西藏靈菇發(fā)酵乳胞外多糖的流變學(xué)特性

陳志娜，楊希娟，師俊玲（.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 700；.青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 80000；3.西北工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)　學(xué)院，陜西 西安 7007）

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西藏靈菇發(fā)酵乳胞外多糖的流變學(xué)特性

陳志娜1，楊希娟2，師俊玲3,*
（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810000；3.西北工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710072）

摘 要：以西藏靈菇發(fā)酵乳中分離純化所得胞外多糖為研究對(duì)象，對(duì)其流變學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明，該胞外多糖的水溶液表現(xiàn)為典型的非牛頓假塑性流體特性，且其流動(dòng)行為受胞外多糖的質(zhì)量濃度、pH值、溫度、離子種類和濃度的影響，具體表現(xiàn)為：胞外多糖溶液的黏度隨胞外多糖質(zhì)量濃度的升高而增加，質(zhì)量濃度越高剪切稀釋現(xiàn)象越明顯；pH 4.0和pH 10.0時(shí)胞外多糖溶液黏度明顯低于pH 7.0。Na＋可使胞外多糖溶液的黏度顯著增大，且Na＋濃度越高，溶液黏度越大；Ca2＋可使胞外多糖溶液的黏度明顯下降，但其下降幅度與Ca2＋濃度無(wú)關(guān)；溫度在10～85 ℃范圍內(nèi)胞外多糖溶液的黏度變化很小，有很好的耐溫性。加入10 mg/mL的該胞外多糖能夠明顯增加脫脂乳的黏度。

關(guān)鍵詞：西藏靈菇；胞外多糖；流變學(xué)特性；穩(wěn)態(tài)分析；動(dòng)態(tài)振蕩剪切分析

引文格式：

陳志娜,楊希娟,師俊玲.西藏靈菇發(fā)酵乳胞外多糖的流變學(xué)特性[J].食品科學(xué),2016,37(5):1-5.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605001.http://www.spkx.net.cn

CHEN Zhina,YANG Xijuan,SHI Junling.Rheological properties of exopolysaccharide produced by Tibetan kefir[J].Food Science,2016,37(5):1-5.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605001.http://www.spkx.net.cn

西藏靈菇，類似于目前很流行的開(kāi)菲爾粒（kefir），是由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌多種微生物共生形成的一種不規(guī)則的粒狀混合物[1-2]，在其生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中可分泌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）[3]。研究發(fā)現(xiàn)，kefir胞外多糖具有免疫調(diào)節(jié)[4]、抗菌性[5]和抗腫瘤[6]等功能。近年來(lái)，多糖作為稠化劑、穩(wěn)定劑、乳化劑在食品工業(yè)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[7-9]，這些都?xì)w功于其優(yōu)良的流變學(xué)特性。從西藏靈菇中分離所得乳酸菌所產(chǎn)胞外多糖的特性，包括其結(jié)構(gòu)、生理活性及理化性質(zhì)等已有所報(bào)道[10-13]，但是，有關(guān)西藏靈菇菌粒復(fù)合體所產(chǎn)胞外多糖的特性，特別是對(duì)其流變學(xué)特性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本課題組在前期研究中，對(duì)西藏靈菇發(fā)酵乳中的胞外多糖進(jìn)行了分離純化，分析得知其單糖組成為葡萄糖和半乳糖，整個(gè)多糖具有良好的抗氧化活性，并對(duì)2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-aminopropane)dihyrochloride，AAPH）誘導(dǎo)的蛋白損傷具有一定的保護(hù)作用[14]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)研究了該胞外多糖的流變學(xué)特性，考察了質(zhì)量濃度、pH值、體系溫度及鹽離子對(duì)其表觀黏度的影響，研究了其對(duì)脫脂乳黏度的提升作用，以期為其在乳制品加工中的實(shí)際應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1菌株、材料與培養(yǎng)基

西藏靈菇菌株（TK01）采集于西藏，保藏于西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品生物加工與安全實(shí)驗(yàn)室。

新鮮牛乳，采購(gòu)于西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧養(yǎng)殖場(chǎng)。

脫脂牛乳培養(yǎng)基：鮮牛乳在4 000 r/min離心10 min去脂后，每100 mL分裝于250 mL的錐形瓶中，105 ℃條件下滅菌20 min，備用。

