅景天苷對(duì)INa激活的影響并不明顯，但能使INa失活曲線右移、增大失活電壓、減慢穩(wěn)態(tài)失活過(guò)程。由此推測(cè)，紅景天苷對(duì)INa的增強(qiáng)作用或與減慢其失活過(guò)程有關(guān)。INa幅值增加可對(duì)抗心肌缺血損傷后動(dòng)作電位幅度下降，改善缺血-再灌注后心肌細(xì)胞快鈉通道活性，調(diào)節(jié)Na+-Ca2+交換體功能，使鈣外排減少，產(chǎn)生強(qiáng)心作用，這些可能是紅景天苷抗心律失常、保護(hù)缺血-再灌注心肌的分子機(jī)制。

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(收稿日期：2015-10-21)

中圖分類號(hào)：R285. 5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)07-0031-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.07.011

通信作者：李映新(E-mail: marchimoro@yeah.net)

基金項(xiàng)目：廣西壯族自治區(qū)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410598022)。