小鼠原發(fā)性肝癌建模方法的優(yōu)化

顧洪偉，陳琦，張煒，李玉桑，唐和斌

(中南民族大學藥學院藥理學研究室，武漢　430074)

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研究報告

小鼠原發(fā)性肝癌建模方法的優(yōu)化

顧洪偉，陳琦，張煒，李玉桑*，唐和斌

(中南民族大學藥學院藥理學研究室，武漢430074)

【摘要】目的建立良好、快捷、穩(wěn)定的小鼠原發(fā)性肝癌模型。方法將128只雄性KM小鼠隨機均分為8組：正常組給予自由飲食；二乙基亞硝胺(DEN)水溶液組每天給予含DEN(16.5 mg/kg)的水溶液；高劑量DEN麻油組(7次/周、3次/周、1次/周)，經(jīng)口給予含DEN(16.5 mg/kg)的麻油溶液；而低劑量DEN麻油組、nano-DEN組、納米載體組則分別每周經(jīng)口給予含DEN(8.25 mg/kg)的麻油溶液和nano-DEN或同量的納米載體。20周后，處死小鼠，取肝臟標本，固定后行HE染色。結(jié)果(1)含DEN的各組小鼠均出現(xiàn)不同程度毛色枯燥、無光澤、行動遲緩、體重增長緩慢；(2)20周時，同DEN水溶液組，高劑量DEN麻油組小鼠均出現(xiàn)腫瘤，且其1次/周的小鼠死亡率較低；(3)Nano-DEN組小鼠無死亡，且其肝臟損傷的HE評分較低劑量DEN麻油組嚴重。結(jié)論DEN溶于麻油的經(jīng)口給藥增加了小鼠服藥的順應(yīng)性，長期低頻率給藥能大大降低造模過程中的死亡率。而DEN的納米微乳制劑，能增強對肝臟的損傷程度。

【關(guān)鍵詞】二乙基亞硝胺；原發(fā)性肝癌；納米二乙基亞硝胺

原發(fā)性肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率和死亡率均為世界首位，是嚴重危害健康的重大疾病[1]。遺憾的是其發(fā)生機制尚未完全闡明。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機制，通過明確其發(fā)病機理來尋找防治肝癌的有效手段，是改善人類健康的重大科學問題之一[2]。

要研究肝癌的發(fā)生機制，首先要建立與人類肝癌自然發(fā)生過程相似的動物模型。常見的肝癌動物模型有：自發(fā)性肝癌模型、移植型肝癌模型、轉(zhuǎn)基因肝癌模型、化學誘發(fā)性肝癌模型。自發(fā)性肝癌由于發(fā)生情況不均，很難在短時間內(nèi)獲得大量類似的腫瘤學材料，且觀察時間長，實驗耗費較大，故在實際科研工作中較少使用。移植性肝癌模型操作繁雜，成功率依賴于技術(shù)的成熟性，因此較難獲得；轉(zhuǎn)基因動物肝癌模型制作技術(shù)要求極高，價格昂貴，國內(nèi)開展的研究尚較少；化學誘發(fā)性肝癌模型操作簡便，穩(wěn)定性強，成本低，且能較好的模擬人類肝癌的自然病理過程，制作方法簡單，是最常用的建模方法之一[3]?；瘜W誘發(fā)型肝癌模型最經(jīng)典方法的是將二乙基亞硝胺(DEN)溶于水中，給予小鼠自由飲用[4]。本實驗改變了給藥方式，即將DEN溶于麻油中經(jīng)口給藥，并探討了不同給藥頻率對小鼠死亡率的影響。

隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，納米材料因其具有靶向定位、緩釋控釋藥物、載藥量高、提高藥物吸收率等優(yōu)點而在藥物傳輸、癌癥治療、基因治療等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[5-8]。但是利用其負面生物效應(yīng)，在造模領(lǐng)域的應(yīng)用卻未見報道，本實驗期望通過DEN納米化，以達到緩釋及增強對肝臟損傷的作用，從而在短時間內(nèi)建立原發(fā)性肝癌的動物模型。

1材料與方法

1.1實驗動物

SPF級雄性KM小鼠，6～8周齡，體重18～22 g，購自湖北省實驗動物研究中心[SCXK(鄂)2008-0005]，動物實驗內(nèi)容及操作均獲中南民族大學動物實驗倫理委員會審批許可后[2012-SCUEC-AEC-002]，在中南民族大學藥學院SPF級屏障實驗設(shè)施中進行[SYXK(鄂)2014-0078]。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。對小鼠的處理符合2006年中國科學技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》[9]。

