CXCR4／CXCL12信號途徑在食管鱗癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用機制

周玉汀 田 輝

CXCR4／CXCL12信號途徑在食管鱗癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用機制

周玉汀1田 輝2

目的 研究趨化因子受體4（CXCR4）／趨化因子12（CXCL12）信號途徑在食管鱗癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用機制，為探討CXCR4成為食管癌治療新的靶點提供理論依據(jù)。方法 取對數(shù)生長期的食管鱗癌EC9706細胞，添加趨化因子CXCL12，通過侵襲轉(zhuǎn)移實驗、黏附實驗分別檢測食管鱗癌EC9706細胞株的細胞侵襲、移動和黏附能力。采用RT－PCR和Western Blot技術(shù)檢測表皮生長因子受體（EGFR）mRNA及蛋白的表達水平。結(jié)果 添加不同濃度趨化因子CXCL12（終濃度為5、10μg／ml），食管鱗癌EC9706細胞株的細胞侵襲、移動和黏附能力均較空白對照組高，并且存在劑量依存關(guān)系，即CXCL12濃度越高，細胞的侵襲、移動、黏附能力越強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。添加不同濃度趨化因子CXCL12，食管鱗癌細胞的EGFR mRNA和蛋白表達水平均較對照組高，并且存在劑量依存關(guān)系，即CXCL12濃度越高，EGFR mRNA和蛋白表達水平越高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。結(jié)論 CXCR4／CXCL12信號途徑與食管鱗癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且存在劑量依存關(guān)系，有可能通過調(diào)控EGFR的表達參與食管鱗癌的浸潤轉(zhuǎn)移。

食管鱗狀細胞癌； 趨化因子受體4； 趨化因子12； 表皮生長因子受體； 腫瘤侵襲； 腫瘤轉(zhuǎn)移

我國是世界上食管癌發(fā)病率最高的地區(qū)。趨化因子受體4（chemokine receptor 4，CXCR4）是趨化因子12（chemotactic factor 12，CXCL12）的特異性趨化因子受體，研究表明［12］，CXCR4／CXCL12調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞的增殖，CXCR4可能會成為食管癌治療新的靶點。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的高表達可促進血管生成和腫瘤細胞的增殖、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細胞的凋亡，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本實驗采用食管鱗癌EC9706細胞，添加趨化因子CXCL12，通過侵襲實驗、黏附實驗分別檢測食管鱗癌EC9706細胞株的細胞侵襲、移動和黏附能力，同時采用RT－PCR和Western Blot技術(shù)檢測EGFR mRNA和蛋白的表達水平，進一步深入研究CXCR4／CXCL12信號途徑在食管鱗癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用及機制，為探討CXCR4成為食管癌治療新的靶點提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料

細胞株和細胞培養(yǎng)：食管鱗癌EC9706細胞株由中科院上海細胞生物研究所提供，采用含10%小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng)。

二、方法

1．體外細胞預(yù)處理及分組：取處于對數(shù)生長期的細胞，常規(guī)胰酶消化，接種于培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12h后分別添加趨化因子CXCL12，使其終濃度為10和5μg／ml，另設(shè)空白培養(yǎng)基作陰性對照。體外細胞黏附試驗及侵襲轉(zhuǎn)移試驗采用96孔板，細胞EGFR mRNA及蛋白檢測采用9孔板。

2．體外細胞黏附試驗：96孔板中分別滴加含2μg Matrigel的RPMI1640培養(yǎng)基50μl，每孔加入無血清培養(yǎng)液20μl，采用PBS處理，之后每孔分別加入經(jīng)處理后的細胞，以1×106／ml接種，每組細胞設(shè)3個復(fù)孔，孵育1h，洗去未黏附細胞。每孔加入50μl 0．04%結(jié)晶紫染液，PBS洗滌后，光學(xué)顯微鏡（×200）觀察成像。每孔加入10%冰醋酸100μl，抽取結(jié)晶紫染液10min，于多功能酶標(biāo)儀560nm處檢測吸光度值。

