適配體上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感技術(shù)在食品安全快速檢測(cè)中的應(yīng)用

任舒悅李巧鳳高志賢

300050天津，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所,天津市環(huán)境與食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（任舒悅、高志賢）；450001鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（李巧鳳）

·綜述·

適配體上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感技術(shù)在食品安全快速檢測(cè)中的應(yīng)用

任舒悅李巧鳳高志賢

300050天津，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所,天津市環(huán)境與食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（任舒悅、高志賢）；450001鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（李巧鳳）

食品安全快速檢測(cè)技術(shù)在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域扮演著至關(guān)重要的角色。傳統(tǒng)理化檢測(cè)方法存在耗費(fèi)大、操作難、檢測(cè)環(huán)境要求高等問題，不能滿足質(zhì)量安全監(jiān)督中快速現(xiàn)場(chǎng)篩查的需求，正逐步被新興的快速檢測(cè)傳感技術(shù)代替。新型適配體上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感技術(shù)建立在功能化上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料與適配體技術(shù)相結(jié)合基礎(chǔ)上，是一種新興快速檢測(cè)技術(shù)。與傳統(tǒng)免疫熒光技術(shù)相比，其靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于快速檢測(cè)中。對(duì)上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)及適配體技術(shù)進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹，對(duì)基于適配體的上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感技術(shù)及其在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了綜述；根據(jù)目前的應(yīng)用領(lǐng)域，指出了該技術(shù)存在的瓶頸及未來的發(fā)展趨勢(shì)，為該技術(shù)在食品安全及多領(lǐng)域的應(yīng)用提供了參考。

適配體；上轉(zhuǎn)換發(fā)光；生物傳感器；食品安全；快速檢測(cè)

Fund program:National Natural Science Foundation of China(21477162),Science and Technology Support Program of Tianjin,China(14ZCZDSF0021）

0 引言

目前，食品污染事件頻出，食品安全成為全球最受關(guān)注的話題之一。食品質(zhì)量安全領(lǐng)域中常用的理化檢測(cè)方法有液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法等，其存在樣品前處理復(fù)雜、耗時(shí)費(fèi)力、成本高等問題，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)篩查的需求[1]。一些現(xiàn)代生物技術(shù)如DNA探針、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、生物芯片、酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定等，雖具有對(duì)靶標(biāo)分子高效富集、特異性高、快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[2-4]，但存在樣品前處理復(fù)雜、抗體制備困難、生物原料容易失活、檢測(cè)微環(huán)境要求較高等缺點(diǎn),限制了其在食品污染物現(xiàn)場(chǎng)篩查中的廣泛應(yīng)用[5]。因此，適用于現(xiàn)場(chǎng)篩查且簡(jiǎn)單、快速的食品污染物篩查技術(shù)是食品安全快速檢測(cè)領(lǐng)域的重點(diǎn)研究方向。

1 上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)

上轉(zhuǎn)換發(fā)光（up-converting phosphor,UCP）材料是由稀土元素構(gòu)成的發(fā)光晶體材料。稀土元素所具有的f電子層賦予UCP材料獨(dú)特的上轉(zhuǎn)換發(fā)光特性，即可被低能的紅外光激發(fā)并發(fā)射高能的可見光[6]。近年來，通過對(duì)UCP納米顆粒進(jìn)行表面修飾，將其與生物分子連接并進(jìn)行標(biāo)記的技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。修飾后的UCP鈉米顆粒作為生物示蹤物可完全排除生物背景熒光干擾，在檢測(cè)中具有高度的敏感性、特異性與穩(wěn)定性。因此，該技術(shù)在高通量藥物篩選與輸送、基因組學(xué)研究、光動(dòng)力學(xué)治療、組織成像、食品環(huán)境檢測(cè)以及生物戰(zhàn)劑防御等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值[7]。

2 適配體技術(shù)

