白介素-17A對壓力過負荷心衰小鼠的影響

安　君　李永財　劉旭光　安　康　高　健　呂君其　李　雄　楊海波

(寧夏人民醫(yī)院　西北民族大學附屬第一臨床學院心胸外科，寧夏　銀川　750021)

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白介素-17A對壓力過負荷心衰小鼠的影響

安君李永財劉旭光1安康2高健呂君其李雄楊海波

(寧夏人民醫(yī)院西北民族大學附屬第一臨床學院心胸外科，寧夏銀川750021)

〔摘要〕目的觀察白介素(IL)-17A、基質金屬蛋白酶(MMP)-2以及MMP-9在小鼠過負荷心衰形成中的影響。 方法選用C57BL/6 野生型小鼠為對照組，以IL-17A基因敲除小鼠(IL17A-/-)為實驗組，經(jīng)胸骨上窩利用部分夾閉主動脈弓心衰模型，測量心臟體重比(HW/BW)、心臟超聲指標、MMP-2以及MMP-9 mRNA表達。結果C57BL/6野生型小鼠主動脈弓縮窄手術組(WT-AC組)10 w發(fā)生心衰，與C57BL/6野生型小鼠假手術組(WT-Sham組)比較，左室舒張末期直徑(LVEDD)和左室收縮末期直徑(LVESD)明顯增大(P<0.01)、 左室后壁舒張末期厚度(LVPWD)和射血分數(shù)(EF)明顯變小(P< 0.01)；rIL-17A無變化(P>0.05)，僅LVPWD變小(P< 0.01)；LVPWD和EF變小(P< 0.01)；WT-AC組HW/BW較WT-Sham組增大(P< 0.01)；IL-17A-/-主動脈弓縮窄手術組(IL-17A-/-AC組)與WT-Sham組比較增加(P< 0.01)；和IL-17A-/-假手術組(IL-17A-/-Sham組)比較亦增加(P< 0.05)；WT-AC組的MMP-2和MMP-9 mRNA表達較WT-Sham組增強(P< 0.01)；rIL-17A腹腔給予WT-Sham組比較其表達也增強(P< 0.01)；IL-17A-/-AC組與WT-Sham組比較，其mRNA表達增強(P< 0.01)；與WT-AC組比較，其表達明顯下降(P< 0.01)。結論本研究提示IL-17A基因敲除后心衰過程減緩，MMP-2和MMP-9 mRNA表達增強提示IL-17A直接以及通過MMP-2和MMP-9表達參與過負荷心衰過程，IL-17A以及MMP-2和MMP-9通路是減輕、減緩心衰形成、發(fā)展的干預靶點之一。

〔關鍵詞〕小鼠；心衰；模型；白介素17A； 基因敲除

心衰是高血壓等多種心血管疾病所共有的終末期病理改變〔1〕。 至今壓力過負荷所致心衰機制仍不清楚，是心血管領域亟待解決的熱點。研究心衰的發(fā)生、發(fā)展及轉歸的基礎是建立穩(wěn)定、可靠心衰模型并在此基礎上進行各種研究。本研究利用穩(wěn)定、可靠的小鼠心衰模型，觀察白介素(IL)-17A〔2〕對心衰形態(tài)功能以及對基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9 mRNA表達的影響，初步探討其可能的作用機制。

1材料和方法

1.1實驗動物和分組實驗動物: 選用8~10周齡、體重20~25 g的成年雄性小鼠。其中 IL-17A基因敲除雄性小鼠(IL-17a-/-)，由日本JUMRO公司石井鐵男惠贈。C57BL/6野生型小鼠購自吉林白求恩醫(yī)學院動物實驗中心。動物的日常管理及實驗研究依照美國國立衛(wèi)生研究所頒布的《實驗動物飼養(yǎng)和使用指南》和《吉林白求恩醫(yī)學院實驗動物管理辦法》進行。鼠重組IL-17A(rIL-17A)購自美國R&D公司。