3．體外細胞侵襲轉(zhuǎn)移試驗：Transwell小室上室面加入5μg Matrigel包被，在下室面鋪10μl纖維黏連蛋白，向小室加入含1%BSA的無血清培養(yǎng)基，孵育2h，使基質(zhì)膠再水化。食管鱗癌EC9706細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，取細胞，將細胞胰酶消化，制成細胞懸液。將細胞懸液接種到Transwell小室，用棉簽輕輕擦除Matrigel基質(zhì)膠和上室面未侵襲的細胞，以0．1%結(jié)晶紫染色，中性樹膠將膜封于載玻片上。光學(xué)顯微鏡（×200）觀察并成像，400倍顯微鏡下每膜隨機計數(shù)10個視野侵襲細胞數(shù)，取平均值為每種細胞的侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)。侵襲細胞數(shù)＝小室膜黏附細胞數(shù)＋孔內(nèi)細胞數(shù)。

4．PCR－PCR檢測細胞EGFR mRNA的表達：PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。EGFR引物序列：5’－GGACGACGTGGTGGATGCCG－3’（上游引物）；5’－GGCGCCTGTGGGGTCTGAGC－3’（下游引物）。內(nèi)參照為人β－actin，引物序列：5’－AACTCCATCATGAAGTGTGA－3’（上游引物）；5’－ACTCCTGCTTGCTGATCCAC－3’（下游引物）。

加入Trizol，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以試劑盒提供的對照RNA反轉(zhuǎn)錄作為陽性對照，監(jiān)測整個反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明書操作。cDNA模板2μl，10μmol／L的上下游引物各lμl，2×PCR TaqMix 12．5μl，充分混勻后，于PCR儀上進行PCR擴增。EGFR的PCR產(chǎn)物長度為208bp，β－actin PCR產(chǎn)物長度為247bp。擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增產(chǎn)物條帶用凝膠成像分析系統(tǒng)作光密度（OD）測定，用目的基因與β－actin光密度的比值作為目的基因mRNA的相對含量，并與Marker對照，觀察擴增效果。

5．Western blotting檢測細胞EGFR蛋白的表達：每孔細胞樣本加入100μl細胞裂解液，裂解物移入離心管中。取5μl樣本加入5μl 2×SDSPAGE加樣緩沖液，100℃加熱處理5min，冰上冷卻。樣品使用10%SDS－PAGE分離，每孔上樣量為20μl。電泳結(jié)束后，將PVDF膜在甲醇中浸泡1min，再使用Transfer Buffer浸泡凝膠、濾紙和在甲醇中浸泡過的PVDF膜10min，然后制備轉(zhuǎn)移三明治。進行半干電泳轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移條件為30mA 60min。轉(zhuǎn)移完畢后，用膜染色液染色并標(biāo)記蛋白質(zhì)Marker的條帶位置。免疫反應(yīng)，用0．01mol／LPBS洗膜，加入包被液；棄包被液，PBS洗膜，加入一抗；（陰性對照：以1%BSA取代一抗）棄一抗和1%BSA，PBS洗膜；加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗；棄二抗，PBS洗膜。進行化學(xué)發(fā)光檢測，X線片曝光。顯影定影處理后，膠片用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，使用Gel－Pro Analyzer軟件分析處理。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用n（%）表示，兩樣本率的比較采用四格表資料的χ2檢驗；多樣本率的比較采用行×列表χ2檢驗；計量資料以x±s表示，兩樣本比較采用t檢驗和方差分析。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、癌細胞與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的黏附能力

