細(xì)黃鏈霉菌對(duì)黃芩抗根腐病的誘導(dǎo)反應(yīng)

李堆淑

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛726000）

細(xì)黃鏈霉菌對(duì)黃芩抗根腐病的誘導(dǎo)反應(yīng)

李堆淑

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛726000）

為研究細(xì)黃鏈霉菌誘導(dǎo)黃芩對(duì)黃芩根腐病菌的抑制效果，采用不同濃度細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液、無(wú)菌水（CK）分別浸泡黃芩幼苗的根8h，幼苗移栽后在黃芩幼苗根部接種5mL黃芩根腐病菌菌懸液，待幼苗生長(zhǎng)至4葉期時(shí)，不同時(shí)間內(nèi)測(cè)定黃芩葉片的CAT、POD和AAO活性。結(jié)果表明，不同濃度細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液對(duì)黃芩葉片中CAT、POD、AAO活性的影響比較顯著，隨著細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液濃度的減小，黃芩葉片中CAT、POD、AAO活性總體的趨勢(shì)先增加后減??；當(dāng)細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液稀釋到50倍時(shí)，黃芩葉片中POD、AAO活性一直比其他濃度的發(fā)酵液誘導(dǎo)的黃芩葉片中POD、AAO活性強(qiáng)，而黃芩葉片中CAT活性除了在12h和24h外，其余時(shí)間均高于其他濃度的發(fā)酵液誘導(dǎo)處理。細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液誘導(dǎo)黃芩，其體內(nèi)的CAT、POD、AAO活性均高于CK，說(shuō)明細(xì)黃鏈霉菌對(duì)黃芩根腐病菌的抗病性比較顯著。

細(xì)黃鏈霉菌；黃芩；黃芩根腐病；誘導(dǎo)；抗病性

黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）為唇形科多年生草本植物，其莖葉和根均含有總黃酮，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)痛、解熱等作用［1］。生產(chǎn)上，黃芩根腐病、根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病、白粉病和葉枯病等蔓延較快，尤以黃芩根腐病危害較嚴(yán)重。黃芩根腐病為土傳病害，病原菌為半知菌亞門(mén)腐皮鐮孢霉菌，寄生在土壤中，待到條件適宜時(shí)先侵染幼苗根部和莖基部，造成根部腐爛，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致全株死亡。根腐病病原菌產(chǎn)生的分生孢子可以通過(guò)水流或土壤進(jìn)行擴(kuò)散［2－3］。黃芩根腐病主要以化學(xué)農(nóng)藥防治，此方法雖見(jiàn)效快，但具殘留污染環(huán)境。生物農(nóng)藥主要通過(guò)農(nóng)用抗生素產(chǎn)生能抑制或殺死作物的病原菌的微生物次生代謝產(chǎn)物［4］，生物農(nóng)藥防治病害不但無(wú)污染，而且對(duì)處理的生物幾乎不產(chǎn)生影響，更不會(huì)破環(huán)生態(tài)平衡。應(yīng)用根際細(xì)菌和植物的內(nèi)生放線(xiàn)菌不但能拮抗病原菌而且能促進(jìn)植物生長(zhǎng)［5－7］，細(xì)黃鏈霉菌（Streptmyces microflavus）是鏈霉菌屬放線(xiàn)菌，對(duì)細(xì)菌、酵母菌、真菌都有抑制作用［8］。用誘導(dǎo)劑能誘導(dǎo)植物內(nèi)源信號(hào)分子積累并傳輸至全株，導(dǎo)致植物產(chǎn)生一些抗病相關(guān)的酶而獲得長(zhǎng)期的抗性［911］，達(dá)到防治病害的目的。目前，有關(guān)細(xì)黃鏈霉菌誘導(dǎo)黃芩，使其產(chǎn)生抗病性的研究還鮮有報(bào)道。因此，筆者用不同濃度的細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液浸泡黃芩幼苗的根，研究黃芩在不同生長(zhǎng)時(shí)間的過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）和抗壞血酸氧化酶（AAO）活性的影響，以探討細(xì)黃鏈霉菌對(duì)黃芩根腐病菌的抗病性反應(yīng)，為黃芩根腐病的生物防治提供參考。

