新生血管、淋巴管在結(jié)直腸癌進(jìn)展中的作用

張林西　郭　穎　白美玲

(河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心，河北　張家口　075000)

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新生血管、淋巴管在結(jié)直腸癌進(jìn)展中的作用

張林西郭穎白美玲

(河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心，河北張家口075000)

〔摘要〕目的研究血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、CD105、D2-40在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及三者與結(jié)直腸癌患者臨床病理因素之間的相關(guān)性。方法收集結(jié)直腸癌標(biāo)本99例及30例癌旁正常組織，應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測VEGF、CD105、D2-40在以上標(biāo)本中的表達(dá)，分析VEGF、CD105、D2-40的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理因素的相關(guān)性，以及三者協(xié)同表達(dá)情況。結(jié)果VEGF、CD105標(biāo)記的微血管密度(MVD)值、D2-40標(biāo)記的微淋巴管密度(LVD)值在癌組織中的表達(dá)均顯著高于癌旁正常組織(P<0.05)；其表達(dá)與是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均顯著相關(guān)(P<0.05)；結(jié)直腸癌中VEGF與CD105 、CD105與D2-40的表達(dá)均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論VEGF、CD105、D2-40可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用；其高表達(dá)對結(jié)直腸癌的惡性程度及預(yù)后評估有一定的應(yīng)用價值。

〔關(guān)鍵詞〕結(jié)直腸癌；免疫組織化學(xué)；血管內(nèi)皮生長因子；微血管密度；微淋巴管密度

研究表明，血管生成和新生淋巴管的形成在腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移中起著重要作用〔1,2〕。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)被認(rèn)為是腫瘤血管新生最重要的調(diào)控因子之一，其在促進(jìn)腫瘤生成、免疫逃脫、浸潤轉(zhuǎn)移及淋巴管的形成中發(fā)揮重要作用。CD105在腫瘤血管新生中也發(fā)揮重要作用，同時是腫瘤新生血管較好的標(biāo)記物，標(biāo)記效果強(qiáng)于CD34、CD31。D2-40是腫瘤淋巴管的特異標(biāo)記物，不與血管內(nèi)皮反應(yīng)，只與新生淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞、微小淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)。本研究采用免疫組織化學(xué)方法，檢測VEGF在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)；選用CD105標(biāo)記微血管密度(MVD)和D2-40標(biāo)記微淋巴管密度(LVD)，分析在結(jié)直腸癌浸潤進(jìn)展過程中，VEGF表達(dá)與血管新生、淋巴管新生的關(guān)系及與結(jié)直腸癌臨床病理因素之間的關(guān)系，旨在探討血管新生、淋巴管生成在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1材料與方法

1.1標(biāo)本收集收集河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院2011年3月至2013年2月期間的結(jié)直腸癌標(biāo)本99例、癌旁正常組織30例，患者術(shù)前均未進(jìn)行任何放療、化療等治療。其中結(jié)腸癌40例，直腸癌59例；男53例，女46例；年齡<60歲40例，>60歲59例；組織分化程度：高、中分化腺癌83例，低分化腺癌16例；淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移55例，有轉(zhuǎn)移44例。

1.2主要試劑及方法兔抗人VEGF多克隆抗體、鼠抗人CD105單克隆抗體、鼠抗人D2-40單克隆抗體、PV9000二步法免疫檢測試劑盒等均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。所取標(biāo)本常規(guī)處理、石蠟切片，常規(guī)HE染色。免疫組化采用高壓修復(fù)法，余均按說明書操作。

1.3結(jié)果判定以磷酸鹽緩沖液(PBS)液代替一抗作為陰性對照，以已知結(jié)直腸癌陽性切片作為陽性對照。由兩名病理學(xué)醫(yī)師在顯微鏡下進(jìn)行雙盲閱片。