1.2儀器與設(shè)備

ZX7M-AR1000流變儀 美國(guó)TA公司；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；FD-1C-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BT25S電子天平賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3方法

1.3.1西藏靈菇發(fā)酵乳中胞外多糖的提取

將西藏靈菇菌接種到脫脂牛乳培養(yǎng)基中，25 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，無(wú)菌條件下濾去西藏靈菇菌，剩余的發(fā)酵液于100 ℃條件下加熱10 min，溶解黏附在細(xì)胞表面的多糖[11]，過(guò)濾后過(guò)夜醇沉。Sevag法[15]去蛋白后，冷凍干燥得到白色蓬松狀西藏靈菇胞外多糖。

1.3.2質(zhì)量濃度對(duì)胞外多糖溶液流變學(xué)特性的影響

用去離子水配制質(zhì)量濃度分別為5、10、20 mg/mL的胞外多糖溶液，測(cè)定不同質(zhì)量濃度胞外多糖溶液的表觀黏度。測(cè)定條件為：溫度25 ℃，椎板（40 mm，1o），測(cè)定模式為穩(wěn)態(tài)剪切測(cè)定，數(shù)據(jù)獲取模式為連續(xù)讀?。灰约羟兴俾蕿樽宰兞?，變化范圍為1～100 s－1，掃描完成時(shí)間為10 min，變量掃描范圍設(shè)定為線性。

1.3.3體系pH值對(duì)胞外多糖溶液流變學(xué)特性的影響

用HCl或Na OH溶液調(diào)節(jié)多糖溶液（質(zhì)量濃度為10 mg/mL）的pH值分別至4.0、7.0、10.0。用流變儀測(cè)定酸堿度對(duì)胞外多糖溶液表觀黏度的影響，測(cè)定條件與1.3.2節(jié)相同。

1.3.4離子種類和濃度對(duì)胞外多糖溶液流變學(xué)特性的影響

取質(zhì)量濃度為10 mg/mL的胞外多糖溶液，分別加入NaCl和CaCl2，使溶液中的鈉離子和鈣離子濃度分別為0.1、0.4 mol/L。用流變儀測(cè)定鹽離子對(duì)胞外多糖溶液表觀黏度的影響，測(cè)定條件與1.3.2節(jié)相同。

1.3.5體系溫度對(duì)胞外多糖溶液流變學(xué)特性的影響

取質(zhì)量濃度為10 mg/mL的多糖溶液，用流變儀測(cè)定體系溫度對(duì)胞外多糖溶液表觀黏度的影響。測(cè)定條件：椎板（40 mm，1o），測(cè)定模式為穩(wěn)態(tài)剪切測(cè)定，數(shù)據(jù)獲得模式為溫度梯度升高，溫度掃描范圍為10～85 ℃，自變量為剪切速率，范圍為1～100 s－1。

1.3.6胞外多糖溶液的動(dòng)態(tài)振蕩剪切實(shí)驗(yàn)

用去離子水配制質(zhì)量濃度分別為5、10、20 mg/mL的胞外多糖溶液，分別測(cè)定其表觀黏度在不同剪切振蕩頻率下的變化。測(cè)定條件：溫度25 ℃，椎板（40 mm，1o），測(cè)定模式為振蕩，數(shù)據(jù)獲取模式為連續(xù)讀取，以剪切振蕩頻率為自變量，范圍為（0～10 Hz），掃描完成時(shí)間為10 min。

1.3.7胞外多糖對(duì)脫脂乳流變學(xué)特性的影響

用去離子水配制質(zhì)量濃度為100 mg/mL的脫脂乳溶液，將胞外多糖以10 mg/mL加入脫脂乳溶液中，同時(shí)以不添加胞外多糖的脫脂乳作對(duì)照。測(cè)定兩種脫脂乳溶液在剪切速率變化時(shí)溶液黏度的變化。測(cè)定條件為：溫度25 ℃，椎板（40 mm，1o），測(cè)定模式為穩(wěn)態(tài)剪切測(cè)定，數(shù)據(jù)獲取模式為連續(xù)讀取，以剪切速率為自變量，范圍為（0～300 s－1），掃描完成時(shí)間為10 min，變量掃描范圍設(shè)定為線性。

