富鋅微生物培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究

張寶蓉

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué),廣東 廣州 510000)

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富鋅微生物培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究

張寶蓉

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué),廣東 廣州 510000)

摘要：微量元素鋅是動(dòng)物體必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一。本試驗(yàn)通過(guò)篩選高富鋅的微生物菌株，以生產(chǎn)微生物發(fā)酵態(tài)鋅飼料添加劑，為鋅在動(dòng)物生產(chǎn)中的合理利用提供依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采集土壤作為樣品，用來(lái)篩選出發(fā)酵鋅制劑的微生物菌種。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置溫度：20℃、37℃、42℃；pH：5.8，6.4，7.1，7.6；培養(yǎng)時(shí)間：0h、12h、18h、24h、36h、48h；培養(yǎng)基鋅濃度：50、100、200、300、400、500、600、700、800mg/L。通過(guò)以上培養(yǎng)條件的確定，篩選出較能夠富鋅的菌種。

關(guān)鍵詞：微生物；發(fā)酵參數(shù)；紫外線；誘變；微生物鋅制劑

1鋅營(yíng)養(yǎng)的概述

鋅是一種在生物體內(nèi)分布很廣泛并且在有機(jī)體內(nèi)組成和激活多種酶的動(dòng)物必須的微量元素。鋅的作用主要是通過(guò)影響這些酶的活性，進(jìn)而對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)、繁殖和組織再生等產(chǎn)生影響，最終發(fā)揮其重要的生理生化功能。鋅還可以參與構(gòu)成核蛋白，參與前列腺素代謝，構(gòu)成胰島素，并作為維持其功能所必須的成分；當(dāng)鋅參與維生素還原酶的構(gòu)成時(shí)，與維生素A代謝有關(guān)。

2本實(shí)驗(yàn)的研究目的及意義

由于微量元素對(duì)腸道環(huán)境的改善作用，微生態(tài)制劑已經(jīng)在畜禽養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)從采集的土壤樣品中篩選發(fā)酵鋅制劑的微生物菌種，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)條件的優(yōu)化探討菌株富集鋅離子的能力及影響因素，確立發(fā)酵鋅制劑菌種的最佳培養(yǎng)條件,為生產(chǎn)中微生物發(fā)酵制劑的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

3材料與方法

3.1菌種

從土壤樣品中篩選的微生物菌種。

3.2實(shí)驗(yàn)試劑

酵母膏、蛋白胨、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、ZnSO4·7H2O、氫氧化鈉(40%NaOH)、鹽酸(HCL)、氯化鈉、CuSO4·5H2O、無(wú)水硫酸鈉(Na2SO4)、濃硫酸、無(wú)菌蒸餾水、甘油。

3.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.3.1菌液制備。取土壤樣品5g置于三角瓶中，加入無(wú)菌蒸餾水45ml，充分?jǐn)嚢韬笤趽u床上培養(yǎng)4h，取上清液備用。取5支裝有9ml無(wú)菌水的試管，用記號(hào)筆分別編號(hào)1、2、3、4、5，用移液槍吸取上清液1mL放進(jìn)編號(hào)為1的試管內(nèi)，制成10-1的上清液，從編號(hào)為1中吸取1mL稀釋液加入編號(hào)2，混勻變成10-2上清液。按照此方法依次制成10-3、10-4、10-5的上清液備用。

3.3.2溫度的確定。配制三個(gè)固體培養(yǎng)基，編號(hào)1、2、3,1號(hào)對(duì)應(yīng)溫度為24℃，37℃，42℃。取土壤的10-5上清稀釋液10ul，涂抹均勻在備用的固體培養(yǎng)基上，貼好標(biāo)簽。然后分別置于24℃、37℃、42℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.3.3不同pH下菌落的生長(zhǎng)狀況。配制pH分別為5.8，6.4，7.1，7.6的固體培養(yǎng)基，對(duì)應(yīng)編號(hào)1、2、3、4，121℃下高壓滅菌15min。在無(wú)菌條件下倒板，待培養(yǎng)基冷凝后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。吸取10-5上清液稀釋液10ul涂布在上述不同pH固體培養(yǎng)基上。

