腈水合酶發(fā)酵過程的染菌途徑與分析

莊賢軍，吳叢偉

（浙江鑫甬生物化工股份有限公司，浙江寧波 315204）

腈水合酶發(fā)酵過程的染菌途徑與分析

莊賢軍，吳叢偉

（浙江鑫甬生物化工股份有限公司，浙江寧波 315204）

為了找出染菌原因，采取有效措施，把發(fā)酵染菌造成的損失降低到最小，結(jié)合多年發(fā)酵和丙烯酰胺行業(yè)的工作經(jīng)驗(yàn)，對(duì)微生物法生產(chǎn)丙烯酰胺行業(yè)的染菌類型和原因進(jìn)行粗略分析。

發(fā)酵；染菌；原因分析

引言

工業(yè)發(fā)酵需確保純種發(fā)酵，所謂染菌，是指在純種發(fā)酵培養(yǎng)基中侵入其他微生物。引起染菌的環(huán)節(jié)很多，在目前的科學(xué)技術(shù)條件下，還無法做到不染菌，發(fā)酵染菌的防治一直是發(fā)酵工廠的重要課題［1］，微生物法生產(chǎn)丙烯酰胺行業(yè)同樣無法回避這個(gè)課題。發(fā)酵工廠對(duì)染菌的對(duì)策是防重于治，在設(shè)備管道安裝上盡量避免死角，同時(shí)建立健全、規(guī)范的技術(shù)操作規(guī)程，把工作做在前面，防患于未然，做到盡量防止染菌發(fā)生。而一旦發(fā)生染菌，則要盡可能找出染菌原因，采取有效措施，把發(fā)酵染菌造成的損失降低到最?。?，2］，消除各種隱患，降低染菌率，對(duì)微生物法生產(chǎn)丙烯酰胺行業(yè)的染菌類型和原因進(jìn)行細(xì)致分析。

1 染菌分析

腈水合酶發(fā)酵中，一般通過鏡檢或平板跟蹤判斷是否染菌，發(fā)生染菌后，一般從以下三個(gè)方面來分析原因。

1.1 從染菌時(shí)間（2天）看

腈水合酶發(fā)酵罐一般18小時(shí)取第一個(gè)樣，以后每隔6小時(shí)取樣，鏡檢發(fā)現(xiàn)染菌：如早期染菌，18小時(shí)鏡檢發(fā)現(xiàn)染菌，一般有三個(gè)方面：種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、設(shè)備問題。如中后期染菌，方向有 ：設(shè)備或閥門漏、操作不當(dāng)、空氣、補(bǔ)料等［1，2］。

1.2 從染菌類型（芽孢桿菌、無芽孢桿、格蘭氏陰性菌、霉菌）分析

芽孢桿菌：來源基本為培養(yǎng)基滅菌不徹底、設(shè)備存在死角［1，2］。無芽孢桿菌或球菌：來源一般是蒸汽冷凝水或空氣。格蘭氏陰性菌或球菌：來源一般是水或設(shè)備滲漏。霉菌：霉菌一般比較少，來源滅菌不徹底、操作不嚴(yán)。

1.3 大批發(fā)酵罐染菌和個(gè)別發(fā)酵罐染菌

大批發(fā)酵罐染菌，且染菌是同一種菌，一般來源是空氣或種子帶菌［1，2］。個(gè)別罐連續(xù)染菌基本由設(shè)備造成，如閥門滲漏、罐體滲漏、死角等，而造成個(gè)別罐偶然染菌的因素較多，要注意操作和設(shè)備細(xì)節(jié)。

2 防治染菌途徑

腈水合酶發(fā)酵發(fā)生染菌時(shí)，要根據(jù)染菌時(shí)間、染菌類型、染菌范圍，進(jìn)一步分析產(chǎn)生染菌的途徑，找出染菌的原因，并達(dá)到防治染菌的目的。