1.2試劑與儀器

二乙基亞硝胺(DEN，淡黃色液體，密度為0.94 g/mL)購自“梯希愛”上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；麻油購自武漢福達食用油調(diào)料有限公司；蘇木精購自南京建成科技有限公司；伊紅購自美國Amresco公司；多聚甲醛、無水乙醇、二甲苯購自國藥集團化學試劑有限公司。TP1020脫水機(德國Leica公司)；EG0050H石蠟包埋機(德國Leica公司)；RM2265切片機(德國Leica公司)；ALC-210.3型電子分析天平(德國Acculab公司)；Nikon 50i顯微成像系統(tǒng)(日本Nikon公司)。

1.3實驗方法

1.3.1誘癌劑配制

取347.5 μL(即330 mg)的DEN原液，加至5000 mL無菌蒸餾水中，即66 μg/mL的DEN水溶液為DEN水溶組小鼠的飲用水；取0.5 mL(即470 mg)的DEN原液加至10.9 mL麻油中，即41.25 mg/mL的DEN麻油溶液做高劑量DEN麻油組小鼠的誘癌劑；取0.25 mL(即235 mg)的DEN原液加至11.1 mL麻油中，即20.625 mg/mL的DEN麻油溶液做低劑量DEN麻油組小鼠的誘癌劑；Nano-DEN及納米載體由華中科技大學納米中心趙小靜博士制備(將4%的DEN溶于15.6%的麻油中，再加入1.2%蛋黃卵磷脂，溶解混勻，制成油相；將1% Tween 80和2.25%甘油加入75.55%的水中，制成水相；60℃條件下，油相滴入水相中，攪拌15 min；然后10 000 r/min高剪切2 min；最后100 Mpa高壓均質(zhì)5次即得到nano-DEN。納米載體油相為1.2%蛋黃卵磷脂溶于20%的麻油中，其余步驟與nano-DEN的制備相同)，nano-DEN終濃度為含20.625 mg/mL DEN。

1.3.2分組與DEN及nano-DEN誘導肝癌

將128只KM小鼠預飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境一周后分籠飼養(yǎng)，隨機取16只作為正常組，常規(guī)自由飲水。其余小鼠隨機均分為7組，每組16只小鼠：二乙基亞硝胺(DEN)水溶組每天按體重給予16.5 mg/kg(即2.5 mL/10 g)的DEN水溶液，且每天以普通過濾水補充不足；經(jīng)口高劑量組(7次/周、3次/周、1次/周)每周按體重經(jīng)口給予16.5 mg/kg(即4 μL/10g)的DEN麻油溶液；而經(jīng)口低劑量組(1次/周)、納米載體組(1次/周)、nano-DEN組(1次/周)則分別每周按體重經(jīng)口給予8.25 mg/kg(即4 μL/10g)的DEN麻油溶液、納米載體、nano-DEN。連續(xù)造模20周后，各組剩余小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，深度麻醉后快速脫臼處死，打開腹腔，取肝臟、肺和腎臟，取部分肝臟組織保存于-80℃冰箱中用于后續(xù)檢測。

1.3.3小鼠行為學及肝臟大體觀

每天觀察小鼠精神狀態(tài)，飲食狀況，被毛變化，并每周稱重，記錄每組小鼠死亡數(shù)；造模20周后，觀察各組剩余小鼠肝臟的形態(tài)、顏色、質(zhì)地和肉眼可見的肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)；計算小鼠存活率，存活率=每組存活的小鼠數(shù)/各組小鼠總數(shù) × 100%。

1.3.4病理觀察

切取所有實驗組小鼠(包括前期死亡)的肝臟右葉，4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片機制成4 μm連續(xù)石蠟切片；同步烤片，然后脫蠟，梯度酒精水化，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin and eosin，HE)染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹脂封片；光鏡下胞質(zhì)染為紅色，細胞核染為藍色。

1.4統(tǒng)計學處理

2結(jié)果

2.1各組小鼠行為學及體重變化

正常組及納米載體組小鼠活潑好動、反應(yīng)靈活、皮毛光澤，其余各組小鼠均出現(xiàn)不同程度毛色枯燥、發(fā)黃、無光澤、行動遲緩。且隨著給藥頻率和給藥劑量的增加，小鼠癥狀加重。與正常組相比，納米載體組、低劑量DEN麻油組、nano-DEN組小鼠體重無明顯差異，而DEN水溶組及高劑量DEN麻油組小鼠體重均明顯低于正常組小鼠。各組體重變化，見圖1 A, B。

