不同OTUs劃分閾值對(duì)湖泊浮游細(xì)菌α多樣性的影響

沈　烽,黃　睿，王司辰,曹新益,趙大勇

(1.河海大學(xué) 水文水資源與水利工程科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210098；

2.河海大學(xué)水文水資源學(xué)院，江蘇 南京 210098)

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不同OTUs劃分閾值對(duì)湖泊浮游細(xì)菌α多樣性的影響

沈烽1,2,黃睿1,2，王司辰1,2,曹新益1,2,趙大勇1,2

(1.河海大學(xué) 水文水資源與水利工程科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210098；

2.河海大學(xué)水文水資源學(xué)院，江蘇 南京 210098)

摘要：微生物研究中，湖泊浮游細(xì)菌微生物群落的α多樣性通過(guò)OTUs(operation taxonomy units)來(lái)分析評(píng)價(jià)?？疾炝爽F(xiàn)有手段下不同OTUs劃分閾值或分類單元“屬”水平對(duì)α多樣性大小和趨勢(shì)的影響，并推斷了分類單元“屬”所對(duì)應(yīng)的OTUs劃分閾值。通過(guò)454高通量測(cè)序技術(shù)研究了南京莫愁湖、前湖、玄武湖、紫霞湖4個(gè)湖泊的浮游細(xì)菌微生物群落，探討了不同OTUs劃分閾值對(duì)α多樣性指數(shù)OTUs、Chao1、Invsimpson、Shannon的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OTUs劃分閾值不同，OTUs和Chao1指數(shù)變化一致，Invsimpson和Shannon指數(shù)變化一致；在不同的OTUs劃分閾值下，4個(gè)湖泊的OTUs和Chao1指數(shù)在不同季節(jié)的排序基本保持不變，Invsimpson和Shannon指數(shù)在不同季節(jié)的排序發(fā)生改變。表明，分類單元“屬”所對(duì)應(yīng)的OTUs劃分閾值在0.06～0.08范圍內(nèi)；原有的以0.03或0.1閾值劃分OTUs來(lái)分析α多樣性是合理的；所用的分析微生物群落α多樣性方法是全面的、可靠的。

關(guān)鍵詞：α多樣性；高通量序列；OTUs；浮游細(xì)菌；16S rRNA

對(duì)細(xì)菌“種”的科學(xué)且合理的定義有助于微生物學(xué)者準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)微生物多樣性時(shí)空分布特征。細(xì)菌本身的特點(diǎn)(如頻繁的基因水平轉(zhuǎn)移)使得其基因組存在著高度的動(dòng)態(tài)變化，導(dǎo)致對(duì)細(xì)菌“種”的定義存在著巨大困難。目前關(guān)于微生物多樣性的大部分研究依賴于16SrRNA基因序列的相似性來(lái)解釋。通過(guò)比較序列與群落中其它未知序列間的相似性,將序列分成不同的操作性分類單元(OTUs)[2-3]。由于微生物類群之間rDNA/rRNA(細(xì)菌用16S，真菌主要用ITS)的變異速率不同，僅用16SrRNA基因序列的相似性來(lái)定義細(xì)菌的分類單元存在很大弊端[3-4]，受研究方法的限制，目前常取閾值0.03或者0.1的16SrRNA基因序列差異性來(lái)劃分OTUs[5]。

通過(guò)計(jì)算基于OTUs表或者種系型(種類和相對(duì)豐度)的細(xì)菌α多樣性可描述細(xì)菌的多樣性。其中，用于表征α多樣性的指數(shù)有2大類：

1)計(jì)算菌群豐度(communityrichness)的指數(shù)

(1)OTUs指數(shù)：樣品種OTUs的數(shù)量。

(2)Chao1指數(shù)：在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)，是用Chao1算法估計(jì)群落中含OTUs數(shù)目的指數(shù)，由Chao于1984年最早提出。按下式計(jì)算：

式中：Sobs為實(shí)際測(cè)量的OTUs數(shù)目；n1為只含有1條序列的OTUs數(shù)目；n2為只含有2條序列的OTUs數(shù)目。

OTUs和Chao1指數(shù)反映了微生物群落在數(shù)量上的大小程度。

2)計(jì)算菌群多樣性(community diversity)的指數(shù)

