胰島素樣生長因子1受體對卵巢癌細胞增殖及化療敏感性的影響

劉恩令，李君，周玉秀，王德華，糜若然

(1河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院；河北唐山063000；2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院)

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胰島素樣生長因子1受體對卵巢癌細胞增殖及化療敏感性的影響

劉恩令1，李君1，周玉秀1，王德華2，糜若然2

(1河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院；河北唐山063000；2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院)

摘要：目的觀察胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)對卵巢癌細胞增殖及化療敏感性的影響。方法將人卵巢癌HO8910PM細胞隨機分為3組，A、B組分別轉(zhuǎn)染IGF-1R siRNA及無義siRNA，C組不轉(zhuǎn)染。采用實時PCR法檢測IGF-1R mRNA，CCK-8法測定細胞增殖OD值，CCK-8法測定細胞對順鉑和卡鉑半數(shù)有效抑制濃度(IC50)。結(jié)果轉(zhuǎn)染48、72、96 h時，A組IGF-1R mRNA表達量均低于同時點B、C組(P均<0.05)；轉(zhuǎn)染72、96 h 時，A組細胞增殖OD值低于同時點B、C組(P均<0.05)；轉(zhuǎn)染48 h 時，A組細胞對順鉑和卡鉑的IC50低于B、C組(P均<0.05)；B、C組上述指標(biāo)比較，P均>0.05。結(jié)論IGF-1R可促進卵巢癌細胞增殖，降低卵巢癌細胞對順鉑、卡鉑的化療敏感性。

關(guān)鍵詞：卵巢癌；胰島素樣生長因子1受體；細胞增殖；順鉑；卡鉑；化療敏感性

在細胞分化、增殖及個體的生長發(fā)育中，胰島素樣生長因子1(IGF-1)及其受體(IGF-1R)具有促進作用。IGF-1R不僅作用于正常細胞，在許多腫瘤細胞惡性表型形成和維持上起關(guān)鍵作用[1]。研究顯示，IGF-1R在許多惡性腫瘤中呈高表達，其中在卵巢癌細胞亦呈高表達?；熓侵委熉殉舶┑闹匾侄危糠只颊邔煵幻舾?，從而影響了化療療效。小干擾RNA(siRNA)利用同源性雙鏈RNA誘發(fā)序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，使mRNA發(fā)生降解，從而抑制相關(guān)蛋白表達[2]。2014年3月~2015年4月，我們采用siRNA技術(shù)沉默IGF-1R基因，旨在探討IGF-1R對卵巢癌細胞增殖及對化療敏感性的影響，為卵巢癌的靶向治療提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料人卵巢癌細胞株HO8910PM、RPMI 1640培養(yǎng)基(購自中國科學(xué)院)，Lipofectamine 2000脂質(zhì)體、TRIzol試劑、dNTP、RNA酶抑制劑、小牛血清、細胞增殖/毒性檢測試劑CCK-8、IGF-1R多克隆抗體、GAPDH、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、抗鼠IgG抗體、siRNA購自Invitrogen公司。IGF-1R siRNA序列及無義siRNA序列由上海生工合成。

1.2細胞培養(yǎng)將HO8910PM細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細胞融合率達80%時用0.25%胰酶消化，進行傳代。將細胞以6×103/孔接種于96孔板，細胞貼壁后去除原培養(yǎng)液。

1.3細胞分組與轉(zhuǎn)染將細胞按照3×103/孔接種于6孔板中，待細胞生長融合至30%~50%時隨機分為3組，A、B組分別采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染IGF-1R siRNA及無義siRNA，嚴(yán)格按照說明書操作，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。C組不轉(zhuǎn)染。

1.4細胞IGF-1R mRNA表達檢測采用實時PCR法。分別于培養(yǎng)48、72、96 h取各組細胞，用TRIzol快速提取試劑盒提取總RNA，于-80 ℃存儲。取2 μg總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系：DEPC水5.3 μL，RT-PCR緩沖液2 μL，上下游引物各0.1 μL，RNA酶抑制劑0.1 μL，混合酶0.4 μL，底物1 μL。42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，-20 ℃保存。使用實時PCR試劑盒檢測IGF-1R mRNA，以U6引物為內(nèi)對照，RNA模板5 μL，2×Master Mix 25 μL，50×SYBR Green Ⅰ 1 μL，上下游引物各2 μL，DEPC水補齊至50 μL。95 ℃ 10 min，90 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。采用2-ΔΔCt法計算IGF-1R mRNA相對表達量。

