基于甲狀腺激素受體的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物研究進(jìn)展

張育輝， 梁　凱， 王宏元

(陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 秦巴山區(qū)可持續(xù)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心,陜西 西安 710119)

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基于甲狀腺激素受體的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物研究進(jìn)展

張育輝， 梁凱， 王宏元

(陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 秦巴山區(qū)可持續(xù)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心,陜西 西安 710119)

摘要：甲狀腺激素(thyroid hormone, TH)通過甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptor, TR)介導(dǎo)發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，TR為激素依賴性轉(zhuǎn)錄因子，作為TH應(yīng)答元件調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在對TR結(jié)構(gòu)與功能闡述的基礎(chǔ)上，通過分析多種類型的EDCs干擾哺乳類、兩棲類和魚類等動物TR的研究結(jié)果，支持將TR作為檢測EDCs效應(yīng)的生物指標(biāo)；同時介紹和分析了目前采用的TR蛋白和mRNA檢測技術(shù)。未來研究可在EDCs干擾甲狀腺系統(tǒng)功能的分子機(jī)制方面做深入探討。

關(guān)鍵詞：甲狀腺激素； 甲狀腺激素受體； 環(huán)境內(nèi)分泌污染物

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disrupting chemicals, EDCs)是指通過干擾動物或人體內(nèi)激素的合成、分泌、運輸、結(jié)合、反應(yīng)和代謝等，從而對動物或人體的生殖、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等功能產(chǎn)生影響的外源性化學(xué)物質(zhì)。甲狀腺激素(thyroid hormone，TH) 為氨基酸衍生物，由甲狀腺合成與分泌，其基本生理功能為促進(jìn)新陳代謝、調(diào)節(jié)生長發(fā)育和提高神經(jīng)系統(tǒng)興奮性，并在脊椎動物的生長、發(fā)育、變態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。TH的作用由核內(nèi)甲狀腺素受體(thyroid hormone receptor，TR)所介導(dǎo)，TR是TH應(yīng)答元件(thyroid hormone response element, TRE)，為激素依賴性轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。所以，EDCs可通過結(jié)合TR干擾TH信號[1]。甲狀腺對環(huán)境污染物具有極敏感的效應(yīng)[2]。目前,已被證實和疑似影響甲狀腺形態(tài)和功能的EDCs主要包括烷基酚和雙酚A(BPA)在內(nèi)的酚類化合物，有機(jī)氯殺蟲劑和除草劑，高氯酸鹽、多鹵芳烴類、某些醫(yī)用藥物等人工合成的化學(xué)物質(zhì)以及某些植物激素[3]，EDCs導(dǎo)致TH效應(yīng)已引起人們的關(guān)注。

由于TH信號的復(fù)雜性，EDCs可作用于多個水平，包括對TH 的生成、TH 代謝酶活性、THs調(diào)節(jié)基因表達(dá)的干擾，也可通過與甲狀腺素運載蛋白(transthyretin,TTR)競爭性結(jié)合等途徑干擾TH活動[4]。哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育很大程度上依賴于體內(nèi)正常的TH水平。研究表明，孕婦TH水平略低導(dǎo)致后代認(rèn)知能力下降，即使是很小的甲狀腺內(nèi)穩(wěn)態(tài)的變化也可能影響胎兒的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[5-6]。已有研究報道， NP、BPA、OP可以不同程度地降低中國林蛙(Ranachensinensis)幼體的體長、體重，延緩變態(tài)的時間，說明這三類酚類污染物對中國林蛙蝌蚪的生長發(fā)育均有抑制作用[7-9]。暴露于辛基酚(OP)的美州豹蛙(Ranapipiens)幼體9周后有發(fā)育遲緩現(xiàn)象，檢測到發(fā)育遲緩幼體中T3水平降低[10]。有關(guān)EDCs對甲狀腺及TH水平影響的研究現(xiàn)狀，已經(jīng)有較為詳細(xì)的報道[2]。本文在闡述TR結(jié)構(gòu)和機(jī)能的基礎(chǔ)上，主要通過回顧EDCs對各類不同動物TR干擾效應(yīng)的研究，分析EDCs對TR活動機(jī)能的影響，并介紹目前采用的TR檢測技術(shù)的研究進(jìn)展。

