多房棘球蚴重組蛋白CTB-Emy162的原核表達(dá)及分離純化#

周 虎，湯 鋒， 龐明泉，萬(wàn)陳飛，樊海寧，4，陽(yáng)丹才讓，4*，鄧 勇，4**

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)高原人畜共患病研究所，青海 西寧 810001；4.青海省包蟲(chóng)病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

多房棘球蚴重組蛋白CTB-Emy162的原核表達(dá)及分離純化#

周 虎1，3，湯 鋒2，3，4， 龐明泉1，3，萬(wàn)陳飛1，3，樊海寧1，3，4，陽(yáng)丹才讓1，3，4*，鄧 勇1，3，4**

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)高原人畜共患病研究所，青海 西寧 810001；4.青海省包蟲(chóng)病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

目的 構(gòu)建融合基因CTB-Emy162原核表達(dá)系統(tǒng)，純化得到多房棘球蚴重組蛋白CTB-Emy162。方法 根據(jù)多房棘球蚴抗原Emy162在GenBank中的序列，用生物信息學(xué)軟件OptimumTMCodon 優(yōu)化密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)、最優(yōu)密碼子頻率(FOP)及GC含量從而獲得適合大腸桿菌BL-21表達(dá)的Emy162基因序列。PCR擴(kuò)增Emy162基因，定向在pET-28a-CTB的CTB基因5′端插入Emy162基因。構(gòu)建CTB和Emy162雙基因原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-CTB-Emy162，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于E.coli BL-21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后，利用Ni-NTA 柱親和層析及離子交換色譜純化后獲得目的蛋白。結(jié)果 OptimumTMCodon 獲得優(yōu)化后的Emy162序列，經(jīng)生物公司測(cè)序及酶切鑒定結(jié)果證明重組質(zhì)粒pET28a-CTB-Emy162構(gòu)建成功，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CTB-Emy162在原核表達(dá)系統(tǒng)pET-28a中主要以包涵體形式存在，在可溶部位少量表達(dá)。繼而經(jīng)Ni-NTA柱親和純化及離子交換色譜純化獲得CTB-Emy162純蛋白。結(jié)論 以大腸桿菌E.coli BL-21(DE3)及pET-28a構(gòu)成的原核表達(dá)系統(tǒng)能夠成功表達(dá)重組蛋白CTB-Emy162，Ni-NTA純化柱能夠純化目的蛋白CTB-Emy162。

多房棘球蚴 Emy162 原核表達(dá)系統(tǒng)

包蟲(chóng)病(echinococcus)是一種人獸共患性寄生蟲(chóng)病。目前外科手術(shù)和藥物治療雖是包蟲(chóng)病治療的主要方案，但存在術(shù)后復(fù)發(fā)率高、藥物治療效果不理想的弊端[1]。疫苗預(yù)防相對(duì)于手術(shù)和藥物治療，是一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)而有效的防控措施。但包蟲(chóng)病疫苗的研制極具挑戰(zhàn)性，主要表現(xiàn)在棘球蚴在體內(nèi)寄生和進(jìn)化，發(fā)育各階段產(chǎn)生的抗原不同，很難找到一個(gè)有效抗原，現(xiàn)有疫苗免疫效果不佳。