(1)Invsimpson指數(shù)： Simpson指數(shù)的倒數(shù)，由Edward Hugh Simpson 于1949年提出，在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)定量描述一個(gè)區(qū)域的生物多樣性。Invsimpson指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。按下式計(jì)算：

式中：ni為含有i條序列的OTUs數(shù)目；N為所有的序列數(shù)。

(2)Shannon指數(shù)：Shannon指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。按下式計(jì)算：

Invsimpson指數(shù)和Shannon指數(shù)反映了微生物群落在數(shù)量結(jié)構(gòu)上的分布特點(diǎn)。

不同的OTUs劃分閾值對(duì)α多樣性指數(shù)影響較大，閾值0.03或0.1的選取也存在較大的爭(zhēng)議[6-8]。Cleary等[9]探討了不同的OTUs劃分閾值對(duì)β多樣性指數(shù)的影響。但全面探討OTUs劃分閾值對(duì)α多樣性的影響較少。鑒于此，作者通過(guò)454高通量測(cè)序技術(shù)研究了南京莫愁湖、前湖、玄武湖、紫霞湖4個(gè)湖泊的浮游細(xì)菌微生物群落，探討了不同的OTUs劃分閾值對(duì)α多樣性指數(shù)的影響，以期用更合理的方法來(lái)闡明微生物群落的α多樣性。

1實(shí)驗(yàn)

1.1樣品采集

取南京莫愁湖、前湖、玄武湖、紫霞湖4個(gè)湖泊0.5 m深水樣，從2011年11月到2012年1月在春夏秋冬4個(gè)季節(jié)各采集一次。

1.2DNA提取、PCR擴(kuò)增和焦磷酸測(cè)序

用5 μm過(guò)濾器過(guò)濾水樣，去除懸浮顆粒物；用0.22 μm乙酸纖維素濾網(wǎng)過(guò)濾濾液，收集浮游細(xì)菌細(xì)胞；按Gillan的方法[10]提取DNA。

將純化后的基因組DNA作為PCR模板，采用通用引物533R(5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′)和27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)對(duì)細(xì)菌的16S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR引物上固定一個(gè)10 bp長(zhǎng)度的barcode，用于區(qū)分不同的樣品。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10 μL 5×Prime STAR buffer(plus Mg2+)，0.2 mmol·L-1dNTPs，0.4 μmol·L-1上下游引物，2.0 U TaKaRa酶，加ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，24個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，然后充分混合。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用AxyPrep DNA試劑盒(杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)股份有限公司)純化。

PCR擴(kuò)增結(jié)果送至上海美吉公司在羅氏454FLX Titanium平臺(tái)上測(cè)序。本研究所有的測(cè)序結(jié)果均被上傳到美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，檢索號(hào)為SRP064272。

1.3序列處理

序列處理通過(guò)Mothur軟件包完成，流程如下：序列結(jié)果通過(guò)454標(biāo)準(zhǔn)化操作(SOP)完成。下機(jī)原始高通量數(shù)據(jù)，通過(guò)降噪和修剪[11]后，刪除低質(zhì)量(平均質(zhì)量<27)、較短(<200 bp)的不包含引物和barcode的序列，并刪除單一堿基連續(xù)出現(xiàn)8次以上的序列[12]。剩余序列被反轉(zhuǎn)并通過(guò)NAST算法與已知 SILVA 16S rRNA 基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)齊[13]。使用Mothur中“chimera.uchime”命令去除嵌合體，“pre.cluster”被用來(lái)整理數(shù)據(jù)加速距離計(jì)算過(guò)程[14]。得到的序列與RDP 16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分類(http://rdp.cme.msu.edu)，相似度達(dá)80%以上的結(jié)果才允許被使用[15]。采用furthest-neighbor算法[16]用不同的閾值劃分OTUs，在序列差異0.5%～15.0%范圍內(nèi)每間隔0.5%劃分OTUs。統(tǒng)一數(shù)量差異水平并獲得同一比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，在計(jì)算α多樣性指數(shù)前先對(duì)每一個(gè)樣品使用“subsample”命令進(jìn)行隨機(jī)取樣，保證每個(gè)樣品具有相同的測(cè)序深度。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

α多樣性指數(shù)(OTUs、Chao1、Invsimpson、Shannon)通過(guò)Mothur中“summary.single”命令計(jì)算得到。微生物屬熱圖通過(guò)R語(yǔ)言中“ggplot2”包計(jì)算得到。