1材料與方法

1．1試驗(yàn)材料

黃芩種子購(gòu)于商洛天士力醫(yī)藥有限公司，黃芩根腐病菌由商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室從黃芩根部分離鑒定，細(xì)黃鏈霉菌購(gòu)于陜西省微生物研究所。培養(yǎng)基為PDA固體培養(yǎng)基、高氏一號(hào)（GA）固體培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基。

1．2黃芩根腐病菌菌液和細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液的制備

將活化的黃芩根腐病菌菌液濃度稀釋為107cfu／mL的菌懸液，即得黃芩根腐病菌菌液。

將活化的細(xì)黃蓮霉菌接種于裝有100mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在28℃、150r／min振蕩培養(yǎng)5d，以20%的接種量轉(zhuǎn)接到100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，振蕩培養(yǎng)5d，發(fā)酵液經(jīng)0．22μm微孔濾膜過(guò)濾得濾液即為細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液。

1．3黃芩幼苗的培養(yǎng)與采樣

挑選飽滿(mǎn)、大小一致的黃芩種子蒸餾水清洗，1%NaClO3消毒10min，再用蒸餾水沖洗，風(fēng)干后放在鋪有雙層濾紙的干凈培養(yǎng)皿中，每皿放100粒。于25℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，保持種子濕潤(rùn)。待黃芩幼苗約5cm左右，分別用CK（無(wú)菌水）、細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵濾液濃度稀釋為10倍，20倍，50倍，100倍的溶液浸泡黃芩幼苗根8h后，移栽至上口徑為10cm的小花盆中用沙質(zhì)土壤培養(yǎng)，然后在每株黃芩根部注入5mL的黃芩根腐病菌菌懸液，待幼苗生長(zhǎng)至4葉期時(shí)，每隔12h采樣酶活性測(cè)定。

1．4酶活性的測(cè)定

過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定采用比色法［12］，樣品在1min內(nèi)240nm處吸光度每變化0．1為1個(gè)CAT酶活單位；過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定用愈創(chuàng)木酚法［13］，抗壞血酸氧化酶活性測(cè)定用淀粉溶液及碘液滴定法［13］。

1．5數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用Mircosoft office 2003 Excel和SPSS17．0進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2．1黃芩幼苗的CAT活性

如圖1所示，在不同時(shí)間誘導(dǎo)處理?xiàng)l件下，不同濃度的細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液對(duì)黃芩幼苗的CAT活性均有顯著的影響。各處理幼苗的CAT活性均大于CK，隨著發(fā)酵液濃度的升高，黃芩幼苗的CAT活性也有所增加。在36h時(shí)，不同濃度處理的黃芩CAT活性均達(dá)到最高峰，但發(fā)酵液濃度稀釋50倍的黃芩CAT活性的最高峰［139．12U／（g·min）］比CK處理的［101．24U／（g·min）］高37．42%，比稀釋10倍處理的［110．27U／（g·min）］高26．16%，比稀釋20倍處理的［136．34U／（g· min）］高2．00%，比稀釋100倍處理的［115．61U／（g·min）］高20．34%，可見(jiàn)，細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液最佳的誘導(dǎo)抗病效果為稀釋50倍。經(jīng)多重比較，CK和稀釋10倍的黃芩發(fā)酵液CAT活性無(wú)顯著差異（P＝0．080＞0．05）；但CK和稀釋10倍的黃芩發(fā)酵液CAT活性分別與稀釋20倍、50倍及100倍間的差異顯著（P＜0．05）；發(fā)酵液稀釋20倍和50倍的黃芩CAT活性間無(wú)顯著差異（P＝0．531＞0．05），但均與CK、稀釋10倍、100倍間的差異顯著（P＜0．05）；稀釋100倍的黃芩CAT活性分別與CK、稀釋10倍、20倍及50倍間的差異顯著（P＜0．05）。

圖1 不同濃度的細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液處理黃芩的CAT活性Fig．1 CAT activity of S．baicalensis seedlings inoculated with different concentrations of S．microflavus fermentation broth