適配體是一類能與靶分子形成高親和力、高特異性結(jié)合的寡核苷酸單鏈，是由指數(shù)級(jí)富集的配體進(jìn)化技術(shù)從體外篩選而得[8]。適配體與各種靶分子的結(jié)合基于單鏈核酸結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的多樣性。適配體可通過鏈內(nèi)某些互補(bǔ)堿基間的配對(duì)以及靜電、氫鍵等作用發(fā)生自身適應(yīng)性折疊，形成穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)[9]，綁定于靶分子上。因此，適配體對(duì)其靶分子顯示出高度的親和力[10]。相對(duì)于抗體和酶，適配體具有4項(xiàng)優(yōu)勢(shì)[11]。①靶分子可體外篩選且目標(biāo)范圍廣，包括：蛋白質(zhì)、細(xì)胞、致病菌、病毒、小分子物質(zhì)等。②高親和力、特異性。相對(duì)抗體來說，適配體篩選的精確度可以到甲基分子結(jié)構(gòu)中的羥基。其與靶分子形成的復(fù)合物的解離常數(shù)Kd一般都在mmol/L水平甚至可達(dá)pmol/L水平。③制備操作簡(jiǎn)單且容易修飾。適配體的尺寸比傳統(tǒng)抗體小，合成的重現(xiàn)性好。④化學(xué)穩(wěn)定性好，容易保存。

目前，已篩選出多種具有高特異性、高靶分子親和力的適配體，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、藥物研發(fā)、生物傳感等領(lǐng)域[12]。其靶標(biāo)物包括：生長因子，抗體，細(xì)胞表面受體，轉(zhuǎn)錄因子，多肽，酶，抗生素，蛋白質(zhì)，重金屬等。

適配體由于其高特異性、靈敏度、靶標(biāo)物廣泛、耗費(fèi)較少、體外合成容易以及安全穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。近年來，多項(xiàng)基于適配體的技術(shù)被開發(fā)并應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域[13]，如：納米比色技術(shù)、SPR傳感技術(shù)、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)、電化學(xué)技術(shù)以及熒光傳感技術(shù)等。這類技術(shù)的關(guān)鍵就是將適配體與納米材料結(jié)合構(gòu)建檢測(cè)平臺(tái)，如：碳納米管、磁納米顆粒、膠體金、上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒、量子點(diǎn)、石墨烯、二硫化鉬等。本文主要總結(jié)基于適配體與上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒結(jié)合的傳感技術(shù)在食品安全快速檢測(cè)中的應(yīng)用。

3 基于適配體的上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感技術(shù)在食品安全快速檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 食源性致病菌快速檢測(cè)

食源性致病菌是指在食品加工和流通過程中進(jìn)行存活代謝引起食品腐敗變質(zhì)或分泌有毒有害物質(zhì)，間接或直接致人患病的一類菌體。常見的食源性致病菌有沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡糖球菌等[14]。此類致病菌會(huì)引起人急性中毒，輕者出現(xiàn)上吐下瀉等胃腸炎癥狀，重者會(huì)造成呼吸循環(huán)、神經(jīng)等系統(tǒng)癥狀，急需相關(guān)技術(shù)加以檢測(cè)。目前,基于適配體的上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域研究逐步開展。例如，Duan等[15]合成雙色上轉(zhuǎn)換納米顆粒標(biāo)記鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的適配體，實(shí)現(xiàn)水樣本中2種目標(biāo)物的同時(shí)檢測(cè)（圖1）。2種病菌的檢測(cè)范圍分別為10～105cfu/ml（R2=0.996 4）和10～105cfu/ml（R2=0.993 6），檢出限為5 cfu/ml和8 cfu/ml。Cheng等[17]合成Mn2+摻雜的上轉(zhuǎn)換納米顆粒修飾鼠傷寒沙門氏菌適配體，發(fā)射峰在807 nm，實(shí)現(xiàn)基于共振能量轉(zhuǎn)移的金納米棒熒光猝滅，加入目標(biāo)物后熒光恢復(fù)。檢測(cè)范圍在12～5× 105cfu/ml（R2=0.99），檢出限為11 cfu/ml。Jin等[17]同樣利用上轉(zhuǎn)換納米顆粒與金納米棒之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)制建立適配體標(biāo)記待檢測(cè)物與互補(bǔ)鏈競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的生物傳感器，實(shí)現(xiàn)水和牛奶樣品中的大腸桿菌ATCC8739檢測(cè)。檢測(cè)范圍為5～106cfu/ml，檢出限為3 cfu/ml。