2.1 影響滅菌效果的因素

（1）培養(yǎng)基成分：有機(jī)物質(zhì)能在細(xì)菌周圍形成保護(hù)膜，使滅菌效果下降，腈水合酶發(fā)酵原料中，主要是酵母膏。（2）培養(yǎng)基狀態(tài)：液態(tài)物質(zhì)消毒效果好于固態(tài)。（3）培養(yǎng)基中有大顆粒和結(jié)塊物料要注意，特別是酵母膏，需要溶解后加入，否則容易出現(xiàn)染菌可能。（4）物料中微生物數(shù)量：夏季設(shè)備和原料中微生物數(shù)量增加，容易造成滅菌不透，需要適當(dāng)延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。（5）空氣排除情況：消毒過程需要充分排氣，如果空氣沒有排凈，會(huì)造成假壓，造成消毒不透［1，2］。（6）攪拌翻動(dòng)對(duì)滅菌影響：消毒過程要求培養(yǎng)基翻動(dòng)良好，否則影響滅菌效果。（7）泡沫影響消毒效果：如果培養(yǎng)基消毒過程起泡嚴(yán)重，泡沫傳熱效果差，泡沫中細(xì)菌不易殺死，一旦泡沫多，需增加消泡劑用量。（8）培養(yǎng)基pH值影響滅菌效果：培養(yǎng)基pH偏酸性或偏堿性，比中性培養(yǎng)基消毒效果更好。

2.2 消毒操作要求

（1）要求消毒蒸汽壓力平穩(wěn)、三路進(jìn)蒸汽要求平穩(wěn)，進(jìn)汽和排氣不能忽大忽小，其中阻力大的空氣分布管進(jìn)汽閥門應(yīng)先開，并適當(dāng)開大一點(diǎn)，阻力小的閥門后開，以確保各路進(jìn)汽口有足夠蒸汽，培養(yǎng)基能激烈翻動(dòng)和混合，滅菌徹底。（2）發(fā)酵罐或種子罐直接連接的管道和閥門，必須遵守“不進(jìn)則出”原則，杜絕有的閥門似開非開，處于既不進(jìn)蒸汽也不排氣的狀態(tài)［1，2］。（3）避免罐內(nèi)有積垢造成死角，洗罐必須徹底，不但每次要清洗干凈，而且要定期拆卸內(nèi)部構(gòu)件，徹底清理死角。（4）各路進(jìn)蒸汽要暢通，如果有進(jìn)汽閥門開得過小，或閥門閥芯脫落，造成事實(shí)沒有進(jìn)汽或進(jìn)汽太小，閥門處于“假開”狀態(tài)，容易造成死角，導(dǎo)致滅菌不徹底。（5）夾套加熱時(shí)，就要適當(dāng)打開排氣閥門，確保罐內(nèi)空氣排充分，避免假壓。（6）發(fā)酵罐體積大，升溫時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)消保壓時(shí)間比小罐可以適當(dāng)縮短，否則容易出現(xiàn)培養(yǎng)基消毒過頭，營養(yǎng)成分破壞嚴(yán)重。而罐子小，升溫快，升溫時(shí)間短，則要適當(dāng)延長(zhǎng)保壓時(shí)間，否則容易消毒不透。（7）溫度表和壓力表需要定期校驗(yàn)，以免因溫度和壓力不準(zhǔn)，造成消毒不透。

2.3 關(guān)于死角

所謂死角，就是消毒時(shí)，因?yàn)槟承┰蚴箿缇鷾囟冗_(dá)不到，或不易達(dá)到的局部區(qū)域。腈水合酶發(fā)酵罐內(nèi)的死角范圍大概有以下幾個(gè)方面：（1）環(huán)形空氣分布管死角，環(huán)形空氣分布管內(nèi)部容易積垢，造成死角［1］。（2）罐體制作造成的死角，制作過程不注意細(xì)節(jié)，局部出現(xiàn)死角，容易染菌。（3）管道、管件和閥門安裝存在死角。（4）法蘭焊接死角、墊片安裝死角、以及焊接和安裝不注意產(chǎn)生的死角也會(huì)引起染菌。（5）罐底、罐內(nèi)不易清洗部位、以及隱蔽部位污垢積聚形成死角，除每罐需要需要仔細(xì)清洗外，還需定期拆檢內(nèi)部構(gòu)件，徹底清理死角。（6）焊接部位，擋板，軸、攪拌葉、內(nèi)盤管及盤管支架等易結(jié)垢部位，需清洗要徹底，并定期入罐除垢。（7）內(nèi)部結(jié)構(gòu)和管路安裝方式不合理產(chǎn)生死角，必須盡量避免。（8）不容易溶解或打散的物料，特別是酵母膏，須單獨(dú)溶解后投入罐內(nèi)，否則難溶解的原料沉淀在罐底，溶解慢，會(huì)形成死角，消毒不透。（9）移種管道必須蒸汽暢通，避免存在死角。（10）排污管、排氣管、移種管、出料管等須單獨(dú)安裝，不能幾個(gè)罐并聯(lián)，否則容易出現(xiàn)交叉污染。