2結(jié)果與討論

2.1屬水平上微生物α多樣性分析

將得到的序列和RDP 16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到了每一條序列所對(duì)應(yīng)的分類學(xué)屬(genus)的水平。由于部分序列并不能通過(guò)比對(duì)得到所對(duì)應(yīng)的屬水平，在分析時(shí)并未被考慮。每個(gè)樣品中屬水平已分類的序列占總序列的百分比見(jiàn)表1。通過(guò)統(tǒng)計(jì)每一個(gè)屬在每個(gè)樣品所占比例繪制的微生物屬熱圖見(jiàn)圖1。

表1屬水平已分類的序列占總序列的百分比/%

Tab.1　Relative percent of classified sequences

注：每個(gè)樣品中排名前八的屬被表示出來(lái)。顏色深淺表示每個(gè)屬在一個(gè)樣品中的相對(duì)百分比。

由圖1可看出，4個(gè)湖泊在屬水平上，藍(lán)藻門細(xì)菌占主要。高比例的藍(lán)藻直接決定了4個(gè)湖泊微生物多樣性的高低。春、冬季，低比例的藍(lán)藻使得微生物多樣性較高；夏、秋季，高比例的藍(lán)藻使得微生物多樣性較低。

屬水平上不同湖泊在不同季節(jié)的微生物α多樣性指數(shù)(Invsimpson、Shannon)見(jiàn)表2。

表2屬水平上的微生物α多樣性指數(shù)

Tab.2　α-Diversity indexes of microorganisms on

由表2可看出，屬水平上Invsimpson指數(shù)與Shannon指數(shù)是高度一致的，Spearman相關(guān)系數(shù)R=0.947(P<0.001)，說(shuō)明這2個(gè)α多樣性指數(shù)在屬水平上的評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致?？梢源笾碌玫綄偎缴?個(gè)湖泊在不同季節(jié)的微生物α多樣性表現(xiàn)為：莫愁湖：冬>夏≈秋>春；玄武湖：春≈冬>秋≈夏；前湖：冬>春>秋>夏；紫霞湖：冬≈秋>春>夏。

2.2不同OTUs劃分閾值α多樣性分析

在0.5%～15.0%范圍內(nèi)，每間隔0.5%的步長(zhǎng)劃分OTUs，每個(gè)樣品得到了30張OTUs表。然后計(jì)算每一張表中每一個(gè)樣品的α多樣性指數(shù)。不同OTUs劃分閾值所對(duì)應(yīng)的α多樣性指數(shù)(OTUs、Chao1、Invsimpson、Shannon)見(jiàn)圖2。

圖2　不同OTUs劃分閾值所對(duì)應(yīng)的OTUs指數(shù)(a)、Chao1指數(shù)(b)、Invsimpson指數(shù)(c)、Shannon指數(shù)(d)

由圖2a可知，隨劃分閾值的遞進(jìn)，4個(gè)湖泊在不同季節(jié)的OTUs指數(shù)逐漸降低，且遞減趨勢(shì)保持一致，曲線基本沒(méi)有出現(xiàn)交叉的情況，即OTUs指數(shù)在不同季節(jié)的差異并未隨劃分閾值的不同而發(fā)生明顯改變，說(shuō)明，無(wú)論選取何種閾值來(lái)劃分OTUs，4個(gè)湖泊的OTUs指數(shù)在不同季節(jié)的排序基本一致，即：莫愁湖：夏>秋≈春>冬；前湖：夏>春>冬>秋；玄武湖：冬>春>夏>秋；紫霞湖：春>夏>秋≈冬。

圖2b與圖2a的結(jié)果基本一致，但圖2b中線條之間的交叉明顯多于圖2a，在區(qū)分物種α多樣性時(shí)存在明顯的不足。在Chao1指數(shù)差異較小時(shí)，如莫愁湖的四季、前湖的春秋冬季、玄武湖的春秋冬季，曲線交叉重疊，無(wú)法準(zhǔn)確判斷。