2　結(jié)果與分析

2.1質(zhì)量濃度對(duì)胞外多糖溶液流變學(xué)特性的影響

圖1　質(zhì)量濃度對(duì)胞外多糖溶液表觀黏度的影響Fig.1 Effect of EPS concentration on the visco　sity of EPS solution

由圖1可知，在所用剪切速率范圍（0～100 s－1）內(nèi)，胞外多糖溶 液的表觀黏度隨著胞外多糖溶液質(zhì)量濃度的增大而增加。這是因?yàn)榘舛嗵琴|(zhì)量濃度的增加加強(qiáng)了多糖鏈之間的相互作用，部分多糖分子相互聯(lián)結(jié)，導(dǎo)致聚合程度增加[16]。其中，當(dāng)剪切速率較低時(shí)，不同質(zhì)量濃度的胞外多糖溶液均表現(xiàn)為典型的非牛頓流體特性：即溶液黏度隨著剪切速率的增加而減小的假塑性和剪切稀釋的流動(dòng)特征。剪切速率較高時(shí)，不同質(zhì)量濃度的胞外多糖溶液隨著剪切速率的增加表現(xiàn)為恒定的理想牛頓流體行為。這一特性與已報(bào)道的融合菌株G23胞外多糖的流動(dòng)行為相似[17]。Adeli[18]和Vardhanabhuti[19]等認(rèn)為，多糖鏈的取向效應(yīng)導(dǎo)致了剪切稀釋現(xiàn)象的產(chǎn)生：剪切速率增加時(shí)，長(zhǎng)而無(wú)序鏈的聚合物大分子的流動(dòng)方向越來(lái)越趨于一致，從而使其彼此間的交互作用減弱。剪切稀釋特性在乳品加工中具有重要的意義：在攪拌過(guò)程中，隨著攪拌速率的增加，乳品的表觀黏度下降；而當(dāng)攪拌速率減慢直至停止時(shí)，乳品的黏度增加[20]，這更有利于凝固性發(fā)酵乳的加工生產(chǎn)。

根據(jù)已有報(bào)道，理想牛頓流體行為在純?nèi)軇┗蛐》肿游镔|(zhì)溶液中非常普遍[21]，而多糖則因?yàn)榉肿淤|(zhì)量較大以及延展構(gòu)象，所以多表現(xiàn)出非牛頓流體的剪切稀釋現(xiàn)象[22]。但是也有文獻(xiàn)報(bào)道，一些大分子多糖也表現(xiàn)出牛頓流體行為[23-24]。例如，Kale等[25]對(duì)不同來(lái)源的阿拉伯木聚糖的流變學(xué)性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，玉米麩皮多糖和switchgrass高粱麩皮多糖雖然在分子質(zhì)量上差別很大，但是在高質(zhì)量濃度時(shí)，兩者都沒(méi)有表現(xiàn)出剪切稀釋現(xiàn)象；同時(shí)，sumac高粱麩皮多糖和玉米麩皮多糖的分子質(zhì)量雖然相近，但是它們?cè)诟哔|(zhì)量濃度時(shí)卻表現(xiàn)出不一樣的流動(dòng)特性。因此，聚合物流動(dòng)行為的切變依賴性可能不僅與其分子質(zhì)量有關(guān)，還與其精細(xì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象有關(guān)。

2.2體系pH值對(duì)胞外多糖溶液流變學(xué)特性的影響

Medina-Torres等[26]研究發(fā)現(xiàn)，pH值可以改變聚合物分子的構(gòu)象而導(dǎo)致其溶液黏度發(fā)生改變。圖2顯示，溶液的pH值發(fā)生變化時(shí)，能夠顯著改變胞外多糖的表觀黏度：低pH值和高pH值都會(huì)使胞外多糖溶液的表觀黏度明顯下降。Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn)，青海菜水溶性黏液的黏度在pH 5.0～9.0的范圍內(nèi)，隨pH值的增大而呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)。他們認(rèn)為，黏液中的酸性多糖基團(tuán)的電荷密度會(huì)隨著pH值的增加而增多，從而促進(jìn)第三電黏效應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致黏液黏度的增加。Xiu Aihui等[28]對(duì)索拉膠溶液的流變學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該溶液的黏度能夠在pH 6.0～12.0的范圍內(nèi)保持恒定，但是超過(guò)這一范圍的pH值都會(huì)導(dǎo)致其黏度下降。本實(shí)驗(yàn)所得胞外多糖在pH 4.0和pH 10.0時(shí)的黏度明顯低于pH 7.0，這可能是因?yàn)樵摱嗵窃谒嵝曰驂A性環(huán)境下，導(dǎo)致了氫鍵斷裂，促進(jìn)了多糖的分解，從而降低了其表觀黏度[29]。