3.3.4培養(yǎng)時(shí)間的確定。在PH和溫度已經(jīng)測(cè)定的基礎(chǔ)上，首先配兩只15ml/支的液體培養(yǎng)基，其中一個(gè)為空白對(duì)照。編號(hào)后進(jìn)行滅菌。按5%的接種量接種菌液，接種在準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)時(shí)選擇時(shí)間0h、1h、2h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h為時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取菌液1ml，取樣后用分光光度計(jì)測(cè)量OD值，將空白作為對(duì)照使用。分光光度計(jì)的波長(zhǎng)設(shè)置為520 nm處。

3.3.5鋅濃度梯度的篩選。配制0、100、200、300、400、500、600、700、800mg/L鋅濃度的固體培養(yǎng)基，每個(gè)梯度各三個(gè)。鋅源添加量配置好后在搖床中培養(yǎng)備用。吸取10-5上清稀釋液按已經(jīng)測(cè)得出的最適接種量接種到100mg/L各個(gè)濃度培養(yǎng)基平板上。

4結(jié)果

4.1不同溫度下菌落的生長(zhǎng)情況

溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)有重要影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在42℃下菌落無(wú)法生長(zhǎng)，在20℃下菌落的生長(zhǎng)時(shí)間變長(zhǎng)，在37℃下的菌種生長(zhǎng)時(shí)間最短，所以37℃是菌落生長(zhǎng)的最適溫度。

4.2不同pH下菌落的生長(zhǎng)情況

菌落的生長(zhǎng)受培養(yǎng)基pH的影響。pH為5.8時(shí)，菌種無(wú)菌落長(zhǎng)出，而另外三種pH下菌落生長(zhǎng)情況則表現(xiàn)為：pH為7.1時(shí)，菌落數(shù)最多，pH為7.6時(shí)次之，pH為6.4時(shí)菌落數(shù)最少。故pH為7.1是被篩選菌種的最適pH。

4.3生長(zhǎng)曲線

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落數(shù)逐漸增加，在培養(yǎng)至12h時(shí)，微生物生長(zhǎng)進(jìn)入快速生長(zhǎng)期。至24h時(shí)，生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，到36h時(shí)，微生物生長(zhǎng)到最高的水平。

4.4不同底物鋅濃度下菌落的生長(zhǎng)情況

由表1可以看出，菌種在不同底物鋅濃度下生長(zhǎng)情況差異很大，表現(xiàn)為隨著底物鋅濃度的升高，菌落數(shù)減少。菌種最高耐受濃度達(dá)到800mg/L。

表1菌種在不同底物鋅濃度下的菌落計(jì)數(shù)(單位為CFU/mL)(表中數(shù)值采用“平均數(shù)±SEM”表示，并統(tǒng)計(jì)差異顯著性)

項(xiàng)目100mg/L200mg/L300mg/L400mg/L500mg/L600mg/L700mg/L800mg/L菌落數(shù)513±10.49a372±23.58b266±9.16c191±16.56d126±11.13e64±7.55f34±7.81g23±6.30h

注：角標(biāo)相同表示差異顯著(P<0.05)，角標(biāo)不同表示差異不顯著(P>0.05)

5結(jié)論

本試驗(yàn)綜合考慮微生物菌種的生長(zhǎng)周期，不同pH下生長(zhǎng)的情況，以及耐受鐵的能力，篩選出耐高鐵的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基pH為7.1，培養(yǎng)溫度為36℃，培養(yǎng)時(shí)間是36h，鋅濃度含量為800mg/L，且綜合各種因素考慮可以得出從土壤中篩選的耐高鋅菌種生命力最為旺盛。得到的耐高鋅微生物不僅給動(dòng)物提供了充足的鋅源，滿足動(dòng)物體對(duì)鋅的需求，還為動(dòng)物內(nèi)腸道提供了均衡的微生物環(huán)境，增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能提高生產(chǎn)性能的作用。

中圖分類號(hào):Q93-33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1671-1602(2016)04-0024-01

作者簡(jiǎn)介：張寶蓉(1992.03-)，女，漢，河南濮陽(yáng)人，學(xué)生，研究生，單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，研究方向：生化與分子。