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    人臍帶間充質(zhì)干細胞對難治性免疫性血小板減少癥患者B淋巴細胞分化及分泌功能的影響

    2016-04-11 04:32:20曾玉曉徐玲瓏吳迪炯葉寶東高雁婷劉文賓周郁鴻
    關(guān)鍵詞:分泌量供者共培養(yǎng)

    曾玉曉,徐玲瓏,吳迪炯,葉寶東,高雁婷,劉文賓,周郁鴻

    (浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院血液科, 杭州 310006)

    ChinJAllergyClinImmunol,2016,10(3):207- 212

    免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)是免疫介導(dǎo)的血小板過度破壞、巨核細胞數(shù)量和質(zhì)量異常,血小板生成相對不足的自身免疫性疾病。ITP的治療,目前主要從激素、丙種球蛋白沖擊、切脾、化療等方面著手,取得了一定療效。對于難治性血小板減少癥患者,抗CD20單克隆抗體(美羅華)已成為重要的選擇手段之一,但其存在著價格昂貴,遠期療效尚有無法確定的不足。目前,已有采用間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSCs)治療ITP[1]的個案報道,但相關(guān)的實驗研究仍相對缺乏。人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)來源豐富,增殖分化能力強[2- 3]。因此,本實驗探索hUC-MSCs對難治性免疫性血小板減少癥(refractory immune thrombocytopenia,rITP)患者外周血B細胞分化及分泌功能的影響。

    資料與方法

    病例來源

    病例資料為2012年6月至2013年10月本院rITP患者26例,男性10例,女性16例,中位年齡44(12~68)歲。健康供者6例,男性4例,女性2例,中位年齡28(21~40)歲。

    rITP患者納入標(biāo)準(zhǔn)

    (1)脾切除后無效或復(fù)發(fā)者或依賴激素者;(2)仍需治療以降低出血的危險;(3)除外其他引起血小板減少癥的原因,確診ITP。

    hUC-MSCs的提取[4]及純度鑒定

    人臍帶由浙江省杭州市第一人民醫(yī)院提供,通過了浙江省中醫(yī)院倫理委員會倫理批準(zhǔn)。將無菌臍帶用含有青鏈霉素雙抗的PBS清洗;剝離華通氏膠,將華通氏膠剪碎至約2 mm×2 mm×2 mm大??;用0.2%的Ⅱ型膠原酶,37 ℃消化4~5 h;消化物用50目、200目濾網(wǎng)過濾,過濾液用PBS稀釋,分別以2 000 r/min×15 min、1 500 r/min×15 min、800 r/min×5 min離心,棄上清液;計數(shù),細胞以7.5×105個接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi),48 h后首次換液,細胞融合度達90%時胰酶消化,以0.5×105/L傳代培養(yǎng)。取第三代的hUC-MSCs,用CD44、CD31標(biāo)記hUC-MSCs用流式細胞儀檢測其純度。

    健康供者及rITP患者外周血B細胞的分離及共培養(yǎng)體系的建立

    用人外周血淋巴細胞分離液以密度梯度離心法分離出rITP患者及健康供者外周血單個核細胞,調(diào)整細胞數(shù)為7.5×107/L,用流式細胞儀檢測CD19標(biāo)記的細胞。胰酶消化融合度90%的hUC-MSCs細胞,調(diào)節(jié)細胞濃度為5×105個接種于培養(yǎng)皿,貼壁3 h后,分別以hUC-MSCs∶單個核細胞0.5∶10、1∶10、2∶10、4∶10、8∶10建立共培養(yǎng)體系。

    美洲商陸刺激B細胞分化及酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測抗體IgM、IgG分泌量

    將濃度分別為30、10、1 mg/L的美洲商陸(Pokeweed,PWM)加入健康供者外周血分離的單個核細胞中培養(yǎng)2、4、7 d,按酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)試劑盒說明書檢測標(biāo)準(zhǔn)品及上清液分泌抗體IgM和IgG的吸光度值(OD值),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算兩種抗體的濃度。外周血單個核細胞與hUC-MSCs共培養(yǎng)4 d,收集上清液,按ELISA試劑盒說明書檢測標(biāo)準(zhǔn)品及上清液分泌抗體IgM和IgG的OD值,計算兩種抗體的濃度。