圖2　pH值對(duì)胞外多糖溶液表觀黏度的影響Fig.2 Effect of pH on the viscosity of EPS solution

2.3鹽離子對(duì)胞外多糖溶液流變學(xué)特性的影響

圖3　鹽離子對(duì)胞外多糖溶液表觀黏度的影響Fig.3 Effect of salt ions on the viscosity of EPS solution

鹽離子對(duì)多糖溶液表觀黏度的影響是評(píng)價(jià)其流變學(xué)特性的重要因素。由圖3可知，離子的類型和濃度對(duì)所得胞外多糖溶液的流變學(xué)特性都會(huì)產(chǎn)生顯著影響。Na＋的添加會(huì)使多糖溶液的表觀黏度顯著增加；并且其黏度隨著Na＋添加濃度增大而增加。而Ca2＋的添加則會(huì)使胞外多糖溶液的表觀黏度產(chǎn)生明顯下降，但Ca2＋濃度的變化對(duì)其黏度的影響不大。在0.4 mol/L的Na＋和Ca2＋存在下，所得多糖溶液仍然能夠保持明顯的假塑性流體特征。

從理論分析，無(wú)機(jī)鹽離子可以通過(guò)屏蔽聚合物鏈上的帶點(diǎn)基團(tuán)之間的靜電排斥而影響聚合電解質(zhì)[30]，最終導(dǎo)致兩種不同的結(jié)果：分子擴(kuò)張的減少引起的黏度下降和分子間的締合引起的黏度增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NaCl的加入減少了多糖分子的電荷，促使了可溶性分子配合物的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致黏度增加[19]；而CaCl2的加入則導(dǎo)致了多糖分子的緊密構(gòu)象，改變了大分子的流體力學(xué)尺寸，從而引起黏度降低[31-32]。

2.4體系溫度對(duì)胞外多糖流變學(xué)特性的影響

圖4　溫度對(duì)胞外多糖溶液表觀黏度的影響Fig.4 Effect of temperature on the viscosity of EPS solution

由圖4可知，10 mg/mL的胞外多糖溶液的表觀黏度在10～85 ℃的溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)為：隨著溫度升高而略有下降，但總體比較穩(wěn)定。這說(shuō)明，該胞外多糖溶液具有很好的熱穩(wěn)定性，能夠適應(yīng)不同溫度的加熱處理。根據(jù)已有報(bào)道，溫度對(duì)膠體黏度的影響與膠體的種類有關(guān)：黃原膠可以在很高的溫度范圍內(nèi)保持黏度不變[33-34]，而半乳甘露聚糖的黏度隨著溫度從20 ℃到80 ℃下降50%[35]，而本實(shí)驗(yàn)所用多糖的黏度能夠在一定的溫度范圍內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定。說(shuō)明其形成的膠體與已有研究報(bào)道稍微有所不同。

2.5胞外多糖溶液的動(dòng)態(tài)振蕩剪切實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5　不同質(zhì)量濃度的胞外多糖溶液的儲(chǔ)能模量（G’）與損耗模量（G’’）隨頻率變化規(guī)律Fig.5 Frequency dependence of storage(G’)and loss(G’’)modulus of EPS solution with different concentrations

