黑啤中渾濁和泡沫蛋白性質(zhì)初探

楊　紅，李　賡，陳飛飛，張　潔，孔　瑞

(合肥學(xué)院 生物與環(huán)境工程系，合肥　230601)

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黑啤中渾濁和泡沫蛋白性質(zhì)初探

楊紅，李賡，陳飛飛，張潔，孔瑞

(合肥學(xué)院 生物與環(huán)境工程系，合肥230601)

摘要：泡沫是啤酒的重要特征，泡沫蛋白是構(gòu)成啤酒泡沫的骨架，泡沫蛋白的含量和性質(zhì)在一定程度上決定了啤酒泡沫的質(zhì)量。啤酒是一種成分復(fù)雜的膠體溶液，其穩(wěn)定性較弱，啤酒在貯藏中極易產(chǎn)生渾濁沉淀，渾濁蛋白是構(gòu)成啤酒渾濁的重要成分之一。以黑啤為原料，根據(jù)SDS-PAGE原理，按濃縮膠5%，分離膠12%，濃縮電壓75V，分離電壓120V，分離時間3h，分析啤酒泡沫蛋白和渾濁蛋白的分子量范圍。結(jié)果表明：啤酒泡沫蛋白的分子量為42.4kDa 和14.1 kDa，啤酒渾濁蛋白的分子量分別為47.72kDa、42.08kDa、36.57kDa、32.44kDa、28.02kDa，兩者蛋白的分子量之間有一定交集。為進(jìn)一步分析啤酒中渾濁活性蛋白與泡沫蛋白的相關(guān)性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：黑??；渾濁蛋白；泡沫蛋白；分子量

啤酒是人類最古老的酒精飲料之一，富含豐富的CO2，有細(xì)膩且潔白的泡沫，具有麥芽及酒花的香味和酒花爽口的苦味，是繼可可和茶之后世界上消耗量排名第三的飲料。啤酒因含有豐富的氨基酸、多種維生素、較多的無機離子等營養(yǎng)成分，故而被稱為“液體面包”。在我國，啤酒的發(fā)展速度驚人，僅2003年，中國的啤酒生產(chǎn)產(chǎn)量已達(dá)世界第一。[1-2]啤酒泡沫能阻止啤酒與空氣中氧的接觸，減緩啤酒的氧化進(jìn)程。豐富良好的泡沫還能防止啤酒中風(fēng)味物質(zhì)的溢出，帶給消費者不一樣的感官享受。泡沫的質(zhì)量很大程度上影響啤酒的質(zhì)量，其穩(wěn)定性、潔白程度、泡持性、細(xì)膩程度、掛杯性等是評價啤酒泡沫質(zhì)量的重要指標(biāo)。泡沫蛋白質(zhì)、異α-酸、CO2、金屬離子等組成了啤酒泡沫。

啤酒泡沫蛋白是能夠維持泡沫穩(wěn)定性的一類蛋白質(zhì)，又被稱為起泡蛋白或泡沫性蛋白。[3]根據(jù)相對分子質(zhì)量可將泡沫蛋白分為兩大類：一類是分子量為35-50kDa的高分子蛋白質(zhì)，主要包括蛋白質(zhì)Z；[4]一類是分子量約為7-9kDa的低分子蛋白質(zhì)，主要包括脂轉(zhuǎn)移蛋白(LTP),主要來源于麥芽。[5]啤酒泡沫中少量存在一些可能來源于酵母的蛋白質(zhì)(約200KDa)。研究表明，啤酒泡沫蛋白之間并不是相互獨立的，而是相互作用的，這些相互作用影響著啤酒的起泡和泡沫的穩(wěn)定性。[5]

啤酒也是一種成分復(fù)雜的膠體溶液，其穩(wěn)定性較弱，故啤酒在貯藏中極易產(chǎn)生渾濁沉淀。根據(jù)渾濁的可逆性將啤酒渾濁分為冷渾濁和永久性渾濁。目前為止，蛋白質(zhì)-多酚的復(fù)合是引發(fā)啤酒渾濁的最常見原因，一般認(rèn)為永久性渾濁的前驅(qū)物質(zhì)是冷渾濁，永久性渾濁的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。[6]Siebert認(rèn)為，蛋白質(zhì)和多酚是引發(fā)啤酒產(chǎn)生冷渾濁的重要因素，在啤酒中，若渾濁敏感多酚和敏感蛋白的含量較高且基本等量，會導(dǎo)致二者發(fā)生聚合反應(yīng)，產(chǎn)生蛋白質(zhì)-多酚渾濁。[7]Siebert基于實驗進(jìn)一步提出，一個多酚分子最多可接受兩個蛋白分子，啤酒中的敏感蛋白或者敏感多酚過量，都是不能形成渾濁的。Chapon提出的蛋白質(zhì)-多酚平衡論與Siebert的觀點相一致，蛋白質(zhì)-多酚平衡論如下圖所示。