圖1 構(gòu)建生物功能化納米顆粒及其檢測(cè)原理

3.2 抗生素快速檢測(cè)

抗生素是能夠抑制微生物生長的化學(xué)物質(zhì)?？股爻E用于養(yǎng)殖業(yè)，用于治療或預(yù)防動(dòng)物疾病?？股卦谵r(nóng)作物、動(dòng)物性食品中均有殘留，通過食物鏈富集進(jìn)入人體，影響人體健康[18]，因此受到廣泛關(guān)注。常用抗生素檢測(cè)方法如液相、氣相及酶聯(lián)免疫法存在許多不足，急需靈敏、高效的檢測(cè)技術(shù)。如圖2所示，Liu等[19]將生物素化恩諾沙星的寡核苷酸適配體固定在上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面以捕獲恩諾沙星。當(dāng)適配體與靶標(biāo)結(jié)合發(fā)生折疊后，加入甲基丙烯酸單體形成分子印跡聚合物，洗脫后進(jìn)行二次捕獲。該傳感器可檢測(cè)魚肉樣品中的抗生素，檢測(cè)范圍0.04～0.12 ng/ml，回收率為87.05%～96.24%。

如圖3所示，Li等[20]將上轉(zhuǎn)換納米顆粒標(biāo)記的適配體通過π-π鍵作用吸附于石墨烯表面，產(chǎn)生上轉(zhuǎn)換顆粒熒光猝滅。加入待檢測(cè)物時(shí)，適配體發(fā)生構(gòu)象改變，脫離石墨烯表面，上轉(zhuǎn)換顆粒熒光恢復(fù)?；谠撛順?gòu)建了基于適配體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移傳感器，可特異性檢測(cè)卡那霉素。檢測(cè)范圍0.03～3 nmol/L，檢出限為18 pmol/L。Zhang等[21]建立了待檢測(cè)物與互補(bǔ)鏈競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合適配體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移傳感器。互補(bǔ)鏈標(biāo)記綠色熒光染料，上轉(zhuǎn)換顆粒標(biāo)記適配體，上轉(zhuǎn)換顆粒在477 nm處的發(fā)射光會(huì)被熒光染料吸收，在530 nm處出現(xiàn)熒光增強(qiáng)，加入待檢測(cè)物后，上轉(zhuǎn)換顆粒熒光恢復(fù)。該傳感器檢測(cè)范圍0.1～10 ng/ml，檢出限為0.054 ng/ml。

3.3 農(nóng)獸藥殘留快速檢測(cè)

農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法主要有色譜法、光譜分析、酶抑制法、免疫分析等，具有操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)，例如：難以保持酶活性，不能同時(shí)檢測(cè)多種農(nóng)藥殘留等[22]。目前，基于適配體的上轉(zhuǎn)換生物傳感器應(yīng)用于農(nóng)獸藥檢測(cè)的研究報(bào)道較少。Hu等[23]合成了硅殼包覆氨基化修飾的NaYF4:Yb,Ho上轉(zhuǎn)換納米顆粒，構(gòu)建了免標(biāo)記的共振能量轉(zhuǎn)移傳感器檢測(cè)啶蟲脒，具有良好的特異性，其檢測(cè)范圍50～1 000 nmol/L，檢出限為3.2 nmol/L。Guo等[24]合成了適配體修飾的Mn2+離子交換上轉(zhuǎn)換納米顆粒，構(gòu)建了電化學(xué)發(fā)光傳感器，用于檢測(cè)水樣中的雙酚A，檢測(cè)范圍0.05～100 ng/ml，檢出限為0.037 ng/ml。

3.4 生物毒素快速檢測(cè)