1.5細胞增殖活力測定采用CCK-8法。取各組細胞按6×103/孔接種96孔板，貼壁后去除培養(yǎng)液，更換為含1%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。于轉(zhuǎn)染后48、72、96 h向每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶標(biāo)儀于波長450 nm處測定光密度(OD)，以O(shè)D值表示細胞增殖活力。每組設(shè)6個復(fù)孔，取均值。

1.6細胞對化療藥物的半數(shù)有效抑制濃度(IC50)測定采用CCK-8法。取各組轉(zhuǎn)染后48 h的細胞，依次加入終濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL的順鉑，終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μg/mL的卡鉑處理48 h，向相應(yīng)孔中加入10 μL的CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的OD值，并使用軟件計算順鉑、卡鉑的IC50。

2結(jié)果

2.1各組細胞IGF-1R mRNA表達比較見表1。

表1　各組細胞IGF-1R mRNA表達比較

注：與B組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

2.2各組細胞增殖OD值比較見表2。

表2　各組細胞增殖OD值比較

注：與B組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

2.3各組細胞對順鉑、卡鉑的IC50比較見表3。

表3　各組細胞對順鉑、卡鉑的IC50比較

注：與B組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

3討論

IGF家族由3個配體、4個受體及至少6種高親和力的IGF結(jié)合蛋白組成。IGF-1是促有絲分裂生長因子家族成員，參與調(diào)節(jié)激素合成和分泌、細胞趨化遷移以及細胞免疫功能[3]。IGF-1R是位于細胞膜上的酪氨酸激酶受體，由2 個α亞基和2 個β亞基共價結(jié)合的多肽鏈組成。當(dāng)配體與IGF-1R 的α亞基結(jié)合，引起β亞基構(gòu)象改變，從而促進IGF-1R磷酸化，并參與胞內(nèi)第二信使傳遞途徑進而發(fā)揮其生物學(xué)功能[4]。IGF-1及其受體在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用備受重視，IGF-1通過與其受體結(jié)合而發(fā)揮功能，可促進細胞分化、增殖及抑制細胞凋亡[5]。多數(shù)腫瘤細胞可通過旁分泌、自分泌及內(nèi)分泌形式產(chǎn)生IGF-1，其與受體結(jié)合發(fā)揮生長促進作用。正常情況下，IGF-1R的功能與調(diào)節(jié)細胞分化、生長及凋亡有關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤細胞系中發(fā)現(xiàn)IGF-1R基因表達失常，其異常表達在維持腫瘤表型方面起重要作用[6～9]。1991年,文獻首次報道了卵巢癌細胞株表達IGF-1 mRNA、IGF-1R 和IGFBP。Eckstein等[10]證實，IGF-1R可誘導(dǎo)兔卵巢間皮細胞的表型轉(zhuǎn)化和惡變。Brokaw等[11]發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌細胞中游離IGF-1高表達，證實了IGF-1在卵巢癌發(fā)展中的作用。IGF-1是通過受體發(fā)揮作用的，在上皮性卵巢癌組織中，IGF-1與IGF-1R表達呈正相關(guān)，表明卵巢癌局部表達上調(diào)的IGF-1與增多的IGF-1R相結(jié)合促進腫瘤細胞增殖。越來越多的研究表明，IGF-1在細胞增殖、分化、侵襲和血管生成方面發(fā)揮重要作用[12]。