圖2c、2d與圖2a、2b有明顯差異，線條出現(xiàn)交叉。在Invsimpson指數(shù)中，莫愁湖在劃分閾值約為0.06時(shí)夏、秋線與冬季線交叉，約0.08時(shí)夏、秋線與春季線重合；前湖在劃分閾值為0.06左右時(shí)夏季線與冬季線交叉，約0.08時(shí)夏季線與春、秋線交叉。也就是說(shuō)，莫愁湖微生物群落Invsimpson指數(shù)在不同季節(jié)的排序表現(xiàn)為：當(dāng)劃分閾值<0.06時(shí)，秋>夏>冬>春；當(dāng)0.06<劃分閾值<0.08時(shí)，冬>夏≈秋>春；當(dāng)劃分閾值>0.08時(shí)，冬>夏≈秋≈春。同樣，前湖數(shù)據(jù)中也存在這樣的問(wèn)題。可以看出，不同的劃分閾值得到的樣品微生物群落Invsimpson指數(shù)高低是不同的。而且圖2d與圖2c存在明顯的一致性。

2.3討論

由于很多序列目前還無(wú)法準(zhǔn)確分類到屬的水平，因此，按照屬水平上的α多樣性指數(shù)分析也存在一些缺陷。目前，對(duì)序列分析時(shí)常常會(huì)劃分OTUs，0.03和0.1差異是常用的劃分標(biāo)準(zhǔn)，大致對(duì)應(yīng)科(family)和種(species)的分類學(xué)水平。但是由于不同的微生物類群之間rDNA/rRNA的變異速率是不同的，因此這樣的分類也存在一定的缺陷。本研究從不同的角度來(lái)探討南京莫愁湖、前湖、玄武湖、紫霞湖4個(gè)湖泊在不同季節(jié)微生物群落α多樣性的變化，發(fā)現(xiàn)不同角度得出的結(jié)論是不同的。

1)OTUs和Chao1指數(shù)得出的結(jié)果基本一致，而Invsimpson與Shannon指數(shù)得出的結(jié)果也基本一致，這與它們屬于不同的α多樣性指數(shù)類別相關(guān)。OTUs和Chao1指數(shù)屬于計(jì)算菌群豐度的指數(shù)，而Invsimpson與Shannon指數(shù)屬于計(jì)算菌群多樣性的指數(shù)。本研究中4個(gè)湖泊不同季節(jié)OTUs和Chao1指數(shù)隨著OTUs劃分閾值的遞進(jìn)，曲線不會(huì)出現(xiàn)交叉，表明劃分閾值不會(huì)影響4個(gè)湖泊菌群豐度在不同季節(jié)的排序；而Invsimpson與Shannon指數(shù)隨著劃分閾值的遞進(jìn)，曲線出現(xiàn)交叉，表明劃分閾值會(huì)影響菌群α多樣性指數(shù)在不同季節(jié)的排序。

2)微生物群落組成差異較大時(shí)，可以得出基本一致的結(jié)論，如玄武湖：冬≈春>夏≈秋；但是當(dāng)微生物群落組成差異較小時(shí)，得出的結(jié)論是不同的。比如，在屬水平上前湖浮游細(xì)菌微生物群落α多樣性：冬>春>秋>夏；從Invsimpson指數(shù)來(lái)看，當(dāng)劃分閾值<0.06時(shí)：夏>冬>春>秋，當(dāng)0.06<劃分閾值<0.08時(shí)：冬>夏>春≈秋，當(dāng)劃分閾值>0.08時(shí)：冬>春>秋>夏。這些結(jié)果似乎是互相矛盾的，因此，如果僅僅從一個(gè)方面來(lái)分析微生物群落的α多樣性都是片面的，不能很好地解釋樣品的微生物群落組成多樣性。

3)由表1可看出，在目前的技術(shù)下，依然無(wú)法準(zhǔn)確判定大量的序列所對(duì)應(yīng)的屬水平，因此相較于樣品之間已知屬水平分類的序列占總序列的百分比相差很大時(shí)得出的結(jié)論的可靠性較低。本研究中發(fā)現(xiàn)莫愁湖已知屬水平分類的序列占總序列的百分比在不同季節(jié)相差較小，在50%～60%之間，因此可以認(rèn)為得到的不同季節(jié)在屬水平微生物多樣性是相對(duì)可靠的。屬水平上莫愁湖在不同季節(jié)微生物多樣性表現(xiàn)為：冬>夏≈秋>春，對(duì)比圖2c、2d發(fā)現(xiàn)，在劃分閾值大約在0.06～0.08時(shí)也有冬>夏≈秋>春，由此可以初步推斷屬水平所對(duì)應(yīng)的OTUs劃分閾值可能在0.06～0.08范圍內(nèi)。