2.2各組小鼠存活率

造模過程中，正常組、納米載體組、低劑量DEN麻油組、nano-DEN組均未出現(xiàn)小鼠死亡，未發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌的發(fā)生。20周時，DEN水溶組小鼠的死亡率為75%(圖1 C)，存活4只小鼠均有肉眼可見腫瘤結(jié)節(jié)；高劑量DEN麻油(7次/周)組小鼠死亡率為75%，存活4只小鼠均有肉眼可見腫瘤結(jié)節(jié)；高劑量DEN麻油(3次/周)組小鼠的死亡率為37.5%，存活10只小鼠中有5只肉眼可見腫瘤結(jié)節(jié)，有1只小鼠雖未見肉眼腫瘤結(jié)節(jié)，但鏡下可見腫瘤結(jié)節(jié)；高劑量DEN麻油(1次/周)組小鼠的死亡率為25%，存活12只小鼠中有5只肉眼可見腫瘤結(jié)節(jié)。

注: A.正常組(NG)；B. DEN水溶組(DWG)；C. 高劑量DEN麻油每周7次組(HDO7G)；D. 高劑量DEN麻油每周3次組(HDO3G)；E. 高劑量DEN麻油每周1次組(HDO1G)；F. 低劑量DEN麻油每周1次組(LDO1G)；G. 納米載體組(NVG)；H.納米DEN每周1次組(NDG)。與正常組比較，***P<0.001。圖1　誘癌過程中各組小鼠的體重變化及死亡率Note. NG: Normal group; NVG: Nano-vehicle group; HDO7G: High-dose DEN-oil (7 times per week) group; HDO3G: High-dose DEN-oil (3 times per week) group; HDO1G: High-dose DEN-oil (once per week) group; LDO1G: Low-dose DEN-oil (once per week) group; NG1G: Nano-DEN (once per week) group. ***P<0.001, compared with the normal group.Fig. 1　The changes of body weight (A, B) and survival rates (C) of mice in various groups during the liver carcinogenesis.

2.3小鼠肝臟肉眼和病理觀察

注：(A)和(B)中，a.正常組；b.納米載體組；c.DEN水溶組；d.高劑量DEN麻油每周7次組；e.高劑量DEN麻油每周3次組；f.高劑量DEN麻油每周1次組；g.低劑量DEN麻油每周1次組；h.納米DEN每周1次組。(B)中標尺為100 μm，右上角為黑框中所示局部圖(×100)的放大圖(×400)。圖2　20周時，各組小鼠肝臟肉眼觀及肝臟組織病理學觀Note. (A, B) a: Normal group; b: Nano-vehicle group; c: High-dose DEN-oil (7 times per week) group; d: High-dose DEN-oil (3 times per week) group; f: High-dose DEN-oil (once per week) group; g: Low-dose DEN-oil (once per week) group; h: Nano-DEN (once per week) group. (B) Part of the arbor (stippled outline, ×100) is shown enlarged in the inset (×400) in the top right-hand corner, Scale bar=100 μm.Fig. 2　Representative pictures of the gross liver appearance (A) and their histological images (B)(HE staining) from various groups at the 20th week.

肝臟組織標本的肉眼觀察，正常組及納米載體組小鼠肝臟色澤鮮紅，表面光滑，質(zhì)地柔軟，未見任何病變，見圖2 A(a, b)。而前期死亡小鼠大體檢查則見其肝臟腫大、顏色偏黃，部分可見邊緣發(fā)黑。水溶DEN及高劑量DEN麻油組肉眼均可見的腫瘤結(jié)節(jié)。小鼠肝臟表面較多結(jié)節(jié)，表面粗糙，色彩暗淡，可見多個大小不一的灰白色圓形結(jié)節(jié)，見圖2A(c, d, e, f)。另有小鼠肉眼未見肝臟腫瘤結(jié)節(jié)，但肝臟表面粗糙，顏色暗淡。Nano-DEN組小鼠肝臟體積增大，肉眼可見白色顆粒，見圖2A(h)。其余臟器肉眼觀未見其他腫瘤結(jié)節(jié)發(fā)生。

