米非司酮服用后不同時點(diǎn)早孕婦女絨毛組織形態(tài)及雌、孕激素受體表達(dá)觀察

韓華，趙紅偉，李潔，閆萍

(河北省人民醫(yī)院，石家莊050051)

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米非司酮服用后不同時點(diǎn)早孕婦女絨毛組織形態(tài)及雌、孕激素受體表達(dá)觀察

韓華，趙紅偉，李潔，閆萍

(河北省人民醫(yī)院，石家莊050051)

摘要：目的觀察米非司酮服用后不同時點(diǎn)人早孕絨毛組織形態(tài)及雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)表達(dá)變化。方法自愿要求終止早期妊娠的女性80例，隨機(jī)分為對照組、12 h組、24 h組、48 h組各20例。12 h組、24 h組、48 h組口服米非司酮150 mg，分別于服藥12、24、48 h后施行負(fù)壓吸引術(shù)，留取各組吸宮術(shù)后的絨毛組織。對照組未服用任何藥物，直接采用常規(guī)負(fù)壓吸引術(shù)終止妊娠。光鏡、透射電鏡下觀察四組絨毛組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變，采用免疫組化法檢測各組絨毛組織中的ER、PR。結(jié)果12 h組、24 h組、48 h組絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞變性、壞死甚至脫落，炎癥細(xì)胞浸潤，絨毛間質(zhì)水腫，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞。對照組、12 h組、24 h組、48 h組絨毛組織中ER相對表達(dá)量分別為0.182 4±0.007 2、0.119 1±0.005 9、0.120 8±0.011 0、0.121 2±0.007 3，各組絨毛組織中PR相對表達(dá)量分別為0.179 0±0.008 2、0.132 7±0.007 0、0.128 5±0.006 5、0.126 2±0.010 9，12 h組、24 h組、48 h組ER、PR相對表達(dá)量與對照組相比，P均<0.05。結(jié)論 米非司酮作用后12 h絨毛組織發(fā)生變性壞死，ER、PR表達(dá)受到抑制。

關(guān)鍵詞：米非司酮；雌激素受體；孕激素受體；絨毛組織

目前比較成熟的藥物流產(chǎn)方案主要為米非司酮口服并48 h后米索前列醇口服，完全流產(chǎn)率90%以上[1，2]。但這種方法所需時間較長，若能將兩藥間隔時間縮短，可大大方便患者。米非司酮通過與孕激素受體(PR)結(jié)合阻斷孕激素作用，引起蛻膜絨毛組織變性壞死，誘發(fā)流產(chǎn)。米非司酮的作用機(jī)制涉及到多個方面[3]，其中包括對絨毛組織中雌激素受體(ER)和PR表達(dá)的調(diào)節(jié)。我們觀察了米非司酮服用后不同時點(diǎn)早孕絨毛組織形態(tài)及ER、PR表達(dá)變化，探討縮短米非司酮與米索前列醇用藥間隔的可行性。

1資料與方法

1.1臨床資料河北省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科門診自愿要求終止早期妊娠的孕婦80例，年齡18~40歲；停經(jīng)<49 d；經(jīng)婦科檢查、尿妊娠試驗(yàn)及B超證實(shí)為宮內(nèi)早孕；平時月經(jīng)規(guī)律，經(jīng)量正常；半年內(nèi)未服用激素類藥物，無生殖系統(tǒng)炎癥及腫瘤。將80例研究對象隨機(jī)分為對照組、12 h組、24 h組、48 h組，每組20例。本研究已獲得患者及家屬知情同意。

1.2米非司酮用法及絨毛組織的獲取12 h組、24 h組、48 h組均口服米非司酮(25 mg/片，浙江仙居制藥股份有限公司)150 mg，分別于服藥12、24、48 h后進(jìn)行負(fù)壓吸引術(shù)。對照組未服用任何藥物，直接采用常規(guī)負(fù)壓吸引術(shù)終止妊娠。吸宮術(shù)后分別留取各組新鮮絨毛組織。

1.3絨毛組織形態(tài)觀察取新鮮絨毛組織，4%多聚甲醛固定，24 h后常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟浸透、包埋，制成蠟塊，6 μm厚切片，取4片蠟帶分別裱于涂有蛋白甘油的載玻片上，HE染色，光鏡下觀察絨毛組織形態(tài)。將收集的絨毛組織切成約1 mm3的小塊放入4%戊二醛中前固定，PBS清洗，加入1%鋨酸中后固定，乙醇梯度脫水，丙酮脫水，先后用丙酮與樹脂配比分別為3∶1、1∶1、1∶3的混合液浸透，純樹脂浸透，包埋、聚合，制作50 nm厚的超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛室溫染色，日立H-7500型透射電子顯微鏡觀察、照相。