1.3.1VEGF的結(jié)果判定參照J(rèn)awhari等〔3〕的方法。400倍視野下隨機(jī)選取的5個不相重疊區(qū)域進(jìn)行觀察，根據(jù)顯色程度與顯色數(shù)量分別計分。顯色程度：不顯色0分；淺黃色1分；黃色2分，棕黃色3分。顯色數(shù)量：(X=陽性細(xì)胞數(shù))X<6%，0分；6%≤X<25%，1分；25%≤X<50%，2分；50%≤X<75%，3分；75%≤X，4分。取5個視野兩數(shù)值相乘的平均值，即為該切片計分。計分≤4，為陰性；4<計分，為陽性。

1.3.2CD105與D2-40的結(jié)果判定參照Weidner等〔4〕報道的方法，100倍鏡下選取管腔密度最高處，作為主要觀察區(qū)；400倍鏡下，于主要觀察區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取5個視野計數(shù)(染成棕褐色的單個內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞簇或直徑<8個紅細(xì)胞大小的管腔給予計數(shù))，取平均值。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行χ2檢驗及秩和檢驗。各指標(biāo)的相關(guān)性用Spearman相關(guān)分析法。

2結(jié)果

2.1VEGF的表達(dá)及其與臨床病理因素間的關(guān)系VEGF在癌旁正常組織中為細(xì)胞質(zhì)呈淺黃色的陽性表達(dá)，而在結(jié)直腸癌組織中它的表達(dá)往往增強(qiáng)，呈黃色或棕黃色。正常黏膜組VEGF僅有36.7%(11/30)的陽性表達(dá)，而在結(jié)直腸癌組陽性表達(dá)率為66.7%(66/99)，組間比較有明顯差異(P<0.01)。VEGF陽性表達(dá)率與是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、性別呈正相關(guān)(P<0.01)。但與患者的年齡、結(jié)直腸癌的分化程度及發(fā)生部位無關(guān)(P>0.05)。見表1。

2.2CD105的表達(dá)及其與臨床病理因素間的關(guān)系CD105在癌旁正常組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，表達(dá)較弱，MVD值較低(16.80)；而在結(jié)直腸癌組織中，CD105的表達(dá)增強(qiáng)，MVD值明顯增高(79.61)，差異顯著(P<0.01)。CD105標(biāo)記的MVD值在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(54.67)顯著高于無轉(zhuǎn)移組(44.16，P<0.05)；在高中分化組(52.70)顯著高于低分化組(36.00，P<0.05)。同時年齡≥60歲組MVD值(54.83)顯著高于年齡<60歲組(42.88，P<0.05)，女性組(58.27)高于男性組(42.82，P<0.05)，但與癌的發(fā)生部位無相關(guān)性(P>0.05)。

表1　VEGF表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理因素的關(guān)系〔n(%)〕

與男性組比較：1)P<0.05；與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較：2)P<0.01

2.3D2-40的表達(dá)及其與臨床病理因素間的關(guān)系D2-40在癌旁正常組織的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中，為弱陽性表達(dá)，LVD值較低(42.22)；而在結(jié)直腸癌組織中，D2-40的表達(dá)增強(qiáng)，LVD值增高(71.90)，差異顯著(P<0.01)。D2-40標(biāo)記的LVD值在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(73.56)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(42.76，P<0.05)。但與患者的年齡、性別、癌的分化程度及發(fā)生部位等無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

2.4VEGF、CD105、D2-40表達(dá)的相關(guān)性VEGF蛋白與CD105蛋白的表達(dá)之間呈顯著正相關(guān)(r=0.200，P=0.047)，CD105與D2-40的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.234，P=0.019)，VEGF與D2-40的表達(dá)之間無顯著相關(guān)性(r=-0.078，P=0.442)。

3討論

VEGF與CD105均可促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，在腫瘤的生長與血行轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用；VEGF還可以促進(jìn)腫瘤淋巴管的新生，在腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用；CD105 也是新生腫瘤血管常用標(biāo)記物，只表達(dá)于正在進(jìn)行分裂增殖的新生血管內(nèi)皮，標(biāo)記效果強(qiáng)于CD34、CD31；D2-40能特異標(biāo)記腫瘤淋巴管。本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF、CD105、D2-40在癌旁正常組織中表達(dá)均較弱，而在癌中表達(dá)均增強(qiáng)；VEGF、CD105、D2-40在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)均較弱，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌中表達(dá)均增強(qiáng)。說明VEGF、CD105和D2-40在結(jié)直腸癌的生長與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

