電針大腸俞募穴對功能性便秘小鼠結(jié)腸內(nèi)GDNFmRNA、RaimRNA表達影響的研究*

張 微，李 瑛，劉麗莎，羅芳麗，趙中亭

(成都中醫(yī)藥大學，成都 610072)

電針大腸俞募穴對功能性便秘小鼠結(jié)腸內(nèi)GDNFmRNA、RaimRNA表達影響的研究*

張 微，李 瑛△，劉麗莎，羅芳麗，趙中亭

(成都中醫(yī)藥大學，成都 610072)

目的:探討電針大腸俞募穴對功能性便秘小鼠結(jié)腸組織內(nèi)GDNFmRNA、Rai mRNA表達的影響。方法:48只小鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組和電針組。采用復方地芬諾酯灌胃造模，電針刺激“天樞”、“大腸俞”后觀察結(jié)腸上皮細胞形態(tài)、結(jié)腸組織內(nèi)GDNFmRNA、Rai mRNA的表達情況。結(jié)果:模型組小鼠結(jié)腸上皮細胞凋亡增多，GDNFmRNA、RaimRNA表達降低。電針組結(jié)腸上皮細胞凋亡減少，GDNFmRNA、RaimRNA表達增強。結(jié)論:電針能改善功能性便秘小鼠結(jié)腸上皮細胞凋亡情況，上調(diào)GDNFmRNA、Rai mRNA的表達水平。

電針;俞募穴;功能性便秘;GDNFmRNA;RaimRNA

功能性便秘是臨床常見病、多發(fā)病，以大便秘結(jié)不通、排便時間延長或欲便而艱澀不暢，或日久無便意為主要臨床特征［1］，嚴重影響患者生活質(zhì)量［2］。藥物治療易產(chǎn)生耐受性，且不良反應(yīng)多，容易復發(fā)。臨床研究結(jié)果證實，針灸治療功能性便秘效果顯著［3］，其中大腸俞配天樞這一經(jīng)典的俞募配穴法，是針灸治療該病最常用、最具特色的方法［4］。

腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞(enteric glial cell，EGC)對維護腸神經(jīng)系統(tǒng)的完整性、調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。EGC分泌的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)可促進神經(jīng)元存活，抗腸上皮細胞凋亡［5-6］，其與Rai結(jié)合激活PI3K-AKT信號通路，促進神經(jīng)元增殖和存活，改善胃腸傳輸功能，可能是針刺治療功能性便秘的重要作用機制。有研究表明，針刺可上調(diào)GDNF的表達水平。

因此，本研究以針刺俞募穴臨床療效確切的功能性便秘為研究對象，以功能性便秘小鼠模型為研究載體，從影響胃腸動力的重要因素GDNF、Rai入手，探討大腸俞募配穴治療功能性便秘的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級昆明小鼠48只，體質(zhì)量(30±5)g，購于成都達碩實驗動物技術(shù)有限公司(動物生產(chǎn)許可證號scxk(川)2013-24)，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始實驗。按照性別、體質(zhì)量用隨機數(shù)字表法將小鼠分為對照組16只、模型組16只、電針組16只。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 主要儀器 轉(zhuǎn)輪式切片機(德國徠卡);TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(常州中威);PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州中威); BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪);Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics);SDZ-Ⅱ型華佗牌電針治療儀(江蘇蘇州)。

1.2.2 主要試劑 復方地芬諾脂片(批號20130708，江蘇常州);TUNEL試劑盒 (批號14590300，瑞士羅氏);原位雜交試劑盒(批號ISHD001，福州邁新);多聚甲醛(批號20130813，天津進豐);PBS磷酸鹽緩沖液(批號ZLI-9062，北京中杉)。

1.3 動物造模

1.3.1 模型制備 針刺組、模型組小鼠均使用復方地芬諾酯混懸液以10 mg/kg·d的劑量進行灌胃，灌胃容量為0.1 ml/10 g，持續(xù)14 d;對照組小鼠給予0.9%生理鹽水以相同劑量和容量進行灌胃，持續(xù)14 d［7］。

1.3.2 模型成功的判定標準 造模結(jié)束后動物禁食12 h，經(jīng)口灌入濃度為100 g/L的活性炭懸液0.1 ml/10 g。從活性炭灌胃后開始計時，記錄從灌胃到首粒黑便排出時間，以與對照組小鼠數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)為判定模型成功的標準。

1.4 針刺方法

1.4.1 穴位選擇與定位 選用大腸俞募配穴的2個腧穴“大腸俞”“天樞”，小鼠穴位定位及針刺深度均參照中國針灸學會實驗針灸分會制定的《動物針灸穴位圖譜》。天樞穴相當于小鼠臍中(腹部正中)旁開5 mm，大腸俞在腰部第4腰椎棘突下，旁開5 mm。