生物毒素是微生物的代謝產(chǎn)物，具有較強(qiáng)毒性，大多數(shù)有致癌、致畸、致突變作用。準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)是預(yù)防毒素通過食物鏈進(jìn)入人體必不可少的手段。篩選出的適配體可以以多種生物毒素為靶標(biāo)，包括：蓖麻毒素，霍亂毒素，金黃色葡萄球菌毒素，赭曲霉和相思子毒素等[25-27]。

圖2 適配體上轉(zhuǎn)換分子印跡聚合物制備、識(shí)別及其檢測(cè)原理

圖3 石墨烯上轉(zhuǎn)換共振能量轉(zhuǎn)移傳感器的構(gòu)建及其檢測(cè)原理

如圖4，Wu等[28-29]建立了核酸外切酶催化循環(huán)信號(hào)放大機(jī)制的適配標(biāo)記的上轉(zhuǎn)換納米顆粒和熒光素共振能量轉(zhuǎn)移傳感器，可特異性檢測(cè)牛奶中的葡萄球菌腸毒素B，具有較高的靈敏度，檢測(cè)范圍0.001～1 ng/ml，檢出限為0.3 pg/ml；此外，將Fe3O4磁性納米顆粒的快速磁分離特性應(yīng)用到傳感器的構(gòu)建，研發(fā)了上轉(zhuǎn)換熒光磁分離適配體傳感檢測(cè)玉米中的赭曲霉毒素A，檢測(cè)范圍0.1 pg/ml～1 ng/ml；隨著研究深入，利用“發(fā)夾”分子信標(biāo)5'端上的巰基與金納米顆粒連接，將3'端上的氨基與氨基化的上轉(zhuǎn)換納米顆粒連接，構(gòu)建了金顆粒-分子信標(biāo)-上轉(zhuǎn)換顆粒復(fù)合物共振能量轉(zhuǎn)移傳感器檢測(cè)伏馬菌毒素B1，檢出限為0.01 ng/ml，該方法對(duì)15份玉米樣本進(jìn)行檢測(cè)，將結(jié)果與傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附法比較，并進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)試，證實(shí)該方法高具有特異性且準(zhǔn)確、可靠。如圖5所示，Lv等[30]將新興納米材料二硫化鉬作為能量受體吸收上轉(zhuǎn)換熒光，構(gòu)建共振能量轉(zhuǎn)移傳感器，檢測(cè)水中的微囊藻毒素，檢測(cè)范圍在0.01～50 ng/ml，檢出限為0.002 ng/ml。

圖4 酶催化循環(huán)放大信號(hào)的適配體共振能量轉(zhuǎn)移傳感器原理

圖5 二硫化鉬-上轉(zhuǎn)換傳感器原理

3.5 重金屬快速檢測(cè)

重金屬是指密度＞5 g/cm3的金屬，約有45種，如：汞、銅、鉛、鎘、鐵、鋅、錳、鈣、鉻等。從食品安全方面考慮，最需關(guān)注的是汞、鎘、鉛、鉻，以及類金屬砷等物質(zhì)。工業(yè)排放大量重金屬物質(zhì)污染水、空氣、土壤，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染[31-33]。這些物質(zhì)會(huì)在農(nóng)作物、水產(chǎn)品和其他食品中富集，通過食物鏈進(jìn)入人體，引起急性或慢性的食品中毒，危害健康。近些年發(fā)展了一些快速重金屬檢測(cè)方法，如：酶分析法、試紙法、免疫分析法等，但與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，這類檢測(cè)方法只能對(duì)被檢物進(jìn)行定性或半定量檢測(cè)，且靈敏度和準(zhǔn)確性較低[34-36]。急需用于食品中重金屬快速檢測(cè)的新技術(shù)。如圖6所示，Chen等[37]合成了980 nm激發(fā)、804 nm發(fā)射的摻雜Tm3+的上轉(zhuǎn)換納米顆粒及在806 nm處有吸收峰的金納米棒；將Hg2+的適配體修飾氨基，互補(bǔ)鏈修飾巰基，分別標(biāo)記到上轉(zhuǎn)稱鈉米顆粒和金鈉米棒上；形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)促使2種顆粒距離拉近，引起熒光猝滅?；谝陨显順?gòu)建了熒光共振能量轉(zhuǎn)移適配體傳感器，可檢測(cè)飲用水、湖水及血樣中的Hg2+殘留，檢測(cè)范圍5～100 nmol/L，檢出限為2 nmol/L。利用相同原理，Wu等[38]建立了可同時(shí)檢測(cè)魚、蝦中的Hg2+、Pb2+重金屬殘留的適配體共振能量轉(zhuǎn)移傳感器，檢測(cè)范圍分別為0.5～500 nmol/L、0.1～100 nmol/L，檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)范圍較寬。