本研究選取的多房棘球蚴絳蟲(chóng)表面抗原Emy162，是表達(dá)于多房棘球蚴絳蟲(chóng)4個(gè)發(fā)育階段(原頭節(jié)，續(xù)絳期，幼蟲(chóng)和成蟲(chóng))的基因序列[2]。Emy162抗原被證實(shí)具有抗多房棘球蚴感染作用且與細(xì)粒棘球蚴良好的免疫抗原Eg95具有類似的結(jié)構(gòu)特征[3-6]。這一生物學(xué)特性可以為研制抗泡型和囊型包蟲(chóng)病的疫苗提供可能。本實(shí)驗(yàn)擬借助分子生物學(xué)技術(shù)優(yōu)化Emy162的序列，并偶聯(lián)分子內(nèi)黏膜免疫佐劑霍亂毒素B亞單位(CTB)[7-12]。為獲得重組蛋白CTB-Emy162，本研究構(gòu)建適宜CTB-Emy162的表達(dá)的質(zhì)粒載體，并在大腸桿菌E.coli BL-21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，以獲得目的重組蛋白CTB-Emy162。為研究其作為抗棘球蚴病疫苗的價(jià)值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-CTB-UE由寧夏醫(yī)科大學(xué)郭樂(lè)教授惠贈(zèng)；原核表達(dá)載體pET-28a(E.coli)、BL21(DE3)株由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供；限制性內(nèi)切酶 KpnⅠ、XhoⅠ、Nco I、T4 DNA連接酶由Takara公司提供；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳DNA 純化回收試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司提供；Ni-NTA純化介質(zhì)、基因序列的合成優(yōu)化由南京金斯瑞公司提供并合成；卡納霉素(kana)由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 Emy162序列的獲得及優(yōu)化

從GenBank中獲得的目的基因Emy162氨基酸序列：1MVLRFCLILLATSVIAEEVGVDPELIAKLTKKLQTTLPEHFRWIHVGSRSLELGWNATGLANLHADHIKLTANLYTTYVSFRYRNVPIERQKLTLEGLKPSTFYEVVVQALKGDSEVYKYTGFIRTLAPGEDGADRAGGFALIFAMAGLLLLT153。在得到上述氨基酸序列的基礎(chǔ)上，使用生物信息學(xué)軟件OptimumTMCodon對(duì)目的序列進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，按照酶切位點(diǎn)對(duì)側(cè)翼序列的具體要求設(shè)計(jì)出包含相應(yīng)酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基的序列：

5′-ATGGTGCTGCGCTTTTGTCTGATCCTGCTGGCGACGAGTGTTATTGCGGAAGAAGTGGGCGTGGACCCGGAACTGATTGCTAAACTGACCAAAAAACTGCAGACCACGCTGCCGGAACATTTTCGTTGGATTCACGTCGGCAGCCGCTCTCTGGAACTGGGCTGGAACGCGACCGGTCTGGCCAATCTGCATGCAGATCACATTAAACTGACGGCCAACCTGTATACCACGTACGTGAGCTTCCGTTATCGCAATGTTCCGATCGAACGTCAGAAACTGACCCTGGAAGGTCTGAAACCGAGTACGTTTTACGAAGTGGTTGTCCAAGCGCTGAAAGGCGACTCCGAAGTGTATAAATACACCGGTTTCATTCGTACGCTGGCTCCGGGTGAAGATGGTGCAGACCGTGCTGGTGGTTTTGCGCTGATCTTCGCGATGGCCGGCCTGCTGCTGCTGACC-3′。優(yōu)化后的序列委托南京金斯瑞生物科技公司進(jìn)行上述目的基因的合成，并按照大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性原則轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的核苷酸序列。

1.2.2 多房棘球蚴表面抗原Emy162的基因合成與擴(kuò)增

將前期獲取的Emy162的氨基酸序列，委托南京金斯瑞生物科技公司將氨基酸序列轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的核苷酸序列并進(jìn)行基因合成。合成后的Emy162進(jìn)行PCR：40 μL PCR總體系中包括Emy162模板2 μL，Master mix 20 μL，Emy162引物2 μL，ddH2O 16 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 sec，72 ℃退火30 sec，72 ℃延伸40 sec，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3 pET28a-CTB-Emy162質(zhì)粒載體的構(gòu)建

通過(guò)質(zhì)粒小量提取試劑盒(天根)提取質(zhì)粒pET-CTB-UE，經(jīng)Kpn I和Xho I在37 ℃下進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳DNA純化回收試劑盒回收pET-CTB表達(dá)載體?；厥蘸蟮膒ET-CTB與Emy162經(jīng)T4連接酶在冰箱(4℃)中過(guò)夜連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET28a-CTB-Emy162，并經(jīng)Nco I和Xho I酶切鑒定。構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL-21中，涂布在含有kana抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，過(guò)夜培養(yǎng)(37℃)。次日晨挑取陽(yáng)性菌株測(cè)序。