細胞黏附試驗結(jié)果顯示，食管鱗癌EC9706細胞經(jīng)不同處理后與ECM的黏附能力不同。圖1顯示，添加空白培養(yǎng)基以及趨化因子CXCL12 5、10 μg／ml黏附細胞的平均光密度值分別為0．12± 0．021、0．25±0．011和0．38±0．006，癌細胞與ECM的黏附能力有顯著性差異，其中添加趨化因子CXCL12 10μg／ml表現(xiàn)出與ECM更強的黏附能力，空白培養(yǎng)基最弱，三者之間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝809．75，P﹤0．001）。試驗結(jié)果表明，癌細胞與ECM的黏附能力與趨化因子CXCL12密切相關(guān)，并且存在劑量依存關(guān)系，即CXCL12濃度越高，癌細胞與ECM的黏附能力越強。

二、CXCL12與其受體CXCR4結(jié)合，可提高癌細胞的侵襲、遷移能力

圖2顯示，經(jīng)不同處理后癌細胞的侵襲、遷移能力顯著不同。添加空白培養(yǎng)基及5、10μg／ml趨化因子CXCL12，癌細胞穿過人工基膜的細胞數(shù)分別為5．3±1．8，18．9±2．1和41．2±4．6，其中添加10μg／ml趨化因子CXCL12表現(xiàn)出更強的侵襲、遷移能力，空白培養(yǎng)基最弱，三者之間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝338．25，P＜0．001）。這一結(jié)果同細胞黏附實驗結(jié)果一致，充分證明添加不同濃度趨化因子CXCL12與細胞的侵襲、遷移能力密切相關(guān)，并且存在劑量依存關(guān)系，CXCL12濃度越高，癌細胞侵襲、遷移能力越強。

圖1 細胞黏附實驗：添加不同濃度CXCL12后癌細胞與ECM的黏附能力（×200）。A：空白對照；B：添加趨化因子CXCL12 5μg；C：添加趨化因子CXCL12 10μg。

圖2 Transwell小室檢測添加不同濃度CXCL12癌細胞是侵襲、遷移能力（×200）。A：空白對照；B：添加趨化因子CXCL12 5μg；C：添加趨化因子CXCL12 10μg。

三、CXCL12與其受體CXCR4結(jié)合，癌細胞的EGFR mRNA表達增強

1．RNA純度和完整性分析：RNA經(jīng)雙光束紫外分光光度計檢測，所有樣本A260nm／A280nm的比值均在1．8～1．9，表明所提取的總RNA純度好，可用于下一步的反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR擴增。RNA瓊脂糖凝膠電泳顯示，28S、18S、5S條帶清晰，表明所提取的總RNA完整性好，無降解（圖3）。

圖3 RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2．EGFR mRNA的表達水平：圖4顯示，經(jīng)不同處理后，癌細胞的EGFR mRNA表達水平顯著不同，經(jīng)內(nèi)參β－actin標(biāo)準(zhǔn)化后，添加空白培養(yǎng)基以及5、10μg／ml趨化因子CXCL12，與其比值分別為0．103±0．044、0．851±0．167和1．114±0．732，其中添加趨化因子CXCL12 10μg／ml表現(xiàn)出更強的mRNA表達，空白培養(yǎng)基最弱，三者之間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝14．62，P﹤0．001）。試驗結(jié)果表明，癌細胞EGFR mRNA表達水平與趨化因子CXCL12密切相關(guān)，并且存在劑量依存關(guān)系，CXCL12濃度越高，癌細胞的EGFR mRNA表達水平越強。

圖4 RT－PCR技術(shù)檢測EGFR mRNA的表達水平

四、CXCL12與其受體CXCR4結(jié)合，癌細胞EGFR蛋白的表達水平增強

圖5顯示，經(jīng)不同處理后，癌細胞EGFR蛋白表達水平顯著不同，經(jīng)內(nèi)參β－actin標(biāo)準(zhǔn)化后，添加空白培養(yǎng)基以及5、10μg／ml趨化因子CXCL12后，與其比值分別為0．065±0．033、0．443±0．101和0．907±0．226，其中添加趨化因子CXCL12 10μg／ml表現(xiàn)出更強的蛋白表達，空白培養(yǎng)基最弱，三者之間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝85．26，P＜0．001）。實驗結(jié)果表明，癌細胞EGFR蛋白表達水平與趨化因子CXCL12密切相關(guān)，并且存在劑量依存關(guān)系，CXCL12濃度越高，癌細胞的EGFR蛋白表達越強。