2.4 種子帶菌

腈水合酶發(fā)酵中，種子帶菌引起的染菌幾率不太高，但它是發(fā)酵前期染菌重要原因之一［1］，造成種子帶菌從以下幾個(gè)方面查找原因：

2.4.1 種子培養(yǎng)基滅菌不徹底

丙烯酰胺工廠的腈水合酶菌種室碰到過幾種情況：a.滅菌鍋排氣管壞，造成排氣不充分，空氣沒排完造成假壓，消毒不透。b.消毒培養(yǎng)基瓶子放得太緊密，或擋住蒸汽通道，影響滅菌效果。c.試管斜面等器材放入大燒杯內(nèi)，然后放入滅菌鍋滅菌，燒杯內(nèi)空氣無法從底部排走，試管內(nèi)的培養(yǎng)基滅菌不透，造成斜面染菌。d.消毒結(jié)束后，放氣過程太快，造成三角燒瓶?jī)?nèi)的物料濺濕紗布，濕紗布的空氣過濾效果差，培養(yǎng)過程造成染菌。

2.4.2 無菌室和超凈工作臺(tái)

a.要求無菌室密封性良好，否則外界空氣漏入，無法保證無菌環(huán)境，會(huì)產(chǎn)生污染。b.無菌室每天操作前后必須用紫外燈滅菌，紫外線殺菌力最強(qiáng)的波長(zhǎng)是2560-2260A，紫外燈管老化后，要及時(shí)更換，否則滅菌效果降低后，無法保證紫外線滅菌效果［5］。c.無菌室的四壁、地面、天花板、空間需要定期用化學(xué)滅菌劑滅菌，滅菌劑應(yīng)交替使用。d.每次使用無菌室時(shí)間不能過長(zhǎng)，操作過程要遵守?zé)o菌室管理規(guī)范，盡量少走動(dòng)，少說話，無菌室每次使用后要做好清潔，用過器具要經(jīng)滅菌處理［1］。e.超凈工作臺(tái)操作區(qū)每次使用前后要紫外線滅菌，使用前后操作臺(tái)用75 %脫脂酒精棉球或消毒液消毒。f. 超凈工作臺(tái)工作原理是利用無菌空氣層流技術(shù)，空氣流速一般為0.05 m/s［1］，無菌操作期間，操作臺(tái)上不能堆放太多物品，以免影響層流空氣的過濾效果。g.超凈工作臺(tái)的過濾網(wǎng)要定期及時(shí)更換，否則一旦過濾失效，超凈工作臺(tái)的無菌條件無法保證。

2.4.3 無菌操作

無菌操作臺(tái)上各項(xiàng)接種操作使用酒精燈，在靠近火焰旁操作，接種過程要遵守?zé)o菌操作規(guī)范。

2.4.4 搖瓶染菌

生產(chǎn)丙烯酰胺的腈水合酶，一級(jí)搖瓶在搖床上培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速可調(diào)節(jié)，一般控制170r/min左右，如果轉(zhuǎn)速太快，或搖床長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)轉(zhuǎn)后出現(xiàn)不平穩(wěn)跳動(dòng)，則搖瓶?jī)?nèi)種子液會(huì)濺濕搖瓶口的紗布［1］，紗布的過濾效果失效，容易出現(xiàn)染菌。

2.5 空氣系統(tǒng)染菌

腈水合酶發(fā)酵生產(chǎn)使用的空氣，須經(jīng)空氣預(yù)處理系統(tǒng)進(jìn)行兩次冷卻、兩次油水分離，經(jīng)空氣加熱器加熱后，再經(jīng)空氣總過濾器、預(yù)過濾器、精過濾器三級(jí)過濾后，進(jìn)入種子罐和發(fā)酵罐，每個(gè)罐配一套預(yù)過濾器、精過濾器和蒸汽過濾器。