圖6 T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的金棒-上轉(zhuǎn)換共振能量轉(zhuǎn)移傳感器原理

4 問題與展望

綜上所述，基于適配體的上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感技術(shù)在食品安全快速檢測(cè)中雖得到了廣泛的應(yīng)用，但該技術(shù)目前仍然存在許多不足之處，亟待改進(jìn)。其主要有：①食品中有機(jī)染料、食物過敏源等靶標(biāo)物的適配體篩選尚無相關(guān)報(bào)道。其原因主要為食品污染物大部分屬于小分子物質(zhì)，篩選困難、周期長、親和力和特異性不高等缺點(diǎn)限制了適配體技術(shù)在食品中小分子污染物快速檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。②目前，與適配體技術(shù)結(jié)合應(yīng)用最多的是基于上轉(zhuǎn)換的熒光共振能量轉(zhuǎn)移傳感器構(gòu)建。但液相熒光猝滅機(jī)制的發(fā)生條件嚴(yán)格且需要專業(yè)的檢測(cè)設(shè)備，不易現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)督篩查攜帶。③傳感器檢測(cè)樣品不能多通道同時(shí)多靶標(biāo)快速檢測(cè)且樣品前處理復(fù)雜，導(dǎo)致檢測(cè)效率較低。針對(duì)上述問題，未來的研究方向應(yīng)該集中于以下幾個(gè)方面：①簡(jiǎn)單、高效的小分子物質(zhì)體外篩選技術(shù)的研究。②便攜式快速定量檢測(cè)試劑盒以及配套設(shè)備的研發(fā)。③將適配體上轉(zhuǎn)換技術(shù)與其他新興納米材料、酶等結(jié)合探索免標(biāo)記可視化的檢測(cè)技術(shù)?？傊?，適配體技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景。

利益沖突無

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Application of aptamer-based upconverting phosphor biosensing technology in rapid detection for food safety

Ren Shuyue,Li Qiaofeng,Gao Zhixian
Institute of Health and Environment Medicine,Military Medical Sciences,Tianjin Key Laboratory of Risk Assessment and Control Technology for Environment and Food Safety,Tianjin 300050,China(Ren SY,Gao ZX);School of Public Health,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China(Li QF)

The rapid detection technology in food safety plays a vital role in the field of preventive medicine. The traditional physical and chemical detection methods have some limitations,such as costly,difficult to operate and high requirements on environment,can not meet the needs of quality and safety on-site rapid screening,and are gradually replaced by emerging sensor detection technologies.The aptamer-upconversion biosensor technology is a novel rapid detection technology,which is based on the combination of functionalized upconversion nanomaterials and aptamer technology.Compared with the traditional immunofluorescence technology,it has advantages in sensitivity,specificity and stability,and is widely used in rapid detection.In this paper,the upconversion luminescence and aptamer technologies were briefly introduced,and the aptamer-based upconverting phosphor biosensing technology and its application in rapid detection of food safety were summarized.Based on the current research status,the bottleneck and the future development trend of this technology were analyzed,which provides a reference for the application of this technology in food safety and other fields.

Aptamer;Upconverting phosphor;Biosensors;Food safety;Rapid detection

Gao Zhixian,E-mail:gaozhx@163.com

國家自然科學(xué)基金（21477162）；天津市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（14ZCZDSF0021）

2016-10-10）

高志賢，Email:gaozhx@163.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．06．010