2．2黃芩幼苗的POD活性

由圖2可知，不同濃度的細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液對(duì)黃芩幼苗的POD活性均有顯著的影響。其中CK、發(fā)酵液濃度稀釋10倍、20倍、50倍處理的黃芩POD活性均在24h時(shí)達(dá)到峰值，分別為279．56U／（g·min）、302．23U／（g·min）、312．61U／（g· min）、386．32U／（g·min），而發(fā)酵液濃度稀釋為100倍處理的黃芩POD活性均在36h達(dá)到峰值，酶活為315．61U／（g·min）。可見(jiàn)，發(fā)酵液濃度稀釋50倍處理的黃芩POD活性峰值最大，比CK、發(fā)酵液濃度稀釋10倍、20倍、100倍處理的黃芩POD活性的峰值分別高38．19%、27．82%、23．58%和22．40%。說(shuō)明，POD活性隨著發(fā)酵液濃度的增加而增加，且高濃度的發(fā)酵液不利于黃芩幼苗的POD產(chǎn)生，低濃度的發(fā)酵液能促進(jìn)黃芩幼苗產(chǎn)生POD。用多重因素分析，發(fā)酵液稀釋10倍、20倍的黃芩POD活性無(wú)顯著差異（P＝0．289＞0．05），而其分別與CK、發(fā)酵液稀釋50倍、100倍差異顯著（P＜0．05）；發(fā)酵液稀釋20倍、100倍的黃芩POD活性無(wú)顯著差異（P＝0．114＞0．05），而其分別與CK、發(fā)酵液稀釋10倍、50倍差異顯著（P＜0．05）；CK、發(fā)酵液稀釋50倍的黃芩POD活性?xún)蓛芍g差異性顯著，并且分別與其他發(fā)酵液濃度差異比較顯著（P＜0．05）。

圖2 不同濃度的細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液處理黃芩的POD活性Fig．2 POD activity of S．baicalensis seedlings inoculated with different concentrations of S．microflavus fermentation broth

2．3黃芩幼苗的AAO活性

從圖3看出，不同時(shí)間內(nèi)細(xì)黃鏈霉菌對(duì)黃芩幼苗的抗壞血酸氧化酶（AAO）活性均有顯著的影響，且均隨著時(shí)間的增加其AAO活性逐漸增加，到36h時(shí)出現(xiàn)峰值。不同濃度的發(fā)酵液處理黃芩，其AAO活性均大于CK。發(fā)酵液稀釋50倍黃芩幼苗的AAO活性［50．69U／（g·min）］峰值最高，比CK、稀釋10倍、20倍、100倍黃芩幼苗的AAO活性峰值分別高25．97%、17．31%、8．22%、4．26%。說(shuō)明，誘導(dǎo)促進(jìn)黃芩幼苗的AAO活性細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液最佳稀釋濃度為稀釋50倍。

圖3 不同濃度的細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液處理黃芩的AAO活性Fig．3 AAO activity of S．baicalensis seedlings inoculated with different concentrations of S．microflavus fermentation broth

3結(jié)論與討論

1）用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)植物，植物產(chǎn)生的SAR能提高植物的抗病性，如果病原菌侵染植物，植物體內(nèi)的內(nèi)源信號(hào)分子開(kāi)始大量積累，信號(hào)分子開(kāi)始向整個(gè)植株各個(gè)器官傳輸，然后啟動(dòng)相關(guān)防御基因的表達(dá)，使植物體內(nèi)的防御酶系活化、植物保衛(wèi)素、木質(zhì)素合成及產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白（PR蛋白），從而寄主植物可以獲得長(zhǎng)期的抗性。如植物沒(méi)有受病原菌侵染，用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，同樣植物體內(nèi)能積累大量的內(nèi)源信號(hào)分子，并且向全株傳輸，植物可以獲得長(zhǎng)期的抗性［1415］。本研究用不同濃度的細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液分別誘導(dǎo)處理黃芩幼苗的根，幼苗移栽后在黃芩幼苗根部接種黃芩根腐病菌，待幼苗生長(zhǎng)至4葉期時(shí)，不同時(shí)間內(nèi)細(xì)黃鏈霉菌對(duì)其體內(nèi)CAT、POD、AAO活性隨著濃度的升高先上升后下降，同一濃度隨著時(shí)間的增加先升高后下降。不同濃度細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液處理黃芩，其體內(nèi)的3種酶活性均高于CK，并且均是細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液濃度稀釋50倍的黃芩體內(nèi)的3種酶活性最高。不同時(shí)間分別用CK和不同濃度的發(fā)酵液處理黃芩，其AAO活性?xún)蓛芍g差異顯著（P＜0．05），而CAT和POD活性在不同濃度和不同時(shí)間有差異顯著的（P＜0．05），也有不顯著的（P＞0．05）。過(guò)氧化氫酶是在生物正常細(xì)胞內(nèi)清除氧自由基和生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，病原菌感染后引起氧化應(yīng)激在不同程度上激活了體內(nèi)的抗氧化防御體系，產(chǎn)生抗病作用。CAT活性的升高可能是因植物體內(nèi)的過(guò)氧化氫產(chǎn)物增多而啟動(dòng)的應(yīng)激體制，當(dāng)植物體內(nèi)過(guò)氧化氫產(chǎn)物積累到一定水平時(shí)，超出了自身調(diào)節(jié)的值，酶活性就開(kāi)始降低。POD活性對(duì)植株體內(nèi)的內(nèi)源激素合成有一定的調(diào)節(jié)功能。AAO活性表現(xiàn)出了“低濃度促進(jìn)高濃度抑制”的濃度雙重效應(yīng)，因此，不同濃度的細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液誘導(dǎo)黃芩，可以使黃芩植株增強(qiáng)防御反應(yīng)，進(jìn)而增強(qiáng)其抗病性。