光鏡下觀察，正常及納米載體組小鼠肝細胞排列整齊，核大小一致，且分布均勻，肝細胞索圍繞中央靜脈，呈放射狀分布，肝竇清晰，見圖2B(a, b)。而前期死亡小鼠肝組織鏡檢則可見急性大面積肝細胞腫脹、壞死，尚未見腫瘤形成。DEN水溶及高劑量DEN麻油組小鼠，明顯可見具有被膜形成的結(jié)節(jié)灶，細胞排列結(jié)構(gòu)紊亂，大小、形態(tài)各異，染色質(zhì)明顯增粗，胞質(zhì)豐富，可見病理性核分裂像，分化較差的肝細胞內(nèi)可見巨核，表明細胞異型性明顯，見圖2B(c, d, e, f)。低劑量DEN麻油組及nano-DEN組出現(xiàn)肝細胞變性壞死，炎細胞浸潤，大量空泡脂肪變性，且nano-DEN組較經(jīng)口低劑量組嚴重，見圖2B (g, h)。

3討論

化學誘導型肝癌模型是研究肝癌最好的模型之一，DEN是迄今應(yīng)用最廣泛的一種化學誘導型肝癌模型制劑[10]。并且亞硝胺類化合物普遍存在于谷物、牛奶、干酪、煙酒、熏肉、烤肉、海魚、罐裝食品以及飲水中[11]。傳統(tǒng)造模方法將DEN溶于水中，給予小鼠自由飲用，但是往往實驗周期比較長，個體差異大，且死亡率高[12]。實驗過程中，由于多種條件的限制，尤其是實踐方面，死亡率方面的制約，要求我們必須建立更好、更快的造模方法。本實驗的研究思路圍繞該目的所展開。

本實驗發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)造模方法即將DEN溶于水中給予小鼠自由飲用，小鼠順應(yīng)性差，個體差異大，且死亡率高。通過將DEN溶于麻油經(jīng)口給藥增加了小鼠服藥的順應(yīng)性，克服了DEN水溶造模小鼠之間的個體差異。二十周時，DEN水溶組及經(jīng)口高劑量組小鼠肉眼均可見腫瘤結(jié)節(jié)，但1次/周經(jīng)口給藥組小鼠死亡率最低，即長期低頻給藥能大大降低造模過程中的死亡率。

為了更好地模擬人們可能因長期接觸環(huán)境中有毒、有害化學物質(zhì)，以及長期服用肝毒性藥物造成肝臟損傷甚至肝癌的情況，本實驗設(shè)立了低劑量DEN麻油組及nano-DEN組。二十周時，低劑量DEN麻油組及nano-DEN組小鼠肝臟均見細胞壞死，炎細胞浸潤及脂肪化，且nano-DEN組較低劑量DEN麻油組嚴重。表明DEN經(jīng)納米化后對肝臟產(chǎn)生更為嚴重的損傷。Nano-DEN有望作為建立原發(fā)性肝癌更好的誘導劑。

理想的肝癌動物模型應(yīng)與人類大多數(shù)肝癌病理組織類型相一致，具有合適的腫瘤體積、生長速度和存活時間，腫瘤的組織類型、生物學特點應(yīng)相對穩(wěn)定，操作簡便，復制迅速，成功率高，重復性好[13]。本實驗采用實驗室廣泛使用的KM小鼠，以DEN為誘癌劑，通過經(jīng)口給藥，20周時成功建立了小鼠原發(fā)性肝癌模型，并克服了DEN水溶造模的缺陷。由于誘導肝癌是通過小劑量長時間的刺激肝臟癌變，一般實驗時間需要18～24周，而將DEN納米化后，能增強DEN對肝臟的損傷作用，因此nano-DEN有望能在更短時間內(nèi)建立原發(fā)性肝癌動物模型。

參考文獻

[1]Song P, Tang W, Tamura S, et al. The management of hepatocellular carcinoma in Asia: A guideline combining quantitative and qualitative evaluation [J]. Biosci Trends, 2010, 6: 283-287.

[2]Tang ZY, Ye SL, Liu YK, et al. A decade’s studies on metastasis of hepatocellular carcinoma [J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2004, 130: 187-196.

[3]劉煌, 劉靜. 肝癌動物模型的研究進展 [J]. 世界華人消化雜志, 2011, 19(12): 1275-1278.