（1）空氣預(yù)過濾系統(tǒng)的兩次冷卻器、兩次油水分離器、空氣貯罐，規(guī)定每2小時(shí)定時(shí)排油水。（2）空氣進(jìn)總過濾器前，須經(jīng)空氣加熱器加熱，加熱溫度控制60℃，相對(duì)濕度控制在60%以下。（3）總過濾器直徑DN800，棉花要加工成DN1000的棉餅，逐層、均勻、平整裝入總過濾器，避免棉餅翻身，引起空氣走短路。棉餅裝量既不能太松，也不能太緊，太松容易翻身，無法達(dá)到過濾效果，太緊容易造成總過濾器滅菌不徹底，且過濾器前后空氣壓差大。總過濾器采用∮200×500四支濾芯。（4）預(yù)過濾器采用JPFYUD型預(yù)過濾器，精過濾器采用JPF型精過濾器［3］，蒸汽采用JLS-F蒸汽過濾器。（5）JPF-YUD型預(yù)過濾器一般無需消毒，過濾精度0.3μm，裝入濾芯后可直接使用，其濾芯中心柱是耐熱聚丙烯。JPF型精過濾器需先消毒再使用，過濾精度0.1μm，其濾芯中心柱是304不銹鋼。（6）總過濾器和精過濾器消毒前，先要排出蒸汽管道的冷凝水，否則會(huì)造成棉花和濾芯受潮，影響滅菌效果和空氣過濾效果。（7）總過濾器滅菌時(shí)，控制在滅菌蒸汽壓力0.1～0.12MPa，每次60min，并確保上下排氣暢通，如蒸汽不暢通，蒸汽無法穿透棉花，容易滅菌不徹底，但滅菌溫度和蒸汽壓力太高，又容易造成濾芯橡皮圈變形，不能密封，濾芯失效。（8）精過濾器消毒控制在0.1～0.12MPa，每次30min，濾芯滅菌壽命160次，溫度升高，壽命降低，溫度太高甚至?xí)斐蔀V芯熔化。精過濾器不需每批次滅菌，一般沒有染菌可以半個(gè)月滅菌一次，染菌時(shí)，則每次要滅菌。（9）如有發(fā)酵罐連續(xù)染菌［4］兩罐以上，須拆檢精過濾器濾芯是否完好。

2.6 設(shè)備和管件滲漏引起染菌

發(fā)酵行業(yè)的滲漏一般都是極其微小的，往往無法直接通過肉眼觀察，而要通過一定的試漏和查漏方法才能找到漏點(diǎn)，腈水合酶發(fā)酵也一樣。（1）罐體滲漏：罐體最容易滲漏部位是液層以下焊縫和罐底靠近空氣入口處，有夾套的需通過夾套蒸汽烘干后試漏，無夾套的直接空氣試漏，查到漏點(diǎn)后補(bǔ)焊。（2）冷卻盤管滲漏：盤管最容易滲透部位是焊縫和彎頭處，需清除盤管外壁后，將盤管烘干，管內(nèi)加壓試漏，發(fā)現(xiàn)漏點(diǎn)后補(bǔ)焊。（3）管件滲漏：管件滲漏最常見的部位是直接和罐內(nèi)連接的閥門和近罐法蘭墊片漏，要求勤拆檢閥門、及時(shí)更換損壞變形的閥芯，防止閥芯老化滲漏。（4）軸機(jī)械密封漏：一般有兩種情況，一種是機(jī)封動(dòng)環(huán)和靜環(huán)的密封面漏，另一種是靜環(huán)底部O型密封圈老化滲漏，這兩種情況滲漏都會(huì)造成滅菌時(shí)漏蒸汽，并造成蒸汽冷凝水積聚，在罐壓波動(dòng)時(shí)，漏入發(fā)酵罐造成染菌，特別是O型密封圈滲漏，危險(xiǎn)性更大，必須及時(shí)更換。

2.7 操作不當(dāng)引起染菌

操作不當(dāng)主要有幾個(gè)方面：（1）洗罐、拆檢閥門等工作做得不夠仔細(xì)。（2）消毒過程操作不當(dāng)。（3）操作不當(dāng)造成罐壓跌零甚至造成負(fù)壓。（4）保壓操作不當(dāng)，造成罐內(nèi)料液倒回到過濾器，過濾器失效。