2）陳杰等［16］篩選出的多產(chǎn)色鏈霉菌（S．polychromogenes）、球孢鏈霉菌球孢亞種（S．globisprus subsp．Globisporus）及銹赤蠟黃鏈霉菌（S．rubiginosohelvolus）對(duì)馬鈴薯土傳病病原立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、茄病鐮刀菌（Fusarium solani）及硫色鐮刀菌均有較強(qiáng)的拮抗作用。段佳麗［17］通過(guò)田間試驗(yàn)，證實(shí)了生防放線(xiàn)菌防治丹參根腐病菌的效果顯著，同時(shí)證明了放線(xiàn)菌劑作用的微生態(tài)機(jī)理。中生菌素除了能抑制病原菌，還能誘導(dǎo)水稻植株體內(nèi)的PAL、POD、PPO等防御酶活性大幅提高，起到了防治病害的作用［18］。許英俊等［19］研究了生防菌接種后可提高草莓新葉和根系PPO活性，產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性。薛磊［20］研究出了防治棉花黃萎病的高效多功能生防放線(xiàn)菌菌株。李增波等［21］研究表明，生防菌劑對(duì)草莓有較強(qiáng)的防病作用，同時(shí)還能使草莓植株健壯旺盛，根系發(fā)達(dá)，具有促生效果。這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致。隋麗等［22］用放線(xiàn)菌769發(fā)酵液對(duì)水稻的抗性誘導(dǎo)機(jī)制做了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)769菌株發(fā)酵液可抑制水稻體內(nèi)過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性，提高POD和PAL活性。此研究的生防放線(xiàn)菌抑制水稻體內(nèi)CAT的活性與本研究的結(jié)果相反，還需要進(jìn)一步探討。

［1］梁 英，韓魯佳．黃芩中黃酮類(lèi)化合物藥理學(xué)作用研究進(jìn)展［J］．中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，8（6）：9－14．

［2］蘇淑欣，李 世，劉海光，等．黃芩病蟲(chóng)害調(diào)查報(bào)告［J］．承德職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005（4）：82－83．

［3］郭巧生．藥用植物栽培學(xué)［M］．北京：高等教育出版社，2004：287－290．

［4］陳敏純，廖美德，夏漢祥．農(nóng)用抗生素作用機(jī)理簡(jiǎn)述［J］．世界農(nóng)藥，2011，33（3）：13－16．

［5］楊海蓮，孫曉璐，宋 未．植物根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌的誘導(dǎo)抗病性的研究進(jìn)展［J］．植物病理學(xué)報(bào)，2000，30（2）：106－110．

［6］Conn V M，Walker A R，F(xiàn)ranco C M M．Endophytic actinobacteria induce defense pathways in Arabidopsis thaliana［J］．Molecular Plant－Microbe Interactions，2008，21：208－218．

［7］El－Tarabily K A，Nassar A H，Hardy G，et al．Plant growth promotion and biological control of Pythium aphanidermatum，apathogen of cucumber，by endophytic actinomycetes［J］．Journal of Applied Microbiology，2009，106：13－26．

［8］譚之磊，王來(lái)福，肖湘政，等．細(xì)黃鏈霉菌005發(fā)酵條件優(yōu)化及在玉米上的應(yīng)用［J］．中國(guó)土壤與肥料，2008 （2）：61－64．