1甲狀腺激素受體基因的結(jié)構(gòu)與功能機(jī)制

目前已經(jīng)清楚，TR存在TRα和TRβ兩種亞型，分別由TRα和TRβ基因編碼，均屬于核受體超家族(nuclear receptor superfamily)成員。從哺乳類、兩棲類、魚類的很多物種中均分離得到了TRα和TRβ多種剪接變異體，如小鼠(Musmusculus)有TRα1、TRα2、TRα3、TRβ1、TRβ2和TRβ3(GenBank：BC046795.1、X07751.1、X077512.1、BC119552.1、BC119553.1、BC089035.1)[11-12]；非洲爪蟾(Xenopuslaevis)有TRα1、TRα2、TRβ1和TRβ2(GenBank：M35343.1、AB669465.1、M35361.1、M35362.1)[13-14]；日本比目魚(JapaneseFlounder)有TRα1、TRα2和TRβ1(GenBank：D16461.1、D16462.1、D45245.1)[15-16]；大西洋鮭(Salmosalar)有TRα1、TRβ1和TRβ2(GenBank：AF146775.1、AF302251.1、AF302252.1)[17-18]。其中只有TRα1、TRβ1 、TRβ2和TRβ3能夠結(jié)合配體T3，雖然TRα2和TRα3不具備結(jié)合T3的能力，但是它們對TH靶基因的轉(zhuǎn)錄具有一定的調(diào)控作用[19]。

TRs分子的一級結(jié)構(gòu)從氨基端到羧基端可分為6 個區(qū)域，依次為A～F 區(qū)，它們組成3 個功能域。其中A 區(qū)和B區(qū)合稱為A/ B 區(qū)，這一區(qū)域的序列和長度是高度可變的，組成轉(zhuǎn)錄激活域(activation function)。該功能區(qū)依賴配體即TH的激活，可參與調(diào)節(jié)TH與TR結(jié)合，從而調(diào)節(jié)激素應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄。C 區(qū)構(gòu)成DNA 結(jié)合域(DNA binding domain, DBD)，是TR與DNA相互作用區(qū)域，其序列高度保守。這一區(qū)域內(nèi)具有兩個鋅指結(jié)構(gòu)，分別含有P盒和D盒，其中P盒能夠識別DNA序列，主要與特異性DNA片段結(jié)合，D盒參與受體二聚體的形成，在第二個鋅指結(jié)構(gòu)的羧基側(cè)有羧基端延伸區(qū)(CTE)，既參與受體與DNA的相互作用，也參與受體與其他蛋白質(zhì)的相互作用。D區(qū)為鉸鏈區(qū)，其中含有核定位序列，可使TR在合成后不久轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核內(nèi)，參與核定位。E/F 區(qū)稱配體結(jié)合域(ligand binding domain, LBD)，是TR結(jié)合并激活受體的區(qū)域[20-21]。

TRs作為激素依賴性轉(zhuǎn)錄因子在脊椎動物的發(fā)育和體內(nèi)平衡中起重要的調(diào)控作用。TRs具有雙重模式，能夠通過激活或者抑制基因而對同源激素做出相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)[20,22-24]。TRs還可以通過調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子的活性或通過多個非基因性途徑間接調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，如啟動核外不受T3影響的TR亞型的轉(zhuǎn)錄[22,25-26]。TR主要位于細(xì)胞核中，與其他核受體形成異二聚體結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)域的甲狀腺激素應(yīng)答元件(thyroid hormone response element, TRE)上。TH進(jìn)入核后與TR的LBD區(qū)結(jié)合，使TR的構(gòu)象發(fā)生變化，之后與TR結(jié)合的核受體輔阻遏因子與之解離，TRs對靶基因TRE的轉(zhuǎn)錄抑制作用也解除，隨后聯(lián)合激活物形成復(fù)雜的激活復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[25]。TR的非基因性效應(yīng)途徑是通過蛋白—蛋白的結(jié)合形式而直接發(fā)揮作用。TR的羧基末端配體結(jié)合域可以結(jié)合蛋白發(fā)揮效應(yīng)，如TR可以與細(xì)胞周期蛋白Dl(Cyclin D1)結(jié)合，阻斷其磷酸化，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[27]。