3 染菌后的挽救

腈水合酶生產(chǎn)過程染菌以后要根據(jù)具體情況，及時(shí)采取措施加以挽救：（1）種子罐染菌，不管染菌時(shí)間遲早和染菌種類，都必須消毒滅菌降溫后，倒罐。（2）發(fā)酵早期染菌，可適當(dāng)補(bǔ)加培養(yǎng)基成分后，重消后再接種和發(fā)酵。（3）如果是發(fā)酵中后期染菌，如果染的是球菌或細(xì)桿菌，一般不影響產(chǎn)酶，可以共生共長(zhǎng)，繼續(xù)發(fā)酵到結(jié)束。（4）如果中后期染粗桿菌或芽孢，則要加大通風(fēng)量、抑制雜菌，在酶活達(dá)到使用要求后，及時(shí)提前放罐，否則往往容易出現(xiàn)發(fā)酵液分層倒罐［1，2］。（5）出現(xiàn)染菌后，下一罐投料必須更加重視，特別是芽孢桿菌，要預(yù)防出現(xiàn)連續(xù)染菌：染菌罐必須重視拆檢閥門；染菌罐的精過濾器必須重新消毒；染菌罐洗罐必須更加仔細(xì)，入罐檢查消除罐內(nèi)死角，必要時(shí)甚至要拆除罐內(nèi)附件，清除積垢后再裝好使用；空消時(shí)加入甲醛熏蒸，甲醛加量約0.15 L/m3，并適當(dāng)延長(zhǎng)空消時(shí)間［1］。（6）加強(qiáng)車間和環(huán)境的清潔衛(wèi)生，定期對(duì)環(huán)境進(jìn)行消毒，杜絕雜菌的生長(zhǎng)和繁殖機(jī)會(huì)。

4 總結(jié)

和所有其他發(fā)酵行業(yè)一樣，腈水合酶發(fā)酵生產(chǎn)中。盡管造成染菌的原因極其復(fù)雜，生產(chǎn)環(huán)節(jié)眾多、影響因素錯(cuò)綜復(fù)雜，各工廠生產(chǎn)設(shè)備和生產(chǎn)環(huán)境又各不相同，但是實(shí)踐證明，染菌是完全可以控制的。只要我們思想重視，工作和操作認(rèn)真、仔細(xì)、負(fù)責(zé)，加強(qiáng)管理，建立必要的規(guī)章制度和操作規(guī)程，要樹立防重于治的思想，操作嚴(yán)格、工藝和設(shè)備合理，重視各個(gè)工作環(huán)節(jié)，避免產(chǎn)生染菌的隱患，是能夠防止或減少染菌的。一旦出現(xiàn)染菌，就要仔細(xì)分析造成染菌的原因，采取有效的措施，排除和消除各個(gè)環(huán)節(jié)中存在的問題，可以盡快克服和解決染菌，減少損失，同時(shí)降低生產(chǎn)染菌率，確保生產(chǎn)正常進(jìn)行。

[1].鄔顯章.《酶的工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)》, [M].吉林：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，1988：258-285.

[2].天津輕工學(xué)院等.《氨基酸工藝學(xué)》, [M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1991：151-162.

[3].T Suami，S Ogawa，N Chida. The revised structure of validamycin A [J]. Journal of Antibiotics,1980,33(1):98-99.

[4]. Wang Z M , Liang X T , Chen S F .gnetifolin A [J] .Chinese Chemical Letters,1995,6(8):683-686.

［5］.錢存柔等.《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》, [M].北京：北京大學(xué)出版社,1985：192-204.

The Route and Analysis of Microbiological Contaninationin the Fermentation of Nitrile Hydratase

Zhuang xianjun,Wu congwei
(Zhejiang xin yong biological chemical co., ltd,Zhejiang Ningbo,315204)

In order to find out the infection causes, take effective measures, to reduce fermentation bacteria contamination caused by the loss to a minimum, with many years of ferment and acrylamide industry work experience, the microbial production of acrylamide in industry contamination types and reasons were roughly analyzed.

Fermentation; Contanination; Cause analysis

TQ223

A

2096-0387（2016）04-0062-03

莊賢軍（1968-），男，浙江寧波人，工程師，工學(xué)學(xué)士，研究方向：微生物丙烯酰胺的工業(yè)化生產(chǎn)和研究。