    EnVision免疫組化法測B細胞誘導(dǎo)的成熟蛋白-1的表達

    外周血單個核細胞與hUC-MSCs共培養(yǎng)4 d,CD138標(biāo)記細胞。EnVision二步法免疫組化,檢測B細胞誘導(dǎo)的成熟蛋白- 1(B lymphocyte-induced maturation protein1,Blimp- 1)被抑制程度。陽性率(positive rate, PR)=陽性細胞數(shù)/(陰性細胞數(shù)+陽性細胞數(shù))×100%。

    計分標(biāo)準(zhǔn)[5- 6]:(1)陽性強度的判斷:按著色細胞染色強弱判斷,細胞染色呈陰性為(-);染色弱,陽性細胞呈淡黃色為(+);染色中等,陽性細胞呈棕黃色為(++);染色強,陽性細胞呈棕褐色為(+++),統(tǒng)計時分別用0、1、2和3分表示。(2) 陽性率的判斷:沒有陽性細胞的計為(-),陽性率小于25%的計為(+),陽性率介于26%~50%之間的計為(++),陽性率大于50%計為(+++),統(tǒng)計時分別用0、1、2、3分表示。

    統(tǒng)計學(xué)處理

    結(jié)  果

    流式細胞儀檢測hUC-MSCs純度和外周血單個核細胞B細胞比例

    流式細胞儀檢測第三代hUC-MSCs表面CD44和CD31表達分別為99.8%和1.6%。流式細胞儀檢測健康供者、rITP患者外周血單個核細胞CD19標(biāo)記的細胞分別為6.9%和6.2%(圖1、2)。

    B細胞分化為漿細胞分泌抗體與PWM濃度和作用時間的相關(guān)性

    PWM濃度30、10、1 mg/L,作用4 d時健康供者組IgG分泌量分別為(4.83±0.17)、(3.49±0.66)、(2.97±0.88)μg/L,分別高于同濃度第2天、第7天IgG分泌量(P均<0.01);IgM分泌量分別為(3.47±0.49)、(1.84±0.46)、(1.67±0.65)μg/L,高于同濃度第2天、第7天IgM分泌量(P均<0.01)(圖3),因此以PWM為30 mg/L、4 d作為PWM刺激B細胞的濃度和時間。該刺激條件下rITP患者組IgG分泌量為(7.39±1.42)μg/L,高于健康供者組(P=0.014);rITP患者組IgM分泌量為(5.44±0.17)μg/L,高于健康供者組(P=0.039)(表1)。選用PWM濃度為30 mg/L,作用時間4 d進行下一步實驗。

    圖1hUC-MSCs純度鑒定

    Fig1hUC-MSCs’ purity identification

    hUC-MSCs:人臍帶間充質(zhì)干細胞;CD44標(biāo)記的hUC-MSCs細胞占99.8%;CD31標(biāo)記的hUC-MSCs細胞占1.6%

    hUC-MSCs抑制抗體IgG、IgM的分泌

    hUC-MSCs和rITP患者外周血單個核細胞以2∶10共培養(yǎng)時,rITP患者IgG、IgM分泌量分別是(4.98±1.63)和(3.78±0.82)μg/L,明顯低于無hUC-MSCs時IgG、IgM分泌量(P=0.005、0.003)。此比例時rITP患者組IgG、IgM分泌量和健康供者組無明顯差異(P=0.266、0.543)(表2)。

    hUC-MSCs抑制Blimp- 1蛋白的表達

    rITP患者CD138標(biāo)記細胞陽性率即Blimp- 1蛋白表達率在hUC-MSCs∶單個核細胞為2∶10時為33.51%,較無hUC-MSCs時明顯下降(P=0.026),與健康供者組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.076)(圖4)。