4)一張圖中α多樣性指數(shù)曲線交叉點(diǎn)一般都出現(xiàn)在0.04～0.09，這表明OTUs劃分閾值在一定區(qū)域內(nèi)時(shí)對(duì)微生物α多樣性影響很大，然而在這個(gè)區(qū)域外(<0.04或>0.09)對(duì)微生物α多樣性的影響較小。因此，取劃分閾值為0.03(< 0.04)和0.1(> 0.09)來(lái)劃分是比較合理的。當(dāng)α多樣性指數(shù)出現(xiàn)交叉時(shí)，可以認(rèn)為在不同的微生物分類學(xué)上的α多樣性是不同的。比如，前湖Invsimpson指數(shù)在種的水平上：夏>冬>春>秋；然而在科的水平上：冬>春>秋>夏。

3結(jié)論

從多個(gè)方面探討了南京莫愁湖、前湖、玄武湖、紫霞湖等4個(gè)湖泊浮游細(xì)菌群落的α多樣性。通過(guò)比較OTUs劃分閾值與α多樣性指數(shù)曲線，從不同的分類學(xué)等級(jí)上研究了細(xì)菌群落的α多樣性，為更好地理解微生物群落組成和α多樣性奠定了基礎(chǔ)。

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Effects of Different OTUs Cutoff Values onα-Diversity of Bacterioplankton in Lake

SHEN Feng1,2,HUANG Rui1,2,WANG Si-chen1,2,CAO Xin-yi1,2,ZHAO Da-yong1,2

(1.StateKeyLaboratoryofHydrology-WaterResourcesandHydraulicEngineering,HohaiUniversity,Nanjing210098，China；2.CollegeofHydrologyandWaterResources,HohaiUniversity,Nanjing210098,China)

Abstract：The α-diversity of bacterioplankton community in lake is generally evaluated based on OTUs (operation taxonomy units).This study investigated the effects of different OTUs cutoff values or genus level on α-diversity and detected the approximation of OTUs cutoff values which was corresponding to taxonomic level of genera for bacteria.By 454 high-throughput sequencing technology,the bacterioplankton communities of Mochou Lake,Qian Lake,Xuanwu Lake,and Zixia Lake in Nanjing city were studied.Different OTUs cutoff values were assumed to explore the variation of OTUs,Chao1,Invsimpson,Shannon indexes.Results showed that,OTUs and Chao1 indexes showed a consistent change with the variation of OTUs cutoff values,while Invsimpson and Shannon indexes showed a consistent change.Along with the distribution of OTUs cutoff values,OTUs and Chao1 indexes of four lakes remained monotonous compared to each other in different seasons,whereas the results of Invsimpson and Shannon indexes differed with fluctuated values.The taxonomic level of genera was roughly corresponding to differentiation threshold of 0.06～0.08.The well-known thresholds of 0.03 or 0.1 as cutoffs to analyze microbial sequence α-diversity was reasonable.Method for analyzing α-diversity of the microbial community was comprehensive and reliable.

Keywords：α-diversity;high-throughput sequence;OTUs;bacterioplankton;16S rRNA隨著高通量測(cè)序技術(shù)的日漸流行和廣泛使用，越來(lái)越多的稀有菌種被檢測(cè)出來(lái)，這為微生物群落的深入研究提供了可能。而實(shí)際調(diào)查研究中，稀有細(xì)菌微生物的鑒定往往依賴于主觀分類水平的選取，不同的種屬劃分等級(jí)亦導(dǎo)致微生物多樣性計(jì)算結(jié)果的差異，而微生物多樣性的變化對(duì)生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的影響極大[1]。

中圖分類號(hào)：Q 93R 318

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)02-0025-06

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.02.005

作者簡(jiǎn)介：沈烽(1992-)，男，江蘇無(wú)錫人，碩士研究生，研究方向：湖泊環(huán)境微生物，E-mail：472779237@qq.com；通訊作者：趙大勇，教授，E-mail：dyzhao@hhu.edu.cn。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41371098，41571108)，江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20151614)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2015B14214，2015B31714)

收稿日期：2015-11-13