2基于甲狀腺激素受體的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物研究現(xiàn)狀

2.1EDCs對TR的影響

已有報道，苯酚類的多種化合物均可通過結(jié)合TR，直接作為TR激動劑、拮抗劑以及通過調(diào)節(jié)TR基因的表達(dá)干擾TH的信號功能。

作為溴系阻燃劑(brominated flame retardants, BFRs)，PBDEs因其阻燃效率高、性能穩(wěn)定被廣泛應(yīng)用于工業(yè)產(chǎn)品和家庭用品中。使用熒光素酶報告基因分析PBDEs及其代謝產(chǎn)物可以與TR形成親和力，并誘發(fā)TH應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄水平。例如，用不同濃度的PBDEs及其代謝產(chǎn)物分別培養(yǎng)小鼠垂體MtT/E-2細(xì)胞系、中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster ovary，CHO)細(xì)胞系24 h，分析顯示，PBDE與TR具有較高的親和力。所不同的是，PBDE的代謝產(chǎn)物在小鼠垂體MtT/E-2細(xì)胞系中可作為TR的激活劑，而在中國倉鼠卵巢細(xì)胞系中卻作為抑制劑[28]。因此，PBDE能干擾TR的表達(dá)，這種干擾作用在不同的物種或不同的細(xì)胞類型是有可能完全不同的 。

2，2′，4，4′-四溴聯(lián)苯醚( BDE-47) 是 PBDEs同系物之一。BDE-47在環(huán)境中分布廣泛、在機(jī)體內(nèi)積蓄量較高、毒性最強(qiáng)[29]。BDE-47 可破壞體內(nèi)TH的穩(wěn)態(tài)，并影響肝臟代謝酶活性或相應(yīng)基因的表達(dá)[30]。在動物和人體的肝組織內(nèi)，TRα1 和 TRβ1 呈區(qū)域性表達(dá)，多分布于中央靜脈周圍。這一區(qū)域是生物轉(zhuǎn)化的主要場所，膽固醇7α-羥化酶(CYP7α)、Ⅰ型脫碘酶(D1)、谷氨酰胺合成酶(GS)等受TH調(diào)節(jié)并參與肝臟代謝的多種酶主要分布于這一區(qū)域[31-32]。將不同劑量的BDE-47注入小鼠腹腔，肝組織中TRα1 mRNA和蛋白水平均上調(diào)，TRβ1 mRNA 表達(dá)也上調(diào)，而蛋白水平卻下降。分析認(rèn)為BDE-47可激活TRα1和TRβ1的轉(zhuǎn)錄，使二者的mRNA水平增高，但TRβ1蛋白在修飾過程中被部分降解。該實驗同時也檢測到血液中T4水平下降，認(rèn)為是Ⅰ型脫碘酶(D1)表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)了T4向T3 轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致T4水平下降[33]。

哺乳動物中，TRα在腦中廣泛表達(dá)[34]，TRβ主要在下丘腦、垂體前葉和大腦皮質(zhì)高表達(dá)[35]?；蚯贸∈蟮难芯勘砻?，TR對星形膠質(zhì)細(xì)胞的成熟非常重要，缺失或異常表達(dá)都能導(dǎo)致神經(jīng)機(jī)能障礙[36-37]。已有研究報道，BPA有干擾甲狀腺活動作用，從胚胎的第一天開始，每天將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 μg/kg的BPA通過皮下注入孕鼠體內(nèi)，提取不同胚胎時期端腦組織的RNA，檢測到TRα mRNA水平顯著上調(diào)。為了研究TR對神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化和遷移的影響，將BrdU注入孕鼠腹腔，兩天后免疫組化檢測大腦組織發(fā)現(xiàn)，被BrdU標(biāo)記的細(xì)胞經(jīng)BPA處理之后孕鼠的腦室區(qū)縮小，皮質(zhì)板增加[38]。這些結(jié)果表明，BPA可作為EDCs通過干擾TR的表達(dá)，擾亂正常神經(jīng)組織的發(fā)育過程，從而造成神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的畸形或其他的先天性病變。