    圖2外周血CD19標(biāo)記的細胞百分比

    Fig2CD19 marked peripheral blood mononuclear cells

    rITP:難治性免疫性血小板減少癥;健康供者組外周血CD19標(biāo)記細胞為6.9%; rITP患者組外周血CD19標(biāo)記細胞為6.2%

    圖3健康供者外周血在不同PWM濃度及不同作用時間時IgG、IgM分泌量

    Fig3IgG and IgM secretion levels of healthy donors with different PWM concentration and work time

    PWM:美洲商陸

    表1不同PWM濃度時健康供者組及rITP患者組IgG、IgM的分泌量
    Table1IgG and IgM secretion levels of healthy donors and rITP patients with different PWM concentration

    PWM(mg/L)健康供者rITP患者IgGIgMIgGIgM 1   297±088△   167±065△   465±087△   276±112△10   349±066#   184±046△   497±067△   259±053△30   483±017   347±049   739±142?   544±017?

    PWM:美洲商陸;rITP:難治性免疫性血小板減少癥;與健康供者比較,*P<0.01;與PWM 30 mg/L比較,#P<0.05,△P<0.01

    表2rITP患者外周血單個核細胞與hUC-MSCs不同比例及無hUC-MSCs時IgG、IgM分泌量
    Table2IgG and IgM secretion levels of rITP patients with no-hUC-MSCs and PBMCs co-cultured with hUC-MSCs in different ratio

    hUC?MSCs:PBMCIgGIgM無hUC?MSCs  739±142  544±01705∶10  724±144  564±0961∶10  670±061  528±1052∶10  498±163?  378±082?4∶10  680±187  533±0708∶10  707±112  603±116

    rITP:難治性免疫性血小板減少癥;hUC-MSCs:人臍帶間充質(zhì)干細胞;PBMC:外周血單個核細胞;與無hUC-MSCs比較,*P<0.01

    圖4 健康供者組、rITP患者組無hUC-MSCs、外周血單個核細胞與hUC-MSCs不同比例時Blimp- 1蛋白表達率Fig 4 Blimp- 1 protein expression of healthy donors,no-hUC-MSCs and PBMCs co-cultured with hUC-MSCs in different ratio of rITP patientsrITP:難治性免疫性血小板減少癥;hUC-MSCs:人臍帶間充質(zhì)干細胞;Blimp- 1:B細胞誘導(dǎo)的成熟蛋白- 1; PBMC:外周血單個核細胞

    討  論

    MSCs是全能干細胞,可以從骨髓、臍帶、脂肪等組織中提取,有自我更新、分化的能力。有易于分離提取、特異性表面標(biāo)記、可分化為多種細胞具有免疫調(diào)節(jié)、遷移等特性,因此MSCs可用于治療再生障礙性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病。MSCs具有調(diào)節(jié)T細胞、B細胞、單核巨噬細胞等免疫細胞的功能[7]。目前認為MSCs通過可溶性因子[8]、白細胞介素10(interleukin- 10, IL- 10)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)[9]、γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)等調(diào)節(jié)T細胞的活化增殖。MSCs使B 細胞停滯在G0/G1期、改變B細胞胞外激酶和p38促分裂原活化蛋白的激發(fā)模式[10],使B 細胞不能增殖分化為漿細胞,從而減少IgG、IgM、IgA的分泌。我們的實驗中,hUC-MSCs高表達CD44,不表達CD31,與骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)相同,而且hUC-MSCs比其他組織來源的MSCs更原始,更具有增殖分化能力。本實驗發(fā)現(xiàn)在hUC-MSCs∶單個核細胞為2∶10時IgG、IgM分泌量較無hUC-MSCs時明顯減少,與相關(guān)文獻[11]一致。說明hUC-MSCs可以抑制B細胞分化為漿細胞。

    Blimp- 1是由prdm1基因編碼的轉(zhuǎn)錄抑制因子,可以誘導(dǎo)成熟B淋巴細胞發(fā)育為漿細胞,被稱作“B淋巴細胞終極分化的主調(diào)控子”。成熟B淋巴細胞分化為漿細胞需多個轉(zhuǎn)錄因子共同參與,其中PAX5、BCL- 6、MITF、MTA3、BACH2參與B細胞分化,Blimp、XBP- 1、IRF- 4參與漿細胞分化。Asari等[12]認為將B細胞和MSCs共培養(yǎng)可抑制Blimp- 1 mRNA的表達,本實驗也證明hUC-MSCs和B 細胞共培養(yǎng),Blimp- 1蛋白表達下降,從而減少B細胞向漿細胞分化。