1.4絨毛組織中ER、PR檢測采用免疫組化法檢測ER、PR，每次染色均同步設(shè)有陽性對照和陰性對照，按試劑盒說明書操作。ER、PR陽性染色為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。每張切片在光鏡(400×)下隨機(jī)選取5個不同的視野，圖像輸入電子計(jì)算機(jī)后，經(jīng)Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)處理，在相同放大倍數(shù)下，以陽性目標(biāo)平均光密度值(OD值)代表蛋白相對表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1各組絨毛組織形態(tài)學(xué)改變對照組絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，外層為合體滋養(yǎng)細(xì)胞，內(nèi)層為細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞；為單層立方形細(xì)胞，細(xì)胞界限清晰，胞質(zhì)透明，核圓、淺染；絨毛間質(zhì)疏松，可見毛細(xì)血管及梭形結(jié)締組織細(xì)胞。12 h組絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞變性、壞死甚至脫落，并見炎癥細(xì)胞浸潤，絨毛間質(zhì)水腫，內(nèi)有血液淤積和纖維素沉積。24 h組、48 h組變化基本同12 h組(見圖1)。

注：A為對照組；B為12 h組；C為24 h組；D為48 h組。

圖1各組絨毛組織形態(tài)學(xué)變化

2.2各組絨毛組織超微結(jié)構(gòu)改變對照組絨毛組織合體滋養(yǎng)細(xì)胞表面有大量微絨毛，細(xì)胞核形不規(guī)則，常染色質(zhì)豐富，核仁明顯，胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和游離核糖體，可見少量脂滴；細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞位于基膜之上，呈橢圓形，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較少；合體滋養(yǎng)細(xì)胞與細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞之間呈橋粒連接。12 h組合體滋養(yǎng)細(xì)胞表面微絨毛數(shù)量減少，細(xì)胞質(zhì)高度水腫，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，線粒體部分嵴融合、消失，游離核糖體減少，可見脂滴；細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞變扁、變小，細(xì)胞輪廓不清，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度不規(guī)則擴(kuò)張，腔內(nèi)有分泌物，有輕度脫顆?，F(xiàn)象；合體滋養(yǎng)細(xì)胞與細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞之間的連接結(jié)構(gòu)松弛，細(xì)胞間隙增寬。24 h組、48 h組超微結(jié)構(gòu)改變與12 h組相近(見圖2)。

注：A1、A2為對照組；B1、B2為12 h組；C1、C2為24 h組；D1、D2為48 h組。

圖2各組絨毛組織超微結(jié)構(gòu)改變

2.3各組絨毛組織中ER、PR表達(dá)比較對照組絨毛組織中ER相對表達(dá)量為0.182 4±0.007 2，12 h組、24 h組、48 h組分別為0.119 1±0.005 9、0.120 8±0.011 0、0.121 2±0.007 3，12 h組、24 h組、48 h組與對照組相比，P均<0.05。對照組絨毛組織中PR相對表達(dá)量為0.179 0±0.008 2，12 h組、24 h組、48 h組分別為0.132 7±0.007 0、0.128 5±0.006 5、0.126 2±0.010 9，12 h組、24 h組、48 h組與對照組相比，P均<0.05。

3討論

藥物流產(chǎn)作為一種非手術(shù)終止早期妊娠的途徑，簡便、安全、高效，在臨床得到廣泛應(yīng)用。其中，以米非司酮配伍米索前列醇方案應(yīng)用最多[4，5]。

既往文獻(xiàn)報道，米非司酮能明顯增強(qiáng)妊娠子宮對外源性前列腺素的敏感性，尤其在服用米非司酮后36~48 h最敏感，且臨床研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)米非司酮與米索前列醇用藥間隔為48 h時流產(chǎn)效果最好[6]，因而國內(nèi)外藥物流產(chǎn)方案中米非司酮與米索前列醇的用藥間隔一般為48 h。但從米非司酮的代謝特點(diǎn)來看，其半衰期在24~48 h，提示將米非司酮與米索前列醇的用藥間隔縮短至24~48 h也可能達(dá)到相同的流產(chǎn)效果。研究[7]表明，米非司酮(100 mg)用藥后24 h陰道放置米索前列醇對終止<63 d的妊娠是可行的。有學(xué)者[8]比較了口服米非司酮(200 mg)后6~8 h陰道放置米索前列醇與服藥后24 h放置米索前列醇的效果，發(fā)現(xiàn)兩種方案效果近似，且前者惡心、嘔吐、陰道大量出血等不良反應(yīng)發(fā)生率更低。目前國內(nèi)外已進(jìn)行多項(xiàng)有關(guān)縮短用藥間隔的臨床研究[9]，但尚缺乏充足的理論依據(jù)。