[4]Shen T, Khor SC, Zhou F, et al. Chemoprevention by lipid-soluble tea polyphenols in diethylnitrosamine/phenobarbital-induced hepatic pre-cancer lesions [J]. Anticancer Res, 2014, 34(2): 683-693.

[5]Qu L, Cao WB, Xing GG, et al. Study of rare earth encapsulated carbon nanomolecules for biomedical uses [J]. J Alloy Compound, 2006, 408-412.

[6]Tang N, Du G, Wang N, et al. Improving penetration in tumors with nanoassemblies of phospholipids and doxorubicin[J]. J Natl Cancer Inst, 2007, 99(13): 1004-1015.

[7]Zhao XJ, Chen Q, Tang HB, et al. Codelivery of doxorubicin and curcumin with lipid nanoparticles results in improved efficacy of chemotherapy in liver cancer [J]. Int J Nanomed, 2015, 10: 257-270.

[8]Li Z, Zhu S, Gan K, et al. Poly-L-lysine-modified silica nanoparticles: a potential oral gene delivery system [J]. J Nanosic Nanotechnol, 2005, 5(8): 1199-1203.

[9]中華人民共和國科學技術(shù)部.關(guān)于善待實驗動物的指導性意見[S]. 2006-09-30.

[10]Ogawa. Molecular pathology of early stage chemically induced hepatocarcinogenesis [J]. Pathol Int, 2009, 59(9): 605-622.

[11]曾瑤池, 胡敏予. 食物中N-亞硝基化合物與腫瘤關(guān)系的研究進展 [J]. 中華腫瘤防治雜志, 2008, 15(2): 151-155.

[12]張立潔, 楊春. 化學性藥物誘發(fā)肝癌模型的研究進展 [J]. 醫(yī)學研究雜志, 2009, 38(6): 12-14.

[13]王楚盈, 李超英，張大方. 肝靶向動物模型研究與展望 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2008, 18(2): 63-67.

Optimization of the establishment method of mouse model of hepatocellular carcinoma

GU HONG-wei, CHEN QI, ZHANG WEI, LI Yu-sang*, TANG He-bin

(Department of Pharmacology, College of Pharmacy, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

【Abstract】ObjectiveTo develop an efficient, fast and stable establishment method of mouse model of hepatocellular carcinoma. Methods 128 healthy Kunming male mice were equally divided into eight groups: normal group supplied with routine drinking water and food; diethylnitrosamine (DEN)-water group received 16.5 mg/kg DEN in drinking water every day; high-dose DEN-oil groups received orally 16.5 mg/kg of DEN oil solution once, 3 times and 7 times per week, respectively; low-dose DEN-oil group and nano-DEN group received orally 8.25 mg/kg DEN in oil or in nano-vehicle every week, while nano-vehicle group received only an equal amount of nano-vehicle. After twenty weeks, all mice were sacrificed. The paraffin-embedded mouse liver specimens were examined by pathology using HE staining. Results (1) The mice treated with DEN solution showed dry and dull hair, slow movement and slow weight-gain to a varying degree. (2) At the twentieth week, both the DEN-water group and high-dose DEN-oil group showed tumors, and the mortality of high-dose DEN-oil group (once per week) was low. (3) There was no death of mice in the nano-DEN group, and the pathological examination revealed more serious liver injury in the nano-DEN group than in the low-dose DEN-oil group (once per week). Conclusions Oral administration of DEN-oil improved the dietary compliance of mice, and the mortality can be reduced significantly by long-term low frequency DEN administration. Microemulsion preparation of DEN dissolved in oil may enhance the DEN-induced liver damage.

【Key words】Diethylnitrosamine; Hepatocellular carcinoma; Nano-diethylnitrosamine

[收稿日期]2015-09-01

Corresponding author:LI Yu-sang, E-mail: liys2006@mail.scuec.edu.cn

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2016.01.004

【中圖分類號】Q95-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1005-4847(2016) 01-0020-05

[作者簡介]顧洪偉(1990-)，男，碩士研究生，專業(yè)：中藥藥理。E-mail: ghw901025@126.com[通訊作者]李玉桑(1972-)，女，教授，研究方向：原發(fā)性肝癌的形成機制與藥物干預。E-mail: liys2006@mail.scuec.edu.cn

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81101538; No. 81573887)；中南民族大學中央高校科研基金(No.CZZ15007)；湖北省自然科學基金項目(No. 2015CFB496)。