1.2.4 CTB-Emy162蛋白的表達(dá)及純化

經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序100%比對(duì)成功菌株及陰性對(duì)照菌(pET-28a載體不含目的基因)在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，按1：100的比例接種于200 mL LB 液體培養(yǎng)基中，搖床(190r/min，37℃)培養(yǎng)；待LB液體培養(yǎng)基OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入異丙基-β-硫代半乳糖(Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，至IPTG終濃度為0.1 mmol /L，搖床(190r/min，28℃)誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)夜后，讓宿主菌體充分誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，后經(jīng)離心(10000r/min，20min)收集沉淀，用PBS混懸，冰上行細(xì)胞破碎(20min)，離心(12000r/min，20min)后分別取上清和沉淀；收集離心后的上清，離心后的沉淀用8M尿素超聲溶解，離心(12000r/min，10min)，取上清為包涵體部位蛋白溶液，行SDS-PAGE電泳確定目的蛋白表達(dá)的部位。在確定了重組蛋白表達(dá)部位后，使用Ni-NTA鎳柱親和層析純化目的蛋白，純化目的蛋白時(shí)使用8 M尿素咪唑梯度(20、50、100、250mm/L咪唑)洗脫，收集各梯度洗脫液。將純化后的蛋白(250mm/L咪唑洗脫溶液)溶液裝入激活后的透析袋中，分別用含6、4、2、0 M尿素的PBS 梯度溶液放置于冰箱(4℃)中透析，每隔12 h更換1次梯度液(期間需輕輕搖晃以加快透析)，共透析48 h；透析完成，將溶液離心(12000r/min，15min)，收集上清。用聚乙二醇20000(PEG20000)濃縮已得到的純化蛋白，-80 ℃保存。

2 結(jié)果

2.1 Emy162序列的優(yōu)化

利用生物信息學(xué)軟件OptimumTMCodon對(duì)Emy162序列進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化內(nèi)容主要針對(duì)FOP、CAI及GC含量進(jìn)行調(diào)整。如圖1所示，CAI優(yōu)化前為0.55(圖1A)，優(yōu)化后為0.90(圖1B)；FOP優(yōu)化見(jiàn)圖1C、D，優(yōu)化后FOP為74；繼而對(duì)優(yōu)化前后序列的GC含量進(jìn)行考察，如圖1E、F所示：優(yōu)化前GC含量為46.51，優(yōu)化后為53.35。優(yōu)化后的Emy162序列達(dá)到大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性的最優(yōu)狀態(tài)序列：ATGGTGCTGCGCTTTTGTCTGATCCTGCTGGCGACGAGTGTTATTGCGGAAGAAGTGGGCGTGGACCCGGAACTGATTGCTAAACTGACCAAAAAACTGCAGACCACGCTGCCGGAACATTTTCGTTGGATTCACGTCGGCAGCCGCTCTCTGGAACTGGGCTGGAACGCGACCGGTCTGGCCAATCTGCATGCAGATCACATTAAACTGACGGCCAACCTGTATACCACGTACGTGAGCTTCCGTTATCGCAATGTTCCGATCGAACGTCAGAAACTGACCCTGGAAGGTCTGAAACCGAGTACGTTTTACGAAGTGGTTGTCCAAGCGCTGAAAGGCGACTCCGAAGTGTATAAATACACCGGTTTCATTCGTACGCTGGCTCCGGGTGAAGATGGTGCAGACCGTGCTGGTGGTTTTGCGCTGATCTTCGCGATGGCCGGCCTGCTGCTGCTGACC。

2.2 Emy162基因的cDNA序列的擴(kuò)增

Emy162基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(100V，30min)。經(jīng)SYBR Green I染色，觀察電泳結(jié)果，在約459 bp處出現(xiàn)特異性 DNA 擴(kuò)增條帶，其大小與理論推算一致，見(jiàn)圖2。