上述研究表明，EDCs對哺乳動物的TR mRNA 和蛋白表達(dá)有干擾作用，這種干擾作用依賴于物種和靶基因的差異性，進(jìn)而對組織的正常發(fā)育產(chǎn)生影響。

兩棲動物存在一個由TH調(diào)控的劇烈的變態(tài)過程，其胚胎和幼體的發(fā)育以及變態(tài)過程主要在水中進(jìn)行，對環(huán)境因素較為敏感，因此它們的變態(tài)發(fā)育被認(rèn)為是研究水域EDCs干擾TH及其受體機(jī)能活動的良好模型。已有研究報道，持久性的有機(jī)氯殺蟲劑和非持久性農(nóng)藥如有機(jī)磷、氨基甲酸鹽和擬除蟲菊酯都可干擾甲狀腺素機(jī)能系統(tǒng)的功能。DDE是有機(jī)氯殺蟲劑DDT脫氯化氫后的產(chǎn)物，是環(huán)境中DDT長期殘留的標(biāo)志物，DDE可通過誘導(dǎo)TR的表達(dá)改變機(jī)體的生物學(xué)功能。例如，DDE以劑量依賴性降低雄性蛙睪丸組織中TRα和TRβ mRNA水平，導(dǎo)致細(xì)胞生殖過程中睪丸間質(zhì)細(xì)胞活化和分化受損。用DDE處理歐洲林蛙(Ranatemporaria)，兩周后取肝臟、腦、睪丸、腎臟組織，用qRT-PCR檢測顯示， DDE誘導(dǎo)腦中TRα和TRβ mRNA水平有所增加，腎臟中顯著增加。但在睪丸組織中，低劑量時TRα 和TRβ mRNA水平增高，高劑量時降低[39]。用三丁基錫(TBT)對熱帶爪蟾(Xenopustropicalis)蝌蚪進(jìn)行暴露處理，結(jié)果顯示，TBT誘導(dǎo)蝌蚪尾部組織中TRα和TRβ mRNA上調(diào)，而對腦部TR mRNA水平?jīng)]有明顯影響[40]。這些研究同樣說明水域中DDE和TBT污染可作為EDCs能干擾水生動物組織內(nèi) TR mRNA的表達(dá)。

乙草胺是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的一種除草劑，檢測顯示乙草胺可存在于地表水[41]、土壤[42]以及沉積物中[43]。研究表明，乙草胺可加速T3誘導(dǎo)的北美豹蛙(Ranapipiens)和非洲爪蟾(Xenopuslaevis)早熟變態(tài)[44-45]。通過檢測非洲爪蟾尾部組織中TR mRNA水平，證實乙草胺以劑量依賴性使T3誘導(dǎo)的TR mRNA表達(dá)水平產(chǎn)生變化[45]。用乙草胺水體暴露處理牛蛙(Ranacatesbeiana)蝌蚪，四天后qRT-PCR檢測大腦組織，乙草胺誘導(dǎo)TRα和TRβ mRNA水平在腦中顯著增高。進(jìn)一步研究顯示，蝌蚪在變態(tài)前，TRα和TRβ mRNA表達(dá)量的比率發(fā)生變化，而TR兩種亞型表達(dá)的比率對腦發(fā)育有明顯影響[46]。這表明，乙草胺可通過干擾TR的表達(dá)對動物腦的發(fā)育產(chǎn)生影響。