圖5為不同質(zhì)量濃度的胞外多糖溶液的動(dòng)態(tài)振蕩剪切實(shí)驗(yàn)結(jié)果。隨著剪切振蕩頻率的增加3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的多糖溶液的儲(chǔ)能模量（G’）和損耗模量（G’’）都表現(xiàn)出連續(xù)升高。在低頻率條件下，G’’高于G’；當(dāng)頻率達(dá)到一定值時(shí)，G’’曲線與G’曲線相交，交點(diǎn)處頻率稱為交叉頻率，通常被定義為彈性行為或凝膠狀態(tài)的開(kāi)始[36]。剪切振蕩頻率低于交叉頻率時(shí)（G’’＞G’），多糖溶液主要表現(xiàn)為液體黏性性質(zhì)；剪切振蕩頻率高于交叉頻率時(shí)（G’’＜G’），多糖溶液主要表現(xiàn)為固體彈性性質(zhì)[17,37]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，溶液的交叉頻率有所降低，這說(shuō)明隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，多糖溶液的膠體化程度增大，更多地表現(xiàn)為固體彈性性質(zhì)。類似的結(jié)果也在其他研究中有所報(bào)道：Sengkhamparn等[37]對(duì)不同濃度的秋葵HBSS果膠水溶液的研究發(fā)現(xiàn)，果膠溶液的交叉頻率隨著果膠濃度的增加而降低；Gorret等[38]在P.acidipropionici產(chǎn)多糖溶液的流變學(xué)性質(zhì)研究中也得到了相類似的結(jié)果。

2.6胞外多糖對(duì)脫脂乳溶液流變學(xué)特性的影響

圖6　胞外多糖對(duì)脫脂乳表觀黏度的影響Fig.6 Effect of EPS addition on the viscosity of skim milk

圖6為胞外多糖對(duì)脫脂乳溶液表觀黏度的影響，添加了10 mg/mL胞外多糖的脫脂乳溶液的表觀黏度顯著高于未添加胞外多糖的脫脂乳溶液。而且，兩種溶液的表觀黏度均在0～50 s－1內(nèi)隨著剪切速率的增大而快速下降，表現(xiàn)為明顯的剪切稀釋作用。Ruas-Madiedo等[39]的研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌所產(chǎn)胞外多糖可以作為質(zhì)地改良劑，明顯地提高乳制品的黏度，還能夠通過(guò)乳中的蛋白質(zhì)膠粒相互作用而增強(qiáng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的剛性和穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)所用多糖在乳液中的研究結(jié)果與此類似，說(shuō)明其在乳制品中有很好的應(yīng)用潛力。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明：西藏靈菇胞外多糖溶液表現(xiàn)為典型的非牛頓假塑性流體特性，具有很好的耐溫性，堿性或酸性條件下，其表觀黏度在會(huì)顯著下降；Na＋可以增強(qiáng)其表觀黏度，而Ca2＋會(huì)降低其表觀黏度。西藏靈菇胞外多糖能夠明顯增加脫脂乳的黏度，表現(xiàn)出很好的應(yīng)用潛力。

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Rheological Properties of Exopolysaccharide Produced by Tibetan Kefir

CHEN Zhina1,YANG Xijuan2,SHI Junling3,*
(1.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,China; 2.Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Xining 810000,China; 3.School of Life Sciences,Northwestern Polytechnical University,Xi’an 710072,China)

Abstract:In this study,the rheological properties of exopolysaccharide(EPS)produced by Tibetan kefir were evaluated.The results showed that the aqueous EPS solution was a typical non-Newtonian pseudoplastic fluid,and its flow behavior was affected by concentration,pH,temperature,cation type and concentration.Specifically,the viscosity of EPS solution increased with its increasing concentration and the shear thinning phenomenon was more obvious.The viscosity of EPS solution at pH 10.0 or pH 4.0 was obviously lower than that at pH 7.0.The addition of Na+significantly increased the viscosity of EPS solution in a concentration-dependent fashion.However,the viscosity of EPS solution was greatly decreased when Ca2+was added.The viscosity of EPS solution little changed with good temperature resistance at 10–85 ℃.The viscosity of skim milk was significantly increased by adding 10 mg/mL of the EPS.

Key words:Tibetan kefir; exopolysaccharide; rheological properties; steady-state analysis; dynamic oscillatory shear analysis

中圖分類號(hào)：TS252.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）05-0001-05

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605001

*通信作者：師俊玲（1972—），女，教授，博士，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：sjlshi2004@aliyun.com

作者簡(jiǎn)介：陳志娜（1988—），女，博士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：chenzhina0625@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31260395）

收稿日期：2015-04-16