IGF-1及其受體是癌癥治療的靶點。IGF-1R靶向治療主要包括：①采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)、反義寡核苷酸技術(shù)，靶向沉默IGF-1R基因，阻斷其信號通路，抑制相關(guān)蛋白的表達；②合成IGF-1R 的單克隆抗體，利用該抗體對GF-1R 的高親和力，可競爭性抑制IGF-1 與其受體的相互作用，即封鎖配體-受體間的相互作用；③運用酪氨酸激酶抑制劑抑制IGF-1R 的激活，從而阻斷其下游的信號通路[13]。siRNA是利用同源性雙鏈RNA誘發(fā)序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，通過使mRNA發(fā)生降解而抑制相關(guān)蛋白表達。RNAi技術(shù)高效、特異以及可遺傳，可有效地沉默特定基因，為腫瘤的基因治療提供了新方向。舒珊榮等[14]采用RNAi技術(shù)沉默IGF-1R基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌細胞增生及裸鼠成瘤的作用時發(fā)現(xiàn)，靶向IGF-1R 基因的siRNA可有效抑制IGF-1R基因表達，從而促使細胞凋亡，抑制細胞生長及成瘤作用。同時，研究發(fā)現(xiàn)采用siRNA沉默IGF-1R表達，通過抑制下游信號通路的傳導(dǎo)，可增強子宮內(nèi)膜癌對順鉑的化療敏感性。本研究通過轉(zhuǎn)染IGF-1R siRNA的方法，在卵巢癌HO8910PM細胞系中成功沉默了IGF-1R基因表達。轉(zhuǎn)染72、96 h 時，A組細胞增殖OD值低于B、C組。這提示IGF-1通過IGF-1R途徑對卵巢癌細胞系發(fā)揮促增殖作用,體外合成的IGF-1R siRNA可阻斷這一途徑,抑制腫瘤細胞增殖。轉(zhuǎn)染48 h 時，A組細胞對對順鉑和卡鉑的IC50值低于B、C組；證明IGF-1R對卵巢癌細胞的化療敏感性有一定影響，體外合成IGF-1R siRNA使IGF-1R 表達降低，從而提高了卵巢癌細胞的化療敏感性。張丁丁等[15]研究認(rèn)為，IGF-1R參與了化療耐藥過程，但通過IGF-1R抑制劑NVP-AEW541抑制IGF-1R可逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞對順鉑的耐藥。

綜上所述，IGF-1R可促進卵巢癌細胞增殖，降低卵巢癌細胞對順鉑、卡鉑的化療敏感性，而采用siRNA技術(shù)下調(diào)IGF-1R表達可逆轉(zhuǎn)以上作用。

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Effect of insulin-like growth factor 1 receptor on cell proliferation and chemotherapy sensitivity of ovarian cancer

LIUEnling1,LIJun,ZHOUYuxiu,WANGDehua,MIRuoran

(1TangshanGongrenHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity,Tangshan063000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) on cell proliferation and chemotherapy sensitivity of ovarian cancer.MethodsHuman ovarian cancer HO8910PM cells were randomly divided into 3 groups. Group A and B were respectively transfected by IGF-1R siRNA and nonsense siRNA, but group C without transfection. The real-time PCR was used to detect IGF-1R mRNA, CCK 8 was employed to detect OD value of cell proliferation, and CCK 8 was used to detect the effective inhibitory concentration (IC50) on cisplatin and carboplatin. ResultsAfter transfection for 48, 72 and 96 h, the expression of IGF-1R mRNA in the group A was lower than that of groups B and C (all P<0.05); at 72 h and 96 h, the OD value of group A was lower than those of groups B and C (all P<0.05); at 48 h, IC50value on cisplatin and carboplatin of group A was lower than those of groups B and C (all P<0.05). No significant difference was found between groups B and C (all P>0.05). ConclusionIGF-1R can promote the cell proliferation, and reduce the chemotherapy sensitivity of ovarian cancer cells to cisplatin and carboplatin.

Key words:ovarian carcinoma; insulin-like growth factor 1 receptor; cell proliferation; cisplatin; carboplatin; chemotherapy sensitivity

(收稿日期：2015-10-14)

中圖分類號：R737.31

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)10-0017-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.006

通信作者簡介：李君(1980-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向為卵巢癌的耐藥機制。E-mail: 45757875@qq.com

作者簡介：第一劉恩令(1966-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向為婦科腫瘤的基礎(chǔ)與臨床。E-mail: enling111@sina.com

基金項目：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃項目(ZD20140384)。