P+T←→P-T(可溶性) ←→(不可溶性)

P：蛋白質(zhì)T：多酚

Chapon認(rèn)為，一般情況下，單體P和T在啤酒中是平衡的，若將這種平衡打破，除去單體中的P或T，會使得上述平衡向單體方向移動，啤酒的穩(wěn)定性提高。在實際的生產(chǎn)中，可運用上述的平衡論提高啤酒的穩(wěn)定性，具體的做法是去除或者過量添加蛋白質(zhì)和多酚中的一個。[8-9]

渾濁對啤酒最大的影響是可以縮短其貨架壽命。[10]為提高啤酒的穩(wěn)定性，避免渾濁的產(chǎn)生，一般有兩種思路：一是按照一定的比例，同時除去蛋白質(zhì)和多酚；二是除去蛋白質(zhì)或者多酚。為提高啤酒的穩(wěn)定性，又盡可能不降低啤酒中營養(yǎng)成分，特別是蛋白的含量。因此如何去除渾濁活性蛋白而又不影響泡沫蛋白就顯得尤為重要。本研究以合肥學(xué)院自釀黑啤為原料，分析其渾濁活性蛋白和泡沫蛋白的分子量，為研究兩者之間的相關(guān)性及提高啤酒穩(wěn)定性和風(fēng)味獲得基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資料。

1材料與方法

1.1實驗材料

丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、Tris堿、SDS(十二烷基磺酸鈉)、TEMED、過硫酸銨、β-巰基乙醇、甘油、溴酚藍(lán)甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、 Marker 購買自北京索萊寶科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

RP5002K電子天平，湖南湘儀儀器公司；RO 300-E超純水儀，上海和泰儀器有限公司；DKS-28恒溫水浴鍋，上海博訊有限公司；PHS-2F 型pH，上海雷磁公司；D-1008微型離心機，北京大龍公司；CJ88-1磁力攪拌器，江蘇金壇儀器有限公司；DYCZ-25D微型垂直電泳槽，北京六一公司。

1.3樣品準(zhǔn)備

1.3.1泡沫蛋白的制取

采用分液漏斗收集啤酒泡沫。[11]將500mL黑啤沿漏斗邊緣倒入2L分液漏斗中，速度要保持勻速，加蓋5s后，打開出樣閥，放出酒液直到有泡沫流出為止，立即關(guān)閉閥門，控制酒液在60s內(nèi)放完，泡沫自然坍塌后收集泡沫生成的液體。[12]

樣品處理方法是，取泡沫生成液200uL，以1：5的比例加入4℃丙酮溶液，將混合液置于冰箱中，放置1h，7000rpm離心10min，倒掉上層的液體，用純水洗3-4次后，加40uL純水復(fù)溶。

1.3.2渾濁蛋白的制取

將啤酒在冰箱中放置24h，然后倒掉上層的酒液，下層的溶液用濾紙過濾，取適量的沉淀物加50uL水復(fù)溶，以1∶5的比例加入4℃丙酮，置于冰箱中1h后，7 000rpm離心10min，倒掉上層的液體，用純水洗3—4次后，加30uL水復(fù)溶。

1.4SDS-PAGE電泳實驗

1.4.1溶液的配置

依據(jù)參考文獻(xiàn)[13]，分別配制1.5M Tris-Hcl(pH8.8)、1M Tris-Hcl(pH6.8)、10%(w/v)SDS、50%(v/v)甘油、1%(w/v)溴酚藍(lán)、丙烯酰胺儲存液、濃縮膠緩沖液、10%過硫酸銨、電泳緩沖液、樣品緩沖液、固定液、脫色液、12%分離膠和5%濃縮膠溶液備用。

1.4.2實驗操作

1.4.2.1制膠

(1)按照使用說明書組裝凝膠模具。

(2)灌制12%的分離膠：將配置好的分離膠溶液輕輕攪拌使其均勻(過量的氣泡會干擾聚合)，用一次性吸管將凝膠溶液沿隔片緩慢加入模具中(注入的速度應(yīng)時刻保持勻速，避免混入氣泡)，凝膠加至玻璃板頂端1.5cm時，為使凝膠變得平整，應(yīng)在分離膠溶液上覆蓋一層水。當(dāng)凝膠聚合后(時間應(yīng)控制為40～60min)，分離膠與水的分界面將會清晰的顯現(xiàn)。