另外，分別用100、250、500 μg/L TBBA和0.1 nmol/L和1.0 nmol/L T3單獨或共同處理非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的51期蝌蚪，24、48、72 h后取頭部組織進(jìn)行RT-PCR半定量分析表明，24 h后T3處理TRβ mRNA表達(dá)水平顯著增加，直到實驗結(jié)束表達(dá)量一直呈增加趨勢；而TBBA 顯著抑制T3誘導(dǎo)的TRβ mRNA 的表達(dá)，隨著TBBA濃度的增加呈現(xiàn)劑量依賴性抑制。用500 μg/L TBBA處理非洲爪蟾57期蝌蚪12、48、72 h后取腦組織進(jìn)行半定量RT-PCR分析，TRβ mRNA水平?jīng)]有明顯的變化。這些結(jié)果表明，TBBA能夠干擾TH誘導(dǎo)的信號途徑，這種干擾作用只是在爪蟾蝌蚪對TH非常敏感的前變態(tài)期，而57期蝌蚪甲狀腺功能完善，因此TBBA的干擾作用已經(jīng)明顯減小或消失。進(jìn)一步研究表明，TBBA能模擬TH和 TR進(jìn)行結(jié)合，TBBA作為環(huán)境污染物主要是通過與TH競爭性的與TR相結(jié)合，或者是干擾TH信號通路中的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮抑制作用[47]。相關(guān)的研究還有，暴露于100 nmol/L TBBPA使太平洋樹蛙(Pseudacrisregilla)蝌蚪腦和尾部組織中TH介導(dǎo)的TRα mRNA水平上升，而尾部組織中TRβ mRNA水平并不受TBBPA影響。這些結(jié)果表明，低水平的TBBPA可作為TH作用的激活劑并加強(qiáng)TH介導(dǎo)的基因的表達(dá)，進(jìn)而加速無尾類幼體的變態(tài)[48]。在此過程中，TBBPA對于TR不同亞型的干擾效應(yīng)有差異。將美州豹蛙(Ranapipiens)29期蝌蚪暴露于辛基酚(OP)9周后，通過檢查其體重和分期表明，OP有明顯的導(dǎo)致蝌蚪發(fā)育遲緩現(xiàn)象。用qRT-PCR檢測腦中TRβ mRNA水平明顯上升，正常情況下，TRα mRNA在腦中大量表達(dá)，TRs的異常表達(dá)都可能導(dǎo)致神經(jīng)機(jī)能障礙。因此，這一增長可能對腦的發(fā)育有十分重要的生理作用。同樣，之前也有研究報道長期暴露于草甘膦和聚乙氧基牛脂胺表面活性劑的北美豹蛙蝌蚪有發(fā)育遲緩現(xiàn)象，檢測其尾部組織中TRβ mRNA水平異常升高[10]。早先研究表明，與TH結(jié)構(gòu)類似的化學(xué)物質(zhì)能夠干擾內(nèi)源性TH的激活[49]。BPA可作為TH的拮抗劑，在爪蟾幼體內(nèi)阻止自身和TH誘導(dǎo)的變態(tài)。BPA也可抑制幼體組織中TRα和TRβ mRNA的表達(dá)，包括在體和離體培養(yǎng)中的尾部組織[50-51]。

研究水體EDCs干擾效應(yīng)常用的動物是魚類，常用的染毒方式是水體暴露，即將動物暴露于含有單一或復(fù)合的EDCs水體中。有關(guān)EDCs對魚類甲狀腺的干擾也有許多研究報道。例如，BDE-209可顯著上調(diào)斑馬魚(Daniorerio)胚胎中TRα和TRβ mRNA水平[52]。將稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)的幼體和成體分別暴露于20、200、2 000 ng/L 乙草胺21 d，用qRT-PCR檢測幼體中TRα mRNA水平。在濃度為20 ng/L顯著上調(diào)，而200 ng/L卻顯著下調(diào)。在雌雄成體，所有處理組的肝臟中TRα mRNA水平均顯著上調(diào)。在雌性成體的腦中，TRα mRNA水平在20 ng/L顯著上調(diào)，在200 ng/L和2 000 ng/L卻顯著下調(diào)；在雄性成體的腦中，TRα mRNA水平在200 ng/L顯著上調(diào)，在2 000 ng/L也顯著下調(diào)。另外，乙草胺可使稀有鮈鯽成體的體長顯著降低。綜上所述，乙草胺可干擾幼體的正常發(fā)育，對成體的干擾具有組織特異性，并且對雌性的影響更為敏感[53]。