實驗動物 40 只，隨機分為5組：C57BL/6 野生型小鼠假手術組(WT-Sham 組,n=8)；C57BL/6 野生型小鼠主動脈弓縮窄手術組(WT-AC組,n=8)；C57/BL6 假手術+重組IL-17A腹腔注射組(WT + rIL-17A組,n=8)，該組動物于手術前 10 min注射 2.0 μg rIL-17，術后每周注射兩次，每次2.0 μg rIL-17A〔3〕，直至5 w；IL-17A基因敲除小鼠假手術組(IL-17A-/-Sham 組，n=8)；IL-17A基因敲除小鼠主動脈弓縮窄手術組(IL-17A-/-AC組，n=8)。

1.2過負荷小鼠心衰模型制備戊巴比妥鈉(30 mg/kg體重)腹腔內麻醉，在小鼠胸骨上窩縱行切開約1~2 cm皮膚，顯露右無名動脈和左頸總動脈間隙，用鉭夾部分夾閉右無名動脈和左頸總動脈間的主動脈弓(縮窄后主動脈直徑為0.35 mm)。假手術組，手術操作與模型制備組步驟完全相同，僅不用鉭夾夾閉。

1.3心臟超聲動態(tài)觀察部分夾閉主動脈弓10 w后在相同麻醉下首先進行心臟超聲觀察，通過17 MHz探頭(General Electric,Vivid V echocardiograph)觀察左室舒張末期直徑(LVEDD)、左室收縮末期直徑(LVESD)、左室后壁舒張末期厚度(LVPWD)以及射血分數(shù)(EF)。

1.4心/體重比(HW/BW)計算心臟超聲觀察完畢后將小鼠處死，分別稱體重和心臟重量，獲得心臟HW/BW之比(mg/g)

1.5RT-PCR MMP-2和MMP-9 mRNA表達小鼠心肌組織總RNA 提?。喊碩rizol 法提取說明書提取〔4〕。RNA 逆轉錄成cDNA：按RNase H-reverse transcriptase 試劑盒(Invitrogen,USA)說明書步驟進行。實時定量 PCR 檢測：按 SYBR Green Master Mix(Takara,Japan)說明書試劑盒步驟進行。應用 ABI Prism 7900 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)分析，用β-actin作為內參照標化。

小鼠MMP-2、MMP-9以及β-actin引物序列：基因名稱MMP-2上游引物(5′-3′) ：CACACCAGGTGAAGGATGTG，下游引物(5′-3′)：GCCCTCCTAAGCCAGTCTCT；MMP-9上游引物(5′-3′)：CGTGTCTGGAGATTCGACTTGA，下游引物(5′-3′)；TGGAAGATGTCGTGTGAGTTCC；β-actin上游引物(5′-3′)：CCCATCTATGAGGGTTACGC，下游引物(5′-3′)：TTTAATGTCACGCACGATTTC。β-actin(GenBank accession No EF095208)，330 bp，退火溫度58.0℃，MMP-2(GenBank No.NM 004530)，162 bp，退火溫度59.1℃；MMP-9(GenBank No.NM 004994)682 bp，退火溫度62.7℃。

1.6統(tǒng)計學方法應用 SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1心臟超聲動態(tài)觀察WT-AC組10 w發(fā)生心衰，與WT-Sham組比較，LVEDD和LVESD明顯增大，而LVPWD和EF明顯變小(P<0.01)；WT+rIL-17A組與WT-Sham組比較，LVEDD、LVESD無變化，僅LVPWD和EF變小(P< 0.01)；與WT-AC組比較，IL-17A-/-AC組的LVEDD、LVESD明顯變小，而LVPWD和EF明顯增大(P<0.05)。見表1。

2.2各組HW/BW之比測定WT-AC組HW/BW〔(7.51 ± 0.48)mg/g〕較WT-Sham組〔(3.93 ± 0.46)mg/g〕增大(P< 0.05)；WT+rIL-17A組〔(4.30 ± 0.32)mg/g〕與WT-Sham組〔(3.93 ± 0.46)mg/g〕比較無變化(P>0.05)；IL-17A-/-Sham組與WT-Sham組比較無變化(P>0.05)；IL-17A-/-AC組(4.54 ± 0.35)與WT-Sham組(3.93 ± 0.46)和IL-17A-/-Sham組(3.73 ± 0.18)比較明顯增加(P<0.01)。