2.3 表達(dá)載體pET28a-CTB-Emy162的鑒定

經(jīng)T4連接酶體系連接將Emy162插入原核表達(dá)載體pET28a-CTB，并將重組質(zhì)粒載體命名為pET28a-CTB-Emy162，其結(jié)構(gòu)示意圖(圖3)可見(jiàn)其含有三個(gè)酶切位點(diǎn)，為目的DNA 的插入和酶切鑒定提供相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。表達(dá)載體pET28a-CTB-Emy162經(jīng)限制性內(nèi)切酶NcoI、XhoI雙酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，在790 bp大小左右有目的條帶(圖4)。表明原核表達(dá)載體pET28a-CTB中成功插入790 bp的基因序列。繼而經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該790 bp序列與CTB-Emy162完全吻合，無(wú)堿基錯(cuò)配及偏移等情況(圖5)。

2.4 pET28a-CTB-Emy162的原核表達(dá)及蛋白表達(dá)部位的鑒定

pET-CTB-Emy162經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，菌液上清即含分泌性蛋白，菌體經(jīng)超聲破碎離心后，收集可溶性及包涵體蛋白。收集液分別行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。電泳結(jié)果如下(圖6A)，可見(jiàn)在包涵體部位33 kD見(jiàn)明顯擴(kuò)增條帶，而在可溶部位僅有微弱表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，原核表達(dá)載體pET-28a能夠成功表達(dá)重組蛋白CTB-Emy162，且重組蛋白CTB-Emy162在原核表達(dá)載體pET-28a中是以包涵體形式表達(dá)。

A：優(yōu)化前密碼子適應(yīng)指數(shù)； B：優(yōu)化后密碼子適應(yīng)指數(shù)； C：優(yōu)化前最優(yōu)密碼子頻率； D：優(yōu)化后最優(yōu)密碼子頻率；E：優(yōu)化前GC含量； F：優(yōu)化后GC含量

A1：D2000 Plus DNA Ladder； 2：PCR 擴(kuò)增得到Emy162基因的cDNA序列(459bp)

圖3 重組質(zhì)粒pET-CTB-Emy162結(jié)構(gòu)示意圖

1：Maker； 2：pET-CTB-Emy162經(jīng)Nco I /Xho I雙酶切

圖5 重組質(zhì)粒pET-CTB- Emy162測(cè)序結(jié)果比對(duì)圖

A1：pET-28a全菌蛋白(陰性對(duì)照)； 2：pET28a-CTB-Emy162全菌蛋白； 3：pET28a- CTB-Emy162可溶蛋白；4：包涵體蛋白.B1：包涵體蛋白；2：純化CTB-Emy162蛋白

2.5 pET-CTB-Emy162的純化結(jié)果

本研究證實(shí)，目的蛋白CTB-Emy162在細(xì)菌的包涵體部位表達(dá)，將收集的pET-CTB-Emy162包涵體溶液經(jīng)Ni-NTA離子層析純化，經(jīng)復(fù)性后獲得純化后的蛋白CTB-Emy162，行SDS-PAGE觀察純化后的效果見(jiàn)圖6B，可見(jiàn)經(jīng)純化后的目的蛋白CTB-Emy162在33 kD有一條明顯增粗的條帶，實(shí)際大小與理論值相符。本實(shí)驗(yàn)表明，利用pET-28a原核表達(dá)載體表達(dá)的重組蛋白CTB-Emy162經(jīng)純化后基本能達(dá)到電泳純的級(jí)別。

3 討論

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用歷史悠久。1977年，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出人生長(zhǎng)激素[13]。現(xiàn)如今，借助大腸桿菌作為工程菌表達(dá)生產(chǎn)的蛋白約占現(xiàn)有重組蛋白藥物的三分之一[14]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)作為典型的原核表達(dá)系統(tǒng)之一，主要由表達(dá)載體、外源基因(目的基因)、表達(dá)宿主菌三部分組成[15，16]。由于其遺傳背景清楚、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、實(shí)驗(yàn)成本較為低廉，并可快速量產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)[17，18]。此外，pET系列原核表達(dá)載體是美國(guó)Novagen公司設(shè)計(jì)推廣的大腸桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)，pET系列原核表達(dá)體系利用IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)子來(lái)過(guò)量表達(dá)T7 RNA聚合酶，繼而使得宿主菌表達(dá)大量的目的蛋白[19]。