有關(guān)EDCs對動物TR影響的研究，除上述單一處理之外，也有用兩種及其以上的干擾物復(fù)合處理的報道。例如，分別用PCB和PBDE單一或復(fù)合暴露處理46期非洲爪蟾蝌蚪，結(jié)果表明，單一或復(fù)合處理均可使蝌蚪變態(tài)遲緩，且對TRβ mRNA的表達(dá)有一定的抑制作用，復(fù)合暴露的抑制作用明顯高于單一暴露[54]。有關(guān)多種EDCs聯(lián)合暴露處理的研究在哺乳類和魚類較多，如用OP和NP聯(lián)合作用對雄性大鼠精子有明顯的損傷作用，精子的畸形率升高。NP和BPA對斑馬魚精巢發(fā)育的組織學(xué)觀察以及對于性激素合成酶基因表達(dá)的影響研究表明，NP和BPA能夠?qū)伯a(chǎn)生影響，NP可抑制CYPII B mRNA的表達(dá)，但兩種物質(zhì)聯(lián)合暴露時，卻促進(jìn)了CYPII B mRNA的表達(dá)。說明NP和BPA的作用機(jī)制不完全相同，但都影響性激素的水平。有關(guān)干擾物復(fù)合處理對甲狀腺干擾的報道還不多見。

綜上可見，多種EDCs可通過干擾動物TR的表達(dá)導(dǎo)致幼體發(fā)育遲緩和某些器官發(fā)育異常；由于不同亞型的TR 有組織特異性，且與配體的結(jié)合存在差異，即同一種EDCs對于不同亞型的TR干擾效應(yīng)可能不同，可促進(jìn)或抑制TR介導(dǎo)的基因表達(dá)，或無明顯影響。另外，由于不同物種的組織器官中TR亞型存在差異，EDCs的干擾效應(yīng)也存在差異。因此，在對EDCs效應(yīng)的檢測中，應(yīng)考慮到化合物的類型、動物的種類以及動物器官和組織的特異性。

2.2TR檢測方法

目前,研究EDCs影響TR的檢測技術(shù)主要包括蛋白和 mRNA兩個層次，這兩個層次均可反映機(jī)體內(nèi)生成TR的水平，但二者的理論基礎(chǔ)和實驗技術(shù)有差異。

TR蛋白的檢測主要包括蛋白印跡(Westhern Blot)和免疫組織化學(xué)(immunohisto-chemistry)技術(shù)方法。蛋白印跡是繼DNA印跡和RNA印跡之后發(fā)展起來的一種可以對特異性蛋白進(jìn)行定性及定量分析的技術(shù)，其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行著色，通過分析著色位置的深度獲得特定蛋白在細(xì)胞或組織中表達(dá)的信息。在檢測EDCs對細(xì)胞TR 蛋白表達(dá)影響的研究中常被使用，例如，劉早玲等[33]用該方法檢測了不同劑量BDE-47處理的小鼠肝組織中TR蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示TRα1和TRβ1水平均發(fā)生變化，這為揭示 BDE-47對TR的干擾并影響肝臟代謝酶的作用機(jī)制提供了依據(jù)。實驗顯示W(wǎng)esthern Blot技術(shù)在TR定量分析中是實用的。用免疫組織化學(xué)技術(shù)可在組織切片上定性或半定量檢測TR的分布，目前已獲得TR的多克隆抗體，可通過標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色，確定組織細(xì)胞內(nèi)TR (抗原)。例如，通過用免疫組化的方法對豬卵巢TRα進(jìn)行定位觀察，表明TRα主要分布在顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞，卵母細(xì)胞和血管周圍間質(zhì)也有少量陽性反應(yīng)分布，陽性細(xì)胞的分布特點與對 THs的結(jié)合和敏感性有直接關(guān)系，說明TRα介導(dǎo)的調(diào)節(jié)對于卵泡的早期發(fā)育是必需的[55]。這一實驗研究說明免疫組織化學(xué)技術(shù)在TR的細(xì)胞定位中是非常有效的研究方法。