    本實驗中,hUC-MSCs對IgG、IgM及Blimp- 1蛋白的抑制程度,并不和其濃度成正比,這和Bertolo等[13]的實驗相似,Bertolo等在體外將人MSCs和人椎間盤組織共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)人MSCs 50 000個/孔時對IgG的抑制率反而低于人MSCs為10 000/孔時的抑制率。有學(xué)者認為人MSCs對B細胞的活性無影響,但抑制B細胞的增殖,使其停滯在G0/G1期[11]。本研究未進行B細胞增殖相關(guān)的實驗,對于hUC-MSCs是否使B細胞停滯于細胞周期某一時期還有待進一步研究。

    綜上,本實驗結(jié)果表明hUC-MSCs可以抑制Blimp- 1蛋白從而抑制rITP患者外周血B細胞向漿細胞分化,減少IgG、IgM的分泌,為臨床骨髓移植治療rITP提供一定的實驗依據(jù),但其他作用機制及臨床治療劑量仍需探索。

    [1]Fang B, Song YP, Li N, et al. Resolution of refractory chronic autoimmune thrombocytopenic purpura following mesenchymal stem cell transplantation: a case report[J]. Transplant Proc, 2009,41:1827- 1830.

    [2]Wu LF, Wang NN,Liu YS,et al. Differentiation of Wharton’s jelly primitive stromal cells into insulin-producing cells in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Tissue Eng Part A, 2009,15:2865- 2873.

    [3]Can A, Karahuseyinoglu S. Concise review: human umbilical cord stroma with regard to the source of fetus-derived stem cells[J]. Stem Cells,2007,25: 2886- 2895.

    [4]Seshareddy K, Troyer D, Weiss ML. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton’s Jelly of umbilical cord[J]. Methods Cell Biol, 2008,86:101- 119.

    [5]馬大烈, 白辰光. 免疫組織化學(xué)陽性標(biāo)記結(jié)果的觀察和判斷[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2003, 19: 557- 559.

    [6]Fields AC, Cotsonis G, Sexton D, et al. Survivin expression in hepatocellular carcinoma: correlation with proliferation, prognostic parameters, and outcome[J].Mod Pathol, 2004,17:1378- 1385.

    [7]Gieseke F, Kruchen A, Tzaribachev N,et al. Proinflammatory stimuli induce galectin- 9 in human mesenchymal stromal cells to suppress T-cell proliferation[J]. Eur J Immunol,2013,43:2741- 2749.

    [8]Duffy MM, Ritter T, Ceredig R,et al. Mesenchymal stem cell eff ects on T-cell eff ector Pathways[J]. Stem Cell Res Ther,2011,2:34.

    [9]Nasef A, Chapel A, Mazurier C,et al. Identification of IL- 10 and TGF-beta transcripts involved in the inhibition of T-lymphocyte proliferation during cell contact with human mesenchymal stem cells[J]. Gene Expr, 2007,13:217- 226.

    [10] Tabera S, Pérez-Simón JA, Díez-Campelo M,et al. The effect of mesenchymal stem cells on the viability,proliferation and differentiation of B-lymphocytes[J]. Haematologica,2008, 93:1301- 1309.

    [11] Corcione A, Benvenuto F, Ferretti E, et al. Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions[J].Blood, 2006,107: 367- 372.

    [12] Asari S, Itakura S, Ferreri K, et al. Mesenchymal stem cells suppress B cell terminal differentiation[J]. Exp Hematol, 2009,37: 604- 615.

    [13] Bertolo A, Thiede T, Aebli N,et al.Human mesenchymal stem cell co-culture modulates the immunological properties of human intervertebral disc tissue fragmentsinvitro[J]. Eur Spine J,2011, 20:592- 603.

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