β-細辛醚對抑郁模型大鼠海馬和血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶變化的干預(yù)作用

劉得水　興桂華　盧長方　高志影　張曉杰

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江　齊齊哈爾　161006)

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β-細辛醚對抑郁模型大鼠海馬和血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶變化的干預(yù)作用

劉得水興桂華盧長方高志影張曉杰

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006)

〔摘要〕目的探討抑郁模型大鼠海馬和血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)變化及石菖蒲有效成分β-細辛醚的干預(yù)作用。方法采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激(CUMS)結(jié)合孤籠飼養(yǎng)建立穩(wěn)定、可行的大鼠抑郁癥模型；運用曠場實驗進行行為學(xué)檢測；采用免疫組織化學(xué)檢測對大鼠海馬NSE表達量，應(yīng)用ELISA方法測定血清NSE水平變化。結(jié)果與空白對照組大鼠比較，給予28 d的CUMS大鼠的自主活動得分減少，海馬區(qū)神經(jīng)元NSE表達量減少(P<0.05)，但血清中NSE水平無顯著差異；給予陽性藥氟西汀(10 mg·kg-1·d-1)及β-細辛醚(25 mg·kg-1·d-1)均能顯著提高CUMS大鼠的自主活動得分，海馬CA3區(qū)神經(jīng)元NSE表達量增多(P<0.05)，但對血清中NSE水平無影響。結(jié)論β-細辛醚具有明顯的抗抑郁作用，可能是通過提高神經(jīng)元活性，減少神經(jīng)元損傷，從而實現(xiàn)對CUMS大鼠神經(jīng)的保護作用。

〔關(guān)鍵詞〕抑郁癥；β-細辛醚；神經(jīng)元特異性烯醇化酶

抑郁癥(MDD)是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病。石菖蒲屬于醒腦開竅類中藥，有效成分主要為揮發(fā)油，β-細辛醚是揮發(fā)油的主要成分，被認為是其藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，具有明顯的神經(jīng)保護作用〔1〕。本實驗建立大鼠MDD模型，觀察β-細辛醚對給予慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激(CUMS)的大鼠腦海馬區(qū)神元特異性烯醇化酶(NSE)和血清NSE水平的影響，探討β-細辛醚對CUMS大鼠神經(jīng)保護的作用機制。

1材料與儀器

1.1實驗動物SPF級SD大鼠80只，購買于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物醫(yī)學(xué)部，許可證編號：SCXK(黑)2013-0001。大鼠在動物房中適應(yīng)環(huán)境7 d后開始進行實驗。

1.2試劑β-細辛醚(天津一方科技有限公司)；鹽酸氟西汀(上海中西制藥有限公司)。尼氏染色液(索萊寶科技有限公司)，anti-NSE antibody(EPITOMICS 公司)；免疫組化SP試劑盒(邁新生物技術(shù)有限公司)；NSE ELISA試劑盒(博海生物科技有限公司)。

1.3儀器CX41RBSF光學(xué)顯微鏡，PM-20型全自動顯微攝影儀，Tecan Safire2酶標儀。

1.4方法

1.4.1動物分組及給藥大鼠隨機分成4組：對照組：常規(guī)飼養(yǎng)；模型組：CUMS+生理鹽水；氟西汀組：CUMS+鹽酸氟西汀(10 mg·kg-1·d-1)；β-細辛醚組：CUMS+β-細辛醚組(25 mg·kg-1·d-1)，每組20只。對照組不給予藥物處理，其余各組在建模起分別口服或灌胃給予生理鹽水或相應(yīng)藥物，1次/d，共28 d。

1.4.2建立CUMS抑郁模型對照組每5只大鼠一籠飼養(yǎng)，不給予任何刺激，自由飲水攝食。其余各組每籠飼養(yǎng)1只大鼠，每天隨機選用2種應(yīng)激方式，持續(xù)28 d。應(yīng)激方法參照文獻〔2〕并稍行改進，給予CUMS的大鼠單籠孤養(yǎng)，每周互換一次鼠籠。

1.4.3行為學(xué)檢測曠場實驗〔3〕，造模第29天，在安靜而且弱光環(huán)境下用曠場實驗法觀察記錄大鼠5 min內(nèi)動作行為表現(xiàn)。

1.4.4免疫組織化學(xué)法檢測海馬NSE表達石蠟切片，脫蠟，脫苯水化；高壓修復(fù)；H2O2孵育；正常非免疫動物血清孵育；anti-NSE抗體，4℃過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌；二抗孵育，PBS洗滌；加鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶孵育，PBS洗滌，DAB顯色，PBS終止顯色；復(fù)染，返藍，透明，封片；顯微鏡下觀察，采集圖片。

1.4.5酶聯(lián)免疫分析法檢測血清NSE將板內(nèi)NSE孔內(nèi)加入含NSEO的標準物100 μl，取樣品稀釋液50 μl加入樣品孔，孵育，洗板，甩干；加酶標抗體，洗板，甩干；加OPD液，顯色；終止反應(yīng)。在酶標儀上于492 nm波長處檢測吸光度，根據(jù)標準曲線換算成實際NSE濃度(μg/L)。