我們通過光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常早孕絨毛組織結(jié)構(gòu)發(fā)育良好，外層為合體滋養(yǎng)細(xì)胞，內(nèi)層為細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞界限清楚，間質(zhì)疏松。服用米非司酮后，絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞有廣泛變性、壞死甚至脫落，絨毛間質(zhì)水腫。本研究中三個用藥組均具備上述特征。這表明在米非司酮作用后12 h絨毛組織就已發(fā)生形態(tài)改變，細(xì)胞變性、壞死。進(jìn)一步通過透射電鏡觀察絨毛組織超微結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)正常早孕絨毛組織表面有大量微絨毛，而米非司酮作用后12 h微絨毛減少、脫落，細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，有脫顆?，F(xiàn)象，這說明米非司酮作用后12 h體內(nèi)PR生物活性便受到抑制，絨毛組織細(xì)胞脫落，引發(fā)流產(chǎn)。

米非司酮可拮抗PR的生物學(xué)效應(yīng)，對胚胎及其支持組織的代謝和形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生多方面影響[10~12]，其中對ER、PR的影響最為重要[13]。早期研究認(rèn)為米非司酮不能直接作用于絨毛組織，其可通過引起蛻膜組織壞死、出血、脫落，使絨毛血供不足，發(fā)生退行性變；近年研究發(fā)現(xiàn)，米非司酮可直接作用于絨毛組織，改變ER/PR正常生理平衡，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)并促進(jìn)其凋亡，導(dǎo)致絨毛蛻膜組織不同程度變性、壞死[14~16]。我們發(fā)現(xiàn)，正常早孕絨毛組織中存在中等強(qiáng)度表達(dá)的ER、PR，經(jīng)米非司酮作用后ER、PR雖仍有表達(dá)，但表達(dá)水平較對照組明顯下降，提示米非司酮可抑制絨毛組織中ER、PR的表達(dá)。三個用藥組之間，ER、PR相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示服用米非司酮后12 h對絨毛組織即有抑制作用，絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞變性、壞死，從而達(dá)到流產(chǎn)的目的。

綜上所述，米非司酮作用后12 h就可對早孕絨毛組織產(chǎn)生影響，將米非司酮與米索前列醇用藥間隔縮短至12 h的方案理論上是可行的。若能經(jīng)過大量臨床試驗(yàn)證實(shí)并推廣應(yīng)用，有望簡化服藥流程。

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Changes in morphology of chorion tissue and expression of estrogen receptor and progesterone receptor in early pregnant women at different time points after taking mifepristone

HANHua,ZHAOHongwei,LIJie,YANPing

(HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the changes in morphology of chorion tissue and expression of estrogen receptor (ER) and progesterone receptor (PR) in early pregnant women at different time points after taking mifepristone. MethodsEighty women who desire to terminate the early pregnancy were randomly divided into the control group, 12-hour group, 24-hour group and 48-hour group, and each group contained 20 cases. Women in the 12-hour group, 24-hour group and 48-hour group took 150 mg mifepristone. Negative pressure suction were performed after 12, 24 and 48 hours respectively in the three groups. The chorion tissue were collected after suction. We observe the morphological change of chorion tissue by light microscope and transmission electron microscope. Detecting the expression of ER and PR in the chorion tissue by immunohistochemistry. ResultsThree medication groups showed the cell degenerated, some were necrotic, even fell off, the inflammatory cell infiltrated, the chorion interstitial had edema and the ultrastructure was damaged. The relative expression levels of ER in the control group, 12-hour group, 24-hour group and 48-hour group were 0.182 4±0.007 2, 0.119 1±0.005 9, 0.120 8±0.011 0 and 0.121 2±0.007 3. The relative expression levels of PR were 0.179 0±0.008 2, 0.132 7±0.007 0, 0.128 5±0.006 5 and 0.126 2±0.010 9. Significant differences were found in the ER and PR between the three medication groups and control group (all P<0.05). ConclusionThe chorion tissue degenerates and shows necrosis and the expression of ER and PR is inhibited after taking mifepristone twelve hours.

Key words:mifepristone; estrogen receptor; progesterone receptor; chorion tissues

(收稿日期：2015-11-17)

中圖分類號：R715.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)07-0007-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.07.003

作者簡介：第一韓華(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)閶D產(chǎn)科計(jì)劃生育。E-mail: 323242844@qq.com