(3)用吸水紙將分離膠上層的水吸出，并用濃縮膠緩沖溶液清洗2-3次。

(4)灌制5%的濃縮膠：搖勻濃縮膠溶液，用一次性吸管將濃縮膠溶液勻速注入到模具中，溶液加至玻璃的頂端后，將梳子插入凝膠內(nèi)，待濃縮膠聚合后拔出梳子。

1.4.2.2電泳

(1)將得到的泡沫蛋白樣品、渾濁蛋白樣品以及Marker以1∶1的比例與樣品緩沖液混合，在100℃的水浴鍋中沸騰4～10min；

(2)將制好的膠在12V的電壓下，預(yù)跑20min；

(3)沸騰后的樣品和Marker冷卻后加入少量的β-巰基乙醇；

(4)根據(jù)蛋白質(zhì)的濃度和上樣孔的體積，用微量注射器將合適量的溶液加入到濃縮膠孔道里，未上樣的孔道中加入等量的樣品緩沖液，以防止跑道的擴散；

(5)蛋白質(zhì)濃縮時，電壓為75～80V，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)開始分離時，將電壓調(diào)為120V。當(dāng)溴酚藍(lán)跑到凝膠底部立即關(guān)閉電源，停止電泳；

(6)將玻璃板放置于有水的盆中，用刀劃開玻璃板，取出凝膠并作標(biāo)記；

(7)凝膠放入固定液中固定30min，隨后進(jìn)行染色和脫色，染色的時間不宜太長，控制在15min左右；脫色完成后，將凝膠置于掃描儀中掃描，得出圖片進(jìn)行結(jié)果分析。

2結(jié)果與討論

2.1泡沫蛋白結(jié)果分析

2.1.1泡沫蛋白電泳圖

按照1.3.1的方法制備啤酒泡沫蛋白樣品，將處理好的樣品加入1.5mm的凝膠樣品槽進(jìn)行電泳操作，得到的凝膠用掃描儀掃描，并進(jìn)行灰度轉(zhuǎn)化，結(jié)果如下圖1所示。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將遷移距離最大的標(biāo)準(zhǔn)蛋白或者凝膠片的前沿作為參考點，計算所有標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對遷移率(mR)。

以mR為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量為縱坐標(biāo)，依據(jù)圖1中標(biāo)樣計算，繪制出泡沫蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2所示。所得方程為y=114.87e-2.1397x，R2=0.98。

圖1　泡沫蛋白凝膠電泳圖(1、2—泡沫蛋白樣品)

圖2　泡沫蛋白電泳實驗中marker相對分子質(zhì)量與相對遷移率關(guān)系圖

2.1.3泡沫蛋白分子量的計算

根據(jù)圖1中樣品計算出泡沫蛋白的mR分別是0.465 8和0.981 9，將mR帶入公式中，可計算出泡沫蛋白的分子量分別是42.4KDa和14.1KDa。

2.1.4結(jié)果討論

實驗測出啤酒泡沫蛋白的相對分子量分別為42.4KDa和14.1KDa。根據(jù)資料可知，相對分子量為42.4KDa的蛋白質(zhì)，應(yīng)該是蛋白質(zhì)Z，蛋白質(zhì)Z是發(fā)現(xiàn)最早的與啤酒泡沫性能有關(guān)的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)Z有兩種異構(gòu)體，分別為Z4和Z7。報道指出，糖基化的蛋白質(zhì)Z在煮沸過程中有可能抑制蛋白質(zhì)沉淀析出，并且能增強泡沫穩(wěn)定性。[14]脂轉(zhuǎn)移蛋白(LTP)是由91個氨基酸組成的來源于大麥胚乳的蛋白質(zhì)，LTP有兩種異構(gòu)體，分別是分子量約為9KDa的LTP1，和分子量約為7KDa的LTP2，LTP1具有很強的起泡性，能夠富集在啤酒的泡沫中，LTP2對泡沫質(zhì)量的影響還需進(jìn)一步研究。[5]實驗中測出的分子量為14.1KDa的蛋白質(zhì)，與LTP的分子量相近，有兩種可能性，一是12%分離膠未能將LTP1和LTP2很好的分離，導(dǎo)致兩種蛋白質(zhì)重合在一起；二是12%分離膠未能將LTP分離出，分子量為14.1KDa的是另一種能夠?qū)ζ【婆菽鹱饔玫牡鞍踪|(zhì)。