1.5統(tǒng)計分析采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析、SNK檢驗。

2結(jié)果

2.1β-細辛醚對CUMS大鼠行為學(xué)的影響持續(xù)給予28 dCUMS刺激之后，模型組大鼠與對照組大鼠相比表現(xiàn)出水平運動與垂直運動得分明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，β-細辛醚和氟西汀均能增加CUMS大鼠的水平運動與垂直運動得分(P<0.05)。見表1。

表1　β-細辛醚對CUMS大鼠曠場實驗垂直運動和

2.2β-細辛醚對海馬NSE蛋白表達影響持續(xù)給予28 d CUMS刺激之后，采用免疫組化技術(shù)檢測各組大鼠海馬NSE蛋白表達水平。結(jié)果顯示，與對照組(24.30±3.15)比較，模型組大鼠海馬NSE蛋白表達(10.09±3.56)減少(P<0.05)。與模型組比較，β-細辛醚(18.28±4.90)及陽性藥氟西汀(19.77±4.46)均可提高NSE蛋白表達(P<0.05)。

2.3β-細辛醚對CUMS大鼠血清NSE水平的影響持續(xù)給予28 d的UMS之后，與對照組〔(3.44±0.53)ng/L〕比較，模型組大鼠血清NSE水平〔(3.69±0.61)ng/L〕無顯著性差異(P>0.05)；與模型組相比，給藥組大鼠血清NSE水平〔氟西汀組(3.42±0.64)ng/L，β-細辛醚組(3.51±0.82)ng/L〕也無顯著性差異(P>0.05)。

3討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激性生活事件是MDD發(fā)生的促發(fā)因素〔4〕，在一個新奇的環(huán)境中動物會產(chǎn)生類似焦慮的抑郁樣表現(xiàn)，動物的這種焦慮反應(yīng)經(jīng)抗抑郁藥物治療后可以有所緩解，表現(xiàn)為水平運動和垂直運動減少，因此，通過行為學(xué)實驗檢測可應(yīng)用于抗抑郁藥物的篩選以及藥效的初步評價。本研究表明β-細辛醚能夠顯著改善CUMS大鼠的焦慮癥狀，具有明顯的抗抑郁作用。

NSE是烯醇化酶基因超家族的一員，可催化2-磷酸甘油酸到磷酸烯醇式丙酮酸的轉(zhuǎn)化，是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶〔5〕。烯醇化酶主要由α、β、γ三個亞基組成的二聚體，而γ亞基特異性存在于神經(jīng)元和神經(jīng)來源的細胞中，故被命名為NSE〔6〕。NSE在正常體液中含量很低，在腦組織中分布最多〔7〕，已成為神經(jīng)元損傷的特征性標志物。夏軍等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，抑郁模型大鼠NSE表達減弱，而經(jīng)過藥物治療后大鼠的NSE表達增強，Abumaria等〔9〕發(fā)現(xiàn)使用抗抑郁劑能夠提高抑郁樣癥狀大鼠海馬NSE mRNA表達。通過本研究可以推測，β-細辛醚通過提高海馬神經(jīng)元NSE表達，增加神經(jīng)元的能量供應(yīng)，從而對給予CUMS的大鼠起到神經(jīng)保護作用。

4參考文獻

1Dong H，Gao Z，Rong H，etal.Beta-asarone reverses chronic unpredictable mild stress-induced depression-like behavior and promotes hippocampal neurogenesis in rats〔J〕.Molecules,2014;19(5)：5634-49.

2Autry AE，Adachi M，Nosyreva E，etal.NMDA receptor blockade at rest triggers rapid behavioural antidepressant responses〔J〕.Nature，2011;475(7354):91-5.

3Warner-Schmidt JL，Duman RS.VEGF is an essential mediator of the neurogenic and behavioral actions of antidepressants〔J〕.Proc Nat Acad Sci，2007;104(11):4647-52.

4趙幸福，徐一峰.生活事件與抑郁癥〔J〕.上海精神醫(yī)學(xué)，1995;7：209-11.

5Orlino EN，J Olmstead CE，Lazareff JA，etal.An enzyme immunoassay for neuron-specific enolase in cerebrospinal fluid〔J〕.Biochem Molecular Med，1997;61(1):41-6.

6Tracy MR，Hedges SB.Evolutionary history of the enolase gene family〔J〕.Gene，2000;259(1-2):129-38.

7Hein Nee Maier K，Kohler A，Diem R，etal.Biological markers for axonal degeneration in csf and blood of patients with the first event indicative for multiple sclerosis〔J〕.Neuroscience Letters，2008;436(1):72-6.

8夏軍，雷益，周義成.慢性應(yīng)激大鼠抑郁癥模型的免疫組織化學(xué)和MRI研究〔J〕.武漢大學(xué)學(xué)報，2006;127(1)：83-6.

9Abumaria N，Rygula R，Hiemke C，etal.Effect of chronic citalopram on serotonin-related and stress-regulated genes in the dorsal raphe nucleus of the rat〔J〕.Eur Neuropsychopharmacol J Eur Coll Neuropsychopharmacol，2007;17(6-7):417-29.

〔2015-12-03修回〕

(編輯郭菁/滕欣航)

〔中圖分類號〕R749.4

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1040-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.007

通訊作者：張曉杰(1965-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，博士，主要從事神經(jīng)精神疾病的病理學(xué)研究。

基金項目：黑龍江省自然科學(xué)基金項目(H201354)

第一作者：劉得水(1981-)，男，助理實驗師，主要從事神經(jīng)精神疾病的病理學(xué)研究。