1.4.2 針具選擇 針具選用漢醫(yī)牌針灸針(天津華鴻醫(yī)材有限公司生產(chǎn))，Φ0.30×13 mm。

1.4.3 處理方法 電針組小鼠用特制固定板固定后，交替針刺同側(cè)天樞和大腸俞，進針5 mm左右，捻轉(zhuǎn)有緊滯感后針柄接電針儀。刺激參數(shù):疏密波(疏波4 Hz，密波50 Hz)，以小鼠肢體末端輕微抖動為宜。留針30 min，每日1次［9］，5 d為1個療程，療程之間間隔2 d。對照組、模型組同法固定，但不接受任何治療。每組動物分別接受1周、2周的治療。

1.5 觀察指標

1.5.1 小鼠排便情況 治療結(jié)束后各組小鼠采用活性炭混懸液灌胃，小鼠稱重后按照0.1 ml/ 10 g的劑量進行灌胃，記錄從灌胃到首粒黑便排出時間。

1.5.2 結(jié)腸上皮細胞凋亡情況 利用TUNELPOD法檢測針刺俞募穴對腸上皮細胞凋亡的影響。

1.5.3 GDNFmRNA及RaimRNA表達 用動物處死后所取樣本，采用原位雜交結(jié)合計算機圖像分析，檢測遠端結(jié)腸內(nèi)GDNF mRNA及RaimRNA的表達。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，各組數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)檢驗和方差齊性分析后，組間比較采用單因素方差分析，方差齊選用LSD(Least Significant Difference，最小顯著差異法)，方差不齊選用Tamhane’s t2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 小鼠排便情況

圖2、3和表1顯示，與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織GDNF mRNA、Rai mRNA含量均明顯降低(P＜0.01);與模型組比較，電針組小鼠結(jié)腸組織GDNF mRNA、Rai mRNA含量升高(P＜0.05);各組內(nèi)1周和2周比較含量變化均不明顯。

表1顯示，與對照組比較，模型組和電針組小鼠首粒黑便排出時間均延長(P＜0.01);與模型組比較，電針組小鼠首粒黑便排出時間均縮短(P＜0.01);而模型組和電針組組內(nèi)1周、2周比較，首粒黑便排出時間差異不明顯。

2.2 結(jié)腸上皮細胞凋亡情況

表1圖1顯示，與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸上皮細胞凋亡陽性表達率升高(P＜0.01);電針組比較，模型組凋亡細胞陽性表達率下降(P＜0.05);模型組和電針組組內(nèi)1周、2周比較差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織中 GDNFmRNA、RaimRNA表達比較

表1 小鼠各檢測指標表達情況(±s)

表1 小鼠各檢測指標表達情況(±s)

注:與對照組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 時間 首粒黑便排出時間(min) Rai mRNA積分光密度值對照組 1周 152.75±12.56 18.38±10.60 0.191±0.009 0.219凋亡細胞陽性表達率(%) GDNFmRNA積分光密度值±0.012 2周 151.75±11.81 22.88±18.83 0.191±0.006 0.218±0.007模型組 1周 313.88±14.59＊＊ 38.50±18.49＊＊ 0.174±0.007＊＊ 0.207±0.008 2周 309.38±19.18＊＊ 46.75±27.20＊＊ 0.173±0.008＊＊ 0.201±0.011＊＊電針組 1周 208.50±24.26＊＊△△ 25.00±11.69△ 0.184±0.0085△ 0.218±0.007 2周 205.38±22.32＊＊△△ 20.50±24.01△ 0.182±0.0055△ 0.210±0.010△

3 討論

俞穴、募穴均屬特定穴，是臟腑之氣輸注和匯聚的部位，臨床主要用于治療相關(guān)臟腑的病變?！端貑枴り庩枒?yīng)象大論》曰:“從陰引陽，從陽引陰?！薄峨y經(jīng)·六十七難》亦載:“陰病行陽，陽病行陰。故令募在陰，俞在陽?！被试凇峨y經(jīng)本義》中曰:“陰陽經(jīng)絡(luò)，氣相交貫，臟腑腹背，氣相通應(yīng)?！迸K腑之氣通過氣街與其相對應(yīng)的俞募穴相聯(lián)系，兩者一前一后、一陰一陽共同發(fā)揮調(diào)節(jié)臟腑經(jīng)絡(luò)的虛實盛衰、平衡人體一身之氣血陰陽的作用，因此臨床上常將兩者配合運用，以發(fā)揮其協(xié)同效應(yīng)。在胃腸道疾病中，如功能性消化不良［9］、腸易激綜合征［10］、便秘［11］等的臨床治療方案中，俞募配伍是臨床最常用的配穴方法。有研究對近年來發(fā)表的針灸治療便秘的臨床文獻進行分析［12］，使用頻次最高的穴位為天樞、足三里和大腸俞，使用最多的配穴方法為俞募配穴。目前對針刺俞募穴治療功能性便秘的機制研究主要集中在神經(jīng)階段分布上，并未從本質(zhì)上闡釋其作用機制。

腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)被稱為“腸腦”，可分泌多種神經(jīng)遞質(zhì)來調(diào)控胃腸功能，其功能異常被認為是便秘形成的主要原因之一。腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞(EGC)是胃腸道感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)的衛(wèi)星細胞，具有維持腸神經(jīng)系統(tǒng)以及調(diào)節(jié)神經(jīng)活動的作用［13］。成熟的EGC可以產(chǎn)生GDNF，在腸神經(jīng)的生長、分化及發(fā)育、損傷修復中起到重要作用［14-16］，其生物學效應(yīng)由 GDNF家族受體1(GDNF family receptor 1，GFRα1)和絡(luò)氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase，RET)介導。Rai是RET的生物底物，是原癌蛋白Shc家族中的一員，主要傳遞神經(jīng)營養(yǎng)因子信號，維持神經(jīng)細胞存活，抑制細胞凋亡。當神經(jīng)細胞受GDNF濃度改變的刺激時，Rai的神經(jīng)保護存活效應(yīng)被激活，活化的受體可激活下游的磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphotydilinosital-3-kinase，PI3K)-Akt信號通路［17］。通過該途徑，EGC可以維持ENS的完整性，改善胃腸動力。綜上所述，GDNF、Rai在胃腸動力的生理病理機制中發(fā)揮著重要作用。另外有研究發(fā)現(xiàn)，針刺可以提高GDNF的表達水平及其作用效應(yīng)［18-20］。

圖1 各組小鼠結(jié)腸上皮細胞凋亡情況

圖2 各組小鼠結(jié)腸GDNFmRNA原位雜交圖片

圖3 各組小鼠結(jié)腸Rai mRNA原位雜交圖片

本實驗中，我們應(yīng)用最為經(jīng)典的地芬諾酯灌胃法制作便秘小鼠模型，造模成功后進行1周和2周的電針刺激治療。研究結(jié)果顯示，功能性便秘模型小鼠首粒黑便排出時間延長，結(jié)腸上皮細胞凋亡明顯，結(jié)腸組織內(nèi)GDNFmRNA、RaimRNA表達降低。電針治療能使功能性便秘模型小鼠結(jié)腸組織內(nèi)GDNFmRNA、RaimRNA表達增強，進而抑制結(jié)腸上皮細胞凋亡，改善小鼠排便情況，提示電針改善功能性便秘小鼠的排便情況可能是通過調(diào)節(jié)GDNFmRNA、RaimRNA的表達水平來實現(xiàn)的。而電針治療1周和2周之間各指標變化不明顯，提示電針效應(yīng)與療程之間不呈正相關(guān)。

綜上，本研究表明，電針刺激大腸俞募穴能提高GDNFmRNA、Rai mRNA的表達水平，改善功能性便秘小鼠結(jié)腸上皮細胞的凋亡情況。而對于GDNF的下游信號通路PI3K-AKT在電針治療功能性便秘中的作用機制，我們在今后的研究中將進一步深入闡釋。

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Effects of Electroacupuncture Back-shu and Front-mu Points on the GDNF-mRNA，RaimRNA Expression in Colonic Tissne for Mice of Functional Constipation

ZHANG Wei，LI Ying△，LIU Li-sha，LUO Fang-li，ZHAO Zhong-ting

(Chengdu University of TCM，Chengdu 610072，China)

Objective To explore the mechanism of electroacupuncture(EA)Back-shu and Front-mu points on GDNFmRNA，Rai mRNA in colon in functional constipation(FC)mice.Methods:48 mice were randomly divided into control group，model group，EA group.Using compound diphenoxylate orally modeling method and EA“Tianshu”，“Dachangshu”，the morphology of colonic epithelial structure，the level of GDNFmRNA，RaimRNA in colon were observed by TUNELand in situ hybridization.Results The expression of GDNF mRNA，，RaimRNA in model group was significantly decreased with more damage depithelial cells.EA back-Shu and front-Mu points can improve the expression of GDNF mRNA，RaimRNA.TUNEL found that acupuncture can repair damage depithelial cells.Conclusion:EA back-Shu and front-Mu points can up-regulate the expression of GDNF mRNA，RaimRNA in FC mice.

Electroacupuncture;Back-shu and Front-mu points;Functional constipation;GDNFmRNA;RaimRNA

R245.9+7

B

1006-3250(2016)11-1522-03

2016-05-17

國家自然科學基金面上項目(81273853)-針刺俞募穴治療功能性便秘的EGC及ENS-ICC-SMC功能網(wǎng)絡(luò)調(diào)整機制研究

張 微(1985-)，女，河北石家莊人，實驗師，醫(yī)學博士，從事針灸治療腸神經(jīng)系統(tǒng)疾病的效應(yīng)及其機制研究。

△通訊作者:李 瑛(1964-)，女，四川人，教授，醫(yī)學博士，從事針灸治療消化系統(tǒng)疾病的效應(yīng)及其機制研究，Tel:。