根據(jù)目的蛋白在宿主菌中表達(dá)的部位不同，可將目的蛋白的原核表達(dá)分為胞外、周質(zhì)、胞質(zhì)表達(dá)三種形式。其中，胞外表達(dá)目的蛋白主要被分泌到宿主菌的培養(yǎng)基中，故容易純化且有活性。周質(zhì)表達(dá)也稱可溶性表達(dá)，蛋白主要存在周漿間隙中，目的蛋白是否有活性，主要受自身結(jié)構(gòu)和誘導(dǎo)溫度、滲透壓、pH等外界環(huán)境影響[20]。胞質(zhì)表達(dá)即以包涵體形式表達(dá)，其目的蛋白量雖較前兩者而言最高，但由于目的蛋白易形成無(wú)活性的包涵體，需經(jīng)變性復(fù)性才能得到有活性的目的蛋白[21，22]。

此外，以pET-28a為載體表達(dá)的蛋白多以包涵體形式存在，這可能是由于細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解，宿主菌代謝負(fù)荷過(guò)大使得表達(dá)產(chǎn)物不能形成有活性的天然構(gòu)象導(dǎo)致的[23]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)可溶部位少量表達(dá)，其原因可能是：(1)誘導(dǎo)表達(dá)的溫度過(guò)低，宿主菌生長(zhǎng)速度減慢，蛋白結(jié)構(gòu)折疊正確，相應(yīng)增加分泌性蛋白的表達(dá)；(2)誘導(dǎo)蛋白過(guò)度表達(dá)，可能改變了大腸桿菌還原性的胞質(zhì)環(huán)境，從而形成較多的二硫鍵，促進(jìn)可溶性表達(dá)；(3)連接體(Linker)有可能影響了蛋白序列，進(jìn)而改善蛋白折疊，增加可溶蛋白的表達(dá)；(4)可溶部位蛋白超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，少量包涵體破碎，目的蛋白釋放；(5)其他原因，包括IPTG濃度、培養(yǎng)液的pH影響等。

蛋白純化的原理主要利用不同蛋白間存在的差異性，這種差異主要表現(xiàn)蛋白的大小上，蛋白的大小影響著該蛋白所帶的電荷大小。此外，蛋白的疏水性、溶解度和生物學(xué)活性等也影響著蛋白的純化。正是由于這種不同蛋白質(zhì)之間存在差異，才可以將目的蛋白從其他蛋白中純化出來(lái)[24]。本實(shí)驗(yàn)中，在構(gòu)建重組蛋白CTB-Emy162表達(dá)載體時(shí)，選擇的質(zhì)粒載體為C末端帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的pET-28a。這種質(zhì)粒載體表達(dá)蛋白的產(chǎn)量高，但表達(dá)的蛋白因不能形成正確的空間結(jié)構(gòu)，而以包涵體的形式存在。此外，pET-28a攜帶的組氨酸是具有雜環(huán)的氨基酸，每個(gè)組氨酸含有一個(gè)咪唑基團(tuán)(帶有很多額外電子)，對(duì)于帶正電的化學(xué)物質(zhì)(蛋白)有靜電引力。組氨酸標(biāo)簽在pH為8.0時(shí)不帶電，且無(wú)免疫原性，對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)、結(jié)構(gòu)折疊及功能的影響極小，且能高度親和鎳離子。鎳柱親和層析正是利用這一原理將帶有組氨酸的蛋白吸附掛柱。因此選擇帶有組氨酸標(biāo)簽的pET-28a作為質(zhì)粒載體，不僅可以提高蛋白產(chǎn)量，也可以為后期目的蛋白的純化做好鋪墊。