表1　各組心臟超聲指標測定

與WT-Sham組比較：1)P<0.01; 與WT-AC組比較：2)P<0.05; 與IL-17A-/-Sham組比較：3)P<0.05,4)P<0.01

2.3各組MMP-2和MMP-9 mRNA表達改變WT-AC組的MMP-2和MMP-9 mRNA表達較WT-Sham組明顯增強(P<0.01)；WT+rIL-17A組與WT-Sham組比較其表達也明顯增強(P<0.01)；IL-17A-/-AC組與WT-Sham比較，其mRNA表達顯著增強(P<0.01)，見表2。

表2　各組MMP-2和MMP-9 mRNA表達改變

與WT-Sham組比較：1)P<0.01;與WT-AC組比較：2)P<0.01；與IL-17A-/-Sham組比較：3)P<0.01

3討論

高血壓等引起心臟后負荷增加最后導致心衰〔1〕,過負荷心衰以往大都用結扎部分主動脈方法，這種方法因結扎材料、打結方法等原因使其心衰模型形成時間和心衰程度不一而影響氣候的研究結果。我們通過固定的鉭夾直徑控制夾閉程度建立心臟過負荷心衰模型，使其心衰模型形成時間、程度基本一致，從心衰模型制備上降低了實驗誤差。心衰主要的形態(tài)學改變是左室擴大、舒張功能障礙，進而導致全心衰竭〔1,5〕。Il-17A是由Th17細胞分泌的細胞因子〔2〕，通過自分泌/旁分泌誘導其他細胞因子，通過誘導MMP-2,MMP-9等因子參與心肌損傷、炎癥、心肌纖維化和心臟重塑〔2,6〕。本研究結果說明過負荷是引起心衰的主因，IL-17A參與心衰過程，MMP-2和MMP-9也參與心衰過程。另外IL-17A直接參與過負荷引起的心衰過程，亦通過調控MMP-2和MMP-9 mRNA表達參與心衰。MMP-2和MMP-9 mRNA表達除了IL-17A外，受其他因子的調控，提示在過負荷心衰過程中除IL-17A外，其他因子通過調控MMP-2和MMP-9表達機制參與心衰。本研究提示在過負荷心衰中心臟超聲中以LVPWD為最早變化(變薄)的指標，在心衰早期診斷上具有意義，而IL-17A基因敲除后心衰過程減緩、MMP-2和MMP-9 mRNA表達減弱，提示IL-17A直接以及通過MMP-2和MMP-9表達機制參與過負荷心衰過程，可能成為診斷早期心衰的指標，通過干預IL-17A以及MMP-2和MMP-9通路是減輕、減緩心衰形成發(fā)展的靶點之一。

4參考文獻

1Weinberg EO,Schoen FJ,George D,etal.Angiotensin-converting enzyme inhibition prolongs survival and modifies the transition to heart failure in rats with pressure overload hypertrophy due to ascending aortic stenosis〔J〕.Circulation，1994;90(3):1410-22.

2Wu L,Ong S,Talor MV,etal.Cardiac fibroblasts mediate IL-17A-driven inflammatory dilated cardiomyopathy〔J〕.J Exp Med,2014；211(7):1449-64.

3郭盛,張建華,吳良霞,等.重組白細胞介素-17A鼻黏膜免疫抗肺炎鏈球菌感染的實驗研究〔J〕.中華微生物學和免疫學雜志,2012;32(3):258-63.

4劉旭光,安君,所劍,等.轉化生長因子β1對巨噬細胞清道夫受體A和B(CD36)功能的影響〔J〕.吉林大學學報(醫(yī)學版),2009;35(2): 284-7.

5Valente AJ,Yoshida T,Gardner JD,etal.Interleukin-17A stimulates cardiac fibroblast proliferation and migration via negative regulation of the dual-specificity phosphatase MKP-1/DUSP-1〔J〕.Cell Signal,2012;24(2):560-8.

6Kemp CD,Conte JV.The pathophysiology of heart failure〔J〕.Cardiovasc Pathol，2012;21(5):365-71.

〔2015-10-25修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

〔中圖分類號〕R541.6

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1046-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.010

基金項目：吉林省科技發(fā)展計劃資助項目(200705151, 20080730)

1吉林大學第一醫(yī)院心臟外科

2上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院心胸外科

第一作者：安君(1963-)，男，教授，博士，博士生導師，主要從事心衰的機制研究。