2.2渾濁蛋白結(jié)果分析

2.2.1渾濁蛋白電泳圖

按照1.3.2的方法制備啤酒渾濁蛋白樣品，將處理好的樣品加入1.0mm的凝膠樣品槽進(jìn)行電泳操作，得到的凝膠用掃描儀掃描，并進(jìn)行灰度轉(zhuǎn)化，結(jié)果如下圖3所示。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將遷移距離最大的標(biāo)準(zhǔn)蛋白或者凝膠片的前沿作為參考點，計算所有標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對遷移率(mR)。

以mR為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量為縱坐標(biāo)，依據(jù)圖3中標(biāo)樣計算，繪制出渾濁蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4所示。所得方程為y=114.75e-2.3966x，R2=0.979 9。

圖3渾濁蛋白凝膠電泳圖(1、2、3—渾濁蛋白樣品)

圖4渾濁蛋白電泳實驗中marker相對分子質(zhì)量與相對遷移率關(guān)系圖

2.2.3渾濁蛋白分子量的計算

根據(jù)圖3中樣品計算出渾濁蛋白的mR分別是0.366 1、0.418 6、0.477 2、0.527 1和0.588 3，將mR帶入圖中的公式中，可計算出渾濁蛋白的分子量分別是：47.72KDa、42.08KDa、36.57KDa、32.44KDa、28.02KDa。

2.2.4結(jié)果討論

蛋白質(zhì)與多酚是啤酒產(chǎn)生渾濁的主要原因，在啤酒中蛋白質(zhì)與多酚能發(fā)生聚合反應(yīng)，生成蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物，產(chǎn)生渾濁。復(fù)合物中蛋白質(zhì)被稱為渾濁活性蛋白質(zhì)，多酚被稱為渾濁活性多酚，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子中含有脯氨酸時才是渾濁活性蛋白(簡稱HA蛋白)。[15]對于啤酒中渾濁活性蛋白來說，HA蛋白的中必需含有脯氨酸，脯氨酸的含量與蛋白形成渾濁的程度呈正相關(guān)，啤酒渾濁蛋白相對分子質(zhì)量分布在10-60KDa這個范圍內(nèi)，其含量約占啤酒含氮物質(zhì)的1/3。實驗測出啤酒中渾濁蛋白的分子量分別為47.72KDa、42.08KDa、36.57KDa、32.44KDa、28.02KDa，均分布在10~60KDa這個范圍內(nèi)。

3結(jié)論

黑啤中泡沫蛋白的分子量分別為42.4KDa和14.1KDa，渾濁蛋白的分子量為47.72KDa、42.08KDa、36.57KDa、32.44KDa、28.02KDa。黑啤中泡沫蛋白和渾濁蛋白在分子量上是有重疊區(qū)域的，因而在生產(chǎn)上去除渾濁活性蛋白時要充分考慮到重疊區(qū)域可能存在的泡沫蛋白。為黑啤生產(chǎn)中從渾濁活性蛋白角度降低渾濁度以及提高啤酒泡沫性能、啤酒風(fēng)味提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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[責(zé)任編輯:李軍]

Preliminary Study on the Properties of Haze-active and Foam Protein in Dark Beer

YANG Hong,LI Geng,CHEN Fei-fei,ZHANG Jie，KONG Rui

(Department of Biological and Environmental Engineering,Hefei University,Hefei 230601,China)

Abstract:Foam is an important feature of beer.Foam protein is the skeleton of beer foam.The quality of beer was been determined by the content and properties of foam protein in a certain extent. Beer is a kind of colloid solution with complex composition,the stability is weak. The beer is very easy to produce haze and precipitate during the storage.Haze-active protein is one of the important components of beer haze.In this paper,in accordance with the principle of SDS-PAGE,at 5% of the concentrated gel,separating gel of 12%,concentrated voltage of 75V,separation voltage of 120V,separated for 3h,to analysis the molecular weight range of foam protein and haze-active protein in dark beer. Results show that the molecular weight of beer foam protein were 42.4 kDa and 14.1 kDa,one of the haze-active protein in dark beer were 47.72 kDa,42.08 kDa,36.57 kDa,32.44 kDa and 28.02 kDa. The molecular weight of the two proteins has a certain intersection.It could provided basic data for further analysis of the correlation between the foam protein and the haze-active protein in beer.

Key words:dark beer; haze-active protein; foam protein; the molecular weight

中圖分類號：TS2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-162X(2016)01-0100-05

作者簡介：楊紅(1981—)，男，安徽舒城人，合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系副教授，碩士；研究方向：食品生化與生物統(tǒng)計。

基金項目：安徽省高校省級優(yōu)秀青年人才基金重點項目(2013SQRL079ZD)、安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(AH201411059043)、國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201511059079)基金資助。

收稿日期：2015-12-01修回日期：2016-01-06