本研究是在獲得多房棘球蚴表面抗原Emy162的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)軟件OptimumTMCodon對(duì)其CAI、FOP及GC含量及編碼的序列進(jìn)行合理優(yōu)化，以獲取適合大腸桿菌表達(dá)的基因，并插入免疫佐劑載體CTB基因，以增強(qiáng)蛋白的免疫效果。本實(shí)驗(yàn)將重組序列CTB-Emy162成功轉(zhuǎn)入原核表達(dá)載體pET-28a，并經(jīng)酶切、測(cè)序確證，后經(jīng)蛋白表達(dá)、純化、表達(dá)部位鑒定等，證實(shí)pET-28a能夠作為CTB-Emy162的表達(dá)載體，且在包涵體部位高量表達(dá)。CTB-Emy162經(jīng)純化復(fù)性后獲得可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的電泳純蛋白。

[1]Lorenzatto KR，Monteiro KM，Paredes R，et al.Fructose-bisphosphate aldolase and enolase from Echinococcus granulosus：genes，expression patterns and protein interactions of two potential moonlighting proteins[J].Gene，2012，506(1)：76-84.

[2]Li Y，Liu X，Zhu Y，etal.Bioinformatic prediction of epitopes in the Emy162 antigen of Echinococcus multilocularis[J].Exp Ther Med，2013，6(2)：335-340.

[3]Ito A，Schantz PM，Wilson JF.Em18，a new serodiagnostic marker for differentiation of active and inactive cases of alveolar hydatid disease[J].Am J Trop Med Hyg，1995，52(1)：41-44.

[4]Ito A，Nakao M，Kutsumi H.Serodiagnosis of alveolar hydatid disease by Western blotting[J].Trans R Soc Trop Med Hyg，1993，87(2)：170-172.

[5]Katoh Y，Kouguchi H，Matsumoto J，et al.Characterization of Emy162 encoding an immunogenic protein cloned from an adult worm-specific cDNA library of Echinococcus multilocularis[J].Biochim Biophys Acta，2007，1780(1)：1-6.

[6]Kouguchi H，Matsumoto J，Katoh Y，et al.The vaccination potential of EMY162 antigen against Echinococcus multilocularis infection[J].Biochim Biophys Acta，2007，363(4)：915-920.

[7]Schulze K，Medina E，Talay SR，et al.Characterization of the domain of fibronectin-binding protein I of Streptococcus pyogenes responsible for elicitation of a protective immune response[J].Infect Immun，2001，69(1)： 622-625.

[8]PizzaM，G iulianiMM，F(xiàn)ontana MR，et al.Mucosal vaccines：nontoxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants[J].Vaccine，2001，19：2534-2541.

[9]Sun JB，Raghavan S，Sjoling A，et al.Oral tolerance induction with antigen conjugated to cholera toxin B subunit generates both Foxp3+ CD25+ and Foxp3- CD25- CD4+ regulatory T cells[J].J Immunol，2006，177(11)：7634-7644.

[10]Thomas Stratmann.Cholera Toxin Subunit B as Adjuvant—An Accelerator in Protective Immunity and a Break in Autoimmunity[J].Vaccines，3(3)：579-596.

[11]Han Lei，Xiaojue Peng，et al.Broadly protective immunity against divergent influenza viruses by oral co-administration of Lactococcus lactis expressing nucleoprotein adjuvantedwith cholera toxin B subunit in mice[J].Microb Cell Fact，2015，14：111.

[12]Cynthia Maeto.Novel Mucosal DNA-MVA HIV Vaccination in Which DNAIL-12 Plus Cholera Toxin B Subunit(CTB)Cooperates to Enhance Cellular Systemic and Mucosal Genital Tract Immunity[J].PLOS ONE，2014，9(9)：e107524.

[13]DV Goeddel，Kleid DG，Bolivar F，et al.Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin[J].Proc Natl Acad SciUSA，1979，76(1)：106-10.