VEGF、CD105通過促進(jìn)腫瘤血管的生成進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長，同時促進(jìn)腫瘤的血行轉(zhuǎn)移。腫瘤需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)與氧氣才能生長，它們主要由腫瘤新生血管提供。若無新生血管形成，當(dāng)腫瘤直徑>2~3 mm，腫瘤中心就會萎縮、壞死。而沒有新生血管的形成，腫瘤也無法完成血行轉(zhuǎn)移。VEGF是血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子；它通過與其受體結(jié)合，激發(fā)系列反應(yīng)，促進(jìn)血管內(nèi)皮增殖，增加微血管通透性，降解細(xì)胞外基質(zhì)，最后導(dǎo)致腫瘤新生血管的形成。CD105又稱Endoglin，是轉(zhuǎn)化生長因子β受體復(fù)合物的重要組成成分之一，它參與了腫瘤血管新生的重要信號的傳遞過程。CD105在多種惡性腫瘤均有表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度與惡性程度或術(shù)后復(fù)發(fā)率正相關(guān)〔5，6〕。有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸腺瘤由輕度、重度不典型增生至腺癌發(fā)展的過程中，CD105標(biāo)記的MVD值逐漸升高，表明CD105預(yù)測結(jié)直腸腺瘤癌變的有效指標(biāo)，提示CD105有助于早期診斷疾病。CD105在多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)，且與預(yù)后相關(guān)〔7，8〕。

腫瘤轉(zhuǎn)移主要途徑除血行轉(zhuǎn)移外，還有淋巴轉(zhuǎn)移；新生淋巴管的形成是淋巴轉(zhuǎn)移的核心環(huán)節(jié)。VEGF與其受體結(jié)合后也能促進(jìn)新生淋巴管的形成。D2-40能特異標(biāo)記腫瘤淋巴管。D2-40抗體作為抗癌胚抗原M2A的IgG2a型鼠源性單克隆抗體，最初是從胎兒的睪丸和生殖細(xì)胞腫瘤中發(fā)現(xiàn)的。M2A表達(dá)于腫瘤新生淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞與幼稚毛細(xì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，而不表達(dá)于血管內(nèi)皮 。D2-40檢測的特異性和敏感度均高于其他分子標(biāo)記物〔9，10〕。現(xiàn)在認(rèn)為，病灶中的LVD反映腫瘤淋巴管生成狀態(tài)，與腫瘤的分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)〔11〕。郝秀輕等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)食管癌周邊區(qū)淋巴管明顯高于中心區(qū)和正常組織。

本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF表達(dá)的陽性率及CD105標(biāo)記的MVD值均與性別相關(guān)，未見文獻(xiàn)報道。VEGF在男性表達(dá)的陽性率高于女性，男性CD105標(biāo)記的MVD值明顯低于女性，提示男女體內(nèi)的某些差別(如雌激素水平)，可能是造成VEGF與CD105表達(dá)差異的原因。CD105標(biāo)記的MVD值與患者年齡呈正相關(guān)，提示隨著年齡增加維持腫瘤生長所需的血管數(shù)也在增加。

VEGF可以促進(jìn)腫瘤血管與淋巴管的新生，腫瘤血管的新生可以促進(jìn)腫瘤的生長和血行轉(zhuǎn)移，淋巴管的新生可以促進(jìn)腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移〔13〕。腫瘤的分期越高，VEGF、CD105、D2-40的表達(dá)越強(qiáng)，可見VEGF、CD105、D2-40在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

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〔2014-09-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

〔中圖分類號〕R735

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1116-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.043

基金項目：河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項目(No.ZD20131004)

第一作者：張林西(1968-)，男，教授，博士，主要從事消化道腫瘤研究。