上述檢測蛋白技術(shù)各有其優(yōu)點和不足。Westhern Blot和免疫組織化學(xué)雖然都是利用特異性抗體通過檢測特異性蛋白為抗原的免疫反應(yīng)程度，但前者直接檢測樣品是細(xì)胞裂解液，通過檢測凝膠電泳及其顏色的深度定量特異性蛋白的相對含量，其定量較為準(zhǔn)確。后者是在組織切片上進(jìn)行免疫反應(yīng)，通過陽性反應(yīng)進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞定位，也可通過反應(yīng)著色程度測量特異性蛋白的相對含量。

TR mRNA分析多采用反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、實時定量PCR(quantitative real time-PCR, qRT-PCR)和原位雜交 (in situ hybridization)技術(shù)等方法。其中， RT-PCR和qRT-PCR兩種檢測方法分別能夠準(zhǔn)確反映TR mRNA的表達(dá)部位和表達(dá)程度。例如，用qRT-PCR檢測乙草胺水體暴露處理牛蛙(Ranacatesbeiana)蝌蚪的大腦組織，結(jié)果顯示TRα和TRβ mRNA水平顯著增高。而且二者的比率發(fā)生變化[46]。分別用TBBA和T3單獨或共同處理非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的51期蝌蚪，取腦組織進(jìn)行RT-PCR半定量分析表明，TBBA 呈現(xiàn)劑量依賴性抑制T3誘導(dǎo)的TRβ mRNA 的表達(dá)。用500 μg/L TBBA處理非洲爪蟾51期蝌蚪取腦組織進(jìn)行RT-PCR半定量分析，TRβ mRNA水平?jīng)]有明顯變化。這些結(jié)果表明，TBBA能夠干擾TH誘導(dǎo)的信號途徑[47]。另外，根據(jù)同源序列制備相應(yīng)的探針，可用原位雜交的方法來檢測TR mRNA的表達(dá)。例如，用原位雜交技術(shù)檢測正常和惡性病變的食管組織中TRβ1 mRNA的表達(dá)，顯示TRβ1 mRNA水平顯著下降，表明TRβ1 mRNA的表達(dá)與癌癥的高分化相關(guān)聯(lián)[56]。原位雜交技術(shù)在細(xì)胞定位方面能夠顯示其優(yōu)勢，例如，用此方法檢測日本海鰻魚(Anguillajaponica)腦和垂體中TRβ mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示TRβ mRNA主要分布于垂體的遠(yuǎn)側(cè)部[57]。

在研究中，這些技術(shù)可為EDCs的檢測提供較為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。為獲得更加準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)和實驗結(jié)論，應(yīng)根據(jù)實際需要采用多種技術(shù)相結(jié)合的方式進(jìn)行研究，更加具有說服力。例如，用qRT-PCR和Westhern Blotting技術(shù)相結(jié)合檢測黑鯛(Acanthopagrusschlegeli)不同發(fā)育時期睪丸和卵巢組織中TRα和TRβ的 mRNA和蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，TRα與睪丸和卵巢的發(fā)育有關(guān)，而TRβ僅與卵巢的發(fā)育有關(guān)，這一結(jié)果證明TRs在黑鯛性別分化過程中有重要作用[58]。