圖5 Western Blot檢測EGFR蛋白的表達水平

討 論

趨化因子（chemokines）是一類分泌型的小分子多肽，在抗感染免疫中起著關(guān)鍵作用，還能影響血管的生成、膠原的產(chǎn)生及造血干細胞的增殖等［3］。CXCR4是最常見的趨化因子受體，并且是CXCL12的特異性α趨化因子受體［4］。研究顯示：CXCL12－CXCR4軸能發(fā)揮多種作用，如介導(dǎo)炎癥細胞跨膜遷移、對T淋巴細胞增殖起共刺激作用和參與慢性炎癥發(fā)生，作為T細胞人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）－1的共受體作用，參與白細胞浸潤、細胞遷移和器官發(fā)育等［5］。CXCL12／CXCR4生物學(xué)軸在包括食管癌、胃癌等在內(nèi)的多種實體瘤的生長、播散、器官特異性轉(zhuǎn)移及腫瘤免疫抑制中發(fā)揮作用，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)［6］。CXCL12在肝、肺、乳腺、淋巴結(jié)、骨髓組織內(nèi)強表達。高表達CXCR4的惡性腫瘤細胞，可能在CXCL12趨化、牽引下轉(zhuǎn)移至作為配體產(chǎn)生源的某些器官，而特異性轉(zhuǎn)移至以上器官。阻斷CXCR4的作用可以抑制腫瘤的發(fā)生和遠處轉(zhuǎn)移［78］。

成纖維細胞是基質(zhì)中分泌CXCL12的主要細胞，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中成纖維細胞分泌的CXCL12明顯升高，內(nèi)皮祖細胞通過血液循環(huán)，趨化到達腫瘤病灶，并進一步作用于CXCR4，促使CXCR4表達上調(diào)［9］。本實驗通過體外細胞黏附試驗及侵襲轉(zhuǎn)移試驗，結(jié)果充分說明添加不同濃度趨化因子CXCL12與癌細胞的侵襲、遷移能力密切相關(guān)，并且存在劑量依存關(guān)系，即CXCL12濃度越高，癌細胞侵襲、遷移能力越強。而CXCL12作用于CXCR4，使CXCR4表達上調(diào)，進而通過刺激腫瘤細胞生長、趨化腫瘤細胞以及促進血管生長和消化ECM的間接作用，促進腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。實驗結(jié)果表明，CXCR4／CXCL12信號途徑與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。

RT－PCR和Western Blot實驗結(jié)果表明，癌細胞的EGFR mRNA和蛋白表達水平與趨化因子CXCL12密切相關(guān)，并且存在劑量依存關(guān)系，CXCL12濃度越高，EGFR mRNA及蛋白表達越強。EGFR是一種膜表面?zhèn)鞲衅?，具有酪氨酸蛋白激酶的活性，其本身是原癌基因表達的產(chǎn)物。EGFR與表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）結(jié)合，可以導(dǎo)致細胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶活化，激活一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，細胞出現(xiàn)異常增殖和凋亡障礙，并促進腫瘤的形成和進展。試驗結(jié)果表明，CXCR4基因有可能通過調(diào)控EGFR的表達參與食管鱗癌的浸潤轉(zhuǎn)移，是其參與食管鱗癌浸潤轉(zhuǎn)移的可能機制之一。Porcile等［10］在卵巢癌的研究中證實CXCR4活化誘導(dǎo)EGFR磷酸化，依次激活細胞內(nèi)激酶ERKl／2、Akt。另外細胞內(nèi)酪氨酸激酶也參與了CXCL12／CXCR4－EGFR的轉(zhuǎn)活，提示EGFR也在CXCL12／CXCR4細胞增殖的途徑中發(fā)揮作用。Dutton等［11］應(yīng)用針對EGFR靶點的治療藥物吉非替尼及安慰劑治療化療后進展的食管癌患者，發(fā)現(xiàn)吉非替尼組吞咽疼痛癥狀緩解更明顯。Meng等［12］研究報道，應(yīng)用另一種針對EGFR靶點的治療藥物西妥昔單抗聯(lián)合同步放化療治療食管癌55例，效果良好，不良反應(yīng)未增加。黃鏡等［13］報道用另一種EGFR激酶抑制劑?？颂婺嶂委烢GFR過表達或擴增的晚期食管癌，展現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性和安全性。已有多項研究顯示EGFR在食管癌中高表達，意味著為食管癌的靶向治療提供了潛在的選擇。