[14]Ferrer-Miralles N，Domingo-Espín J，Corchero JL，et al.Microbial factories for recombinant pharmaceuticals[J].Microb Cell Fact，2009，8：17.

[15]解庭波.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008，03：77-82.

[16]許崇利，楊梅，許崇波. 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的影響因素[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2010，08：66-68.

[17]NucP，Nuc K.Recombinan t protein production in Escherichia coli[J].Postepy Biochem，2006，52( 4)：448-456.

[18]Dong X，Tang B，Li J，et al.Expression and Purification of In tact and Functional S oyb ean( Glycine max)Seed Ferritin Complex in Escherichia coli[J].J Microbiol Biotech nol，2008，18( 2)：299-307.

[19]Novagen.pET System Manual[M].9th Edition.2000.

[20]衛(wèi)紅飛.重組表位蛋白在大腸桿菌中表達(dá)水平的影響因素[D].吉林大學(xué)，2014.

[21]劉爽，胡寶成.原核系統(tǒng)可溶性表達(dá)策略[J].生物技術(shù)通訊.2005，2：172-175.

[22]蘇裕.大腸桿菌中重組蛋白可溶性表達(dá)的研究[D].華東師范大學(xué)，2007.

[23]Georgiou G，Segatori L.Preparative expression of secreted proteins in bacteria：status report and future prospects[J].Curr Opin Biotechnol，2005，16(5)：538-545.

[24]Glenthoj A，Dahl S，Larsen MT，et al.Human alpha-Defensin Expression Is Not Dependent on CCAAT/Enhancer Binding Protein-epsilon in a Murine Model[J].PLoS One，2014，9：e92471.

Prokaryotic expression and purification of recombinant protein CTB-Emy162 inEchinococcusmultilocularis

Zhou Hu1，3，Tang Feng2，3，Pang Mingquan1，3，Wan Chenfei1，3，F(xiàn)an Haining1，3，Yangdan Cairang1，3*，Deng Yong1，3**

(1.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery，Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining，Qinghai 810001；2.Research Center for High Altitude Medical Sciences，Qinghai University School of Medicine，Xining，Qinghai 810001 3.Research Institute for High Altitude Zoonosis of Qinghai University)

Objective Constructed a prokaryotic expression system for CTB-Emy162 and obtained Purified fusion proteinCTB-Emy162 inEchinococcusmultilocularis.Method According to the sequence ofEchinococcusmultilocularisEmy162 antigen in GenBank，Bioinformatics software OptimumTMCodon was used to obtain a suitable sequence of gene expressed in E.coli BL-21 by optimizing of codon adaptation index(CAI).The optimal codon fre-quency(FOP)and the content of GC.and the optimization sequence were cloned into prokaryotic expression vector and pET-28a.IPTG induction，Ni-NTA affinity chromatography and ion exchange chromatogra-phy were utilized to obtain CTB-Emy162 protein.Results Emy162 sequencewe procured was suitable for prokaryotic expression system by OptimumTMCodon software.Recombinant plasmids pET28a-CTB-Emy162 were constructed successfully and identified by double-enzyme digestion and sequencing.Further，our results were indicated that CTB-Emy162 was expressed in inclusion bodies part of pET28a-CTB-Emy162.Finally，we obtained highly purified recombinant protein CTB-Emy162 by Ni-chelating affinity chromatography.Conclusions In this study，we successfully establish the prokaryotic expression system of CTB-Emy162，and obtain highly purified CTB-Emy162.

EchinococcusmultilocularisEmy162 Prokaryotic expression system

R383.3

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.01.002

2015-06-09

#：青海省科技廳項(xiàng)目(編號(hào)：2014-ZJ-716)；青海大學(xué)中青年團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(編號(hào)：2014-QYT-1).*：第一通訊作者，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，yangdancairang@163.com；**：第二通訊作者，教授，碩士研究生導(dǎo)師，dengyong@medmail.com.cn. 周虎(1989～)，男，漢族，安徽籍，在讀碩士，青海大學(xué)普通外科學(xué)專業(yè)