［9］范志金，劉秀峰，劉鳳麗，等．植物抗病激活劑誘導(dǎo)植物抗性的研究進(jìn)展［J］．植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2005，32（1）：87－92．

［10］Sun A Z，Nie S J，Xing D，et al．Nitric Oxide－Mediated Maintenance of Redox Homeostasis contributes to NPR1－Dependent plant innate immunity triggered by lipopolysaccharides［J］．Plant Pathol，2012，160 （2）：1081－1096．

［11］Scalschi L，Vicedo B，Camanes G，et al．Hexanoic acid is a resistance inducer that protects tomato plants against Pseudomonas syringae by priming the jasmonic acid and salicylic acid pathways［J］．Mol Plant Pathol，2013，14（4）：342－355．

［12］高俊鳳．植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］．北京：世界圖書(shū)出版公司，2000：195－199．

［13］張龍翔．生化實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)［M］．2版．北京：高等教育出版社，1997：179．

［14］程世亞，袁 澍，席德慧，等．植物系統(tǒng)獲得性抗性的分子機(jī)理［J］．生命的化學(xué)，2008，28（3）：256－259．

［15］Garcia－Brugger A，Lamotte O，Vandelle E．Early signaling events induced by elicitors of plant defenses ［J］．Mol Plant Microbe In，2006，19（7）：711－724．

［16］陳 杰，楊 琳，郭天文，等．馬鈴薯土傳病原真菌拮抗放線(xiàn)菌的抗病促生作用［J］．西北農(nóng)林科技大學(xué)：自然科學(xué)版，2014，42（10）：111－119．

［17］段佳麗．丹參根部病害發(fā)生微生態(tài)機(jī)制與放線(xiàn)菌促生作用研究［D］．楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013：79－81．

［18］朱茂山．番茄灰霉菌拮抗放線(xiàn)菌及抑菌活性物質(zhì)研究［D］．沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014：15－17．

［19］許英俊，薛泉宏，邢勝利，等．3株放線(xiàn)菌對(duì)草莓的促生作用及對(duì)PPO活性的影響［J］．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16（6）：146－153．

［20］薛 磊．棉花黃萎病生防鏈霉菌的抗病促生作用及其機(jī)制研究［D］．楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012：131－192．

［21］李增波，薛泉宏，粱軍峰，等．一株生防放線(xiàn)菌AL－04的防病促生作用［J］．農(nóng)藥，2009，48（1）：74－76．

［22］隋 麗，徐文靜，杜 茜，等．放線(xiàn)菌769發(fā)酵液對(duì)水稻體內(nèi)主要防御酶活性的影響［J］．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31（4）：382－384，389．

（責(zé)任編輯：聶克艷）

Induced Reaction of Streptomyces microflavus to Fusarium solani in Scutellaria baicalensis

LI Duishu

（College of Biomedicine and Food Engineering，Shangluo College，Shangluo，Shaanxi 726000，China）

The cutellaria baicalensis seedlings’roots were first soaked with different concentration of S．microflavus fermentation broth and sterile water（CK）respectively，then the transplanted seedlings’roots inoculated with 5mL F．solani suspension and finally the CAT，POD and AAO activity of the S．baicalensis seedlings with four leaves was determined at different time to study the inhibition effect of S．baicalensis inducted with S．microflavus against F．solani．Results：The concentration of S．microflavus fermentation broth has the significant effect on CAT，POD and AAO activity of the S．baicalensis seedlings and the leaf CAT，POD and AAO activity represents a first increase and then decrease trend overall with decrease of S．microflavusfermentation broth concentration．The leaf POD and AAO activity still is higher than other treatments when S．microflavus fermentation broth is diluted to 50 times but the leaf CAT activity is higher than other treatments except for determination values at 12hand 24h．The leaf CAT，POD and AAO activity of S．baicalensis seedlings treated with S．microflavus fermentation broth is higher than CK，which indicates S．microflavus is of the significant resistance to F．solani of S．baicalensis．

Streptomyces microflavus；Scutellaria baicalensis；Fusarium solani；induction；resistance

S436．412．13

A

1001－3601（2016）02－0072－0089－04

2015－06－10；2016－01－14修回

陜西省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目“生防放線(xiàn)菌誘導(dǎo)商洛黃芩抗根腐病及促生性研究”（2013JK0737）

李堆淑（1977－），女，副教授，碩士，從事植物病理生理學(xué)及微生物研究。E－mail：lds1202＠163．com