目前研制有關(guān)阻斷CXCL12／CXCR4軸的藥物已引起了人們的高度關(guān)注［14］，CXCL12中和抗體、CXCR4受體拮抗劑［15］、通過RNA干擾技術(shù)抑制CXCR4基因［16］、CXCR4抑制劑AMD3100等可阻斷異常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［17］。應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)shRNA靜默CXCR4可有效地抑制食管鱗癌細胞生長，提高凋亡率，有效地抑制食管癌的轉(zhuǎn)移能力［18］。食管癌靶向治療正處在一個起步階段，研究還相對較少，以CXCL12／CXCR4軸為靶點治療的方法值得期待。

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Mechanism of CXCR4／CXCL12 signaling pathway in invasion and metastasis of esophageal squamous

carcinoma Zhou Yuting1，Tian Hui2．1Department of Thoracic Surgery，Zibo Central Hospital，Zibo 255036，China；2Department of Thoracic Surgery，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China

Tian Hui，Email：tianhuiql＠126．com

Objective To explore the mechanism of chemokine receptor 4（CXCR4）／chemotactic factor 12（CXCL12）signaling pathway in invasion and metastasis of esophageal squamous carcinoma so as to provide theoretical basis for CXCR4as a new target in tumor treatment．Methods Esophageal squamous carcinoma EC9706cells in logarithmic phase were treated with CXCL12，and the invasion，migration and adhesion capabilities of EC9706cells were assessed by the assays of cell adhesion and transwell chamber．RT－PCR and Western Blot were performed to determine the expression of epidermal growth factor receptor（EGFR）mRNA and protein．Results The capabilities of invasion，migration and adhesion of EC9706cells increased with the concentrations of CXCL12（5，10μg／ml）in a dose－dependent manner（P＜0．01），and were significantly higher than those of blank controls（P＜0．01）．The expression of EGFR mRNA and protein in EC9706cells increased with the concentrations of CXCL12in a dose－dependent manner（P＜0．01），and was significantly higher than that of controls（P＜0．01）．Conclusions CXCR4／CXCL12signaling pathway is related to tumor invasion and metastasis，which exhibits a dose－dependent relationship．CXCR4／CXCL12signaling pathway may participate in the invasion and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma via regulating the expression of EGFR．

Esophageal squamous cell carcinoma； Chemokine receptor 4； Chemotactic factor 12；Epidermal growth factor receptor； Tumor invasion； Tumor metastasis

2016－03－25）

（本文編輯：周珠鳳）

10．3877／cma．j．issn．2095－8773．2016．04．08

255036 淄博市中心醫(yī)院胸外科1；250012 濟南，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院胸外科2

田輝，Email：tianhuiql＠126．com

周玉汀，田輝．CXCR4／CXCL12信號途徑在食管鱗癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用機制［J／CD］．中華胸部外科電子雜志，2016，3（4）：228－233．