兩種不同的檢測層次相比也各有其優(yōu)缺點，從蛋白水平定量檢測 TR 的表達(dá)，由于蛋白相對較穩(wěn)定，降解速度較慢，所以其結(jié)構(gòu)并不能準(zhǔn)確反映機(jī)體產(chǎn)生 TR的即時狀態(tài)。同時，蛋白檢測靈敏度相對也低，對于蛋白表達(dá)較低的樣品，其檢測結(jié)果可能不準(zhǔn)確。 而qRT-PCR、RT-PCR對TR mRNA定量分析靈敏度高，特異性強(qiáng)，TR mRNA 的表達(dá)位點和表達(dá)變化能夠準(zhǔn)確反映樣品中 TR 表達(dá)的即時狀態(tài)，原位雜交既可以檢測TR mRNA的定性表達(dá)，又可觀察到TR mRNA的細(xì)胞定位，是研究細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)及相關(guān)因素調(diào)控的有效工具，但是如何使探針與細(xì)胞內(nèi)mRNA更有效的結(jié)合是原位雜交成敗的關(guān)鍵問題，另外， RNA 的易降解性也會給檢測帶來諸多不便。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，相信對于TR 的檢測方法也將不斷創(chuàng)新，其靈敏度和特異性也將會進(jìn)一步提高，這些技術(shù)有望在未來的EDCs研究檢測中得到更多的應(yīng)用。

3總結(jié)和展望

目前，人類和野生動物不可避免地暴露在含有各種環(huán)境污染物的環(huán)境中，而甲狀腺內(nèi)穩(wěn)態(tài)微妙的變化可能對機(jī)體產(chǎn)生顯著的影響，尤其是在發(fā)育的敏感時期。因此，通過多種干擾物暴露研究EDCs對動物生長發(fā)育及相關(guān)基因表達(dá)影響的研究顯得十分重要。在過去的十年中，環(huán)境毒理學(xué)與內(nèi)分泌學(xué)研究的相互交叉在這方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。通過動物的在體和體外實驗研究顯示，不同EDCs的干擾效應(yīng)和機(jī)制有著許多差異。有關(guān)EDCs干擾TH和TR的研究報道已經(jīng)不少，包括分子機(jī)制和調(diào)控機(jī)制。從本文所引用的研究報道可見，TR是檢測環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的重要指標(biāo)。但是目前的研究僅限于實驗室，而動物自身受野生環(huán)境如溫度、pH 值、氧含量以及繁殖周期等諸多因素的影響，這些因素都可能使動物對EDCs的靈敏度和調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)生微妙的變化。因此，在EDCs的評估中，還需要結(jié)合對誘導(dǎo)TR產(chǎn)生的各種因素來綜合分析。目前對EDCs的研究，雖然已經(jīng)注意從單一的向兩種及其以上的化學(xué)物質(zhì)聯(lián)合暴露研究其機(jī)制，但對于多種EDCs對TH和TR產(chǎn)生的聯(lián)合效應(yīng)及其機(jī)制還大都不能確定。所以，進(jìn)一步探討EDCs對甲狀腺系統(tǒng)的干擾機(jī)制還有很長的路要走。

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〔責(zé)任編輯王勇〕

Review on estimate of environmental endocrine disrupting chemicals based on thyroid hormone receptor

ZHANG Yuhui, LIANG Kai, WANG Hongyuan

(School of Life Sciences, Co-Innovation Center for Qinba Regions′ Sustainable Development,Shaanxi Normal University, Xi′an 710119, Shaanxi，China)

Abstract:Thyroid hormone (TH) plays a regulatory function mediated by thyroid hormone receptor (TR), a hormone dependent transcription factors, regulating the transcription of target genes with thyroid hormone response elements,and function of TR, and the results of analyzing TR mammals, amphibians and fish interfered by different EDCs, it is conformed that TR can be used as a biological indicators in environmental endocrine effects of pollutants. TR detection technology at present，including protein and mRNA level， were also introduced and analyzed.In future, the molecular mechanisms of interfere of EDCs on the thyroid system should be deeply explored.

Keywords:thyroid hormone; thyroid hormone receptor; environmental endocrine disrupting chemicals

中圖分類號：O657.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31572222)

收稿日期：2015-11-11

doi:10.15983/j.cnki.jsnu.2016.02.324

文章編號：1672-4291(2016)02-0071-08

第一作者： 張育輝, 男, 教授, 博士生導(dǎo)師，主要從事動物生殖內(nèi)分泌方面的研究。E-mail: yu-huizhang@163.com