盧 云,臧志和,廖昌軍
(成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,四川成都610083)
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GC-MS測定小鼠血漿中1,8-桉葉素含量及其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)研究
盧云,臧志和,廖昌軍
(成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,四川成都610083)
摘要:采用GC-MS法測定小鼠灌胃1,8-桉葉素后不同時(shí)間點(diǎn)血漿中藥物濃度,利用藥動(dòng)學(xué)軟件DAS3.0計(jì)算1,8-桉葉素在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示:1,8-桉葉素在0.5~8mg/L范圍內(nèi),濃度與峰面積比值呈良好的線性關(guān)系。血藥濃度數(shù)據(jù)經(jīng)藥動(dòng)學(xué)軟件DAS3.0處理后,Cmax為17.46mg/L,tmax為10 min,t1/2為155.70min。GC-MS法測定1,8-桉葉素具有快速、準(zhǔn)確和靈敏度高的特點(diǎn),藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)可為1,8-桉葉素體內(nèi)抗菌治療作用研究提供理論依據(jù)。
關(guān)鍵詞:GC-MS法;藥代動(dòng)力學(xué):含量測定;1,8-桉葉素
桉樹是桃金娘科桉屬植物的總稱,是澳大利亞木本植物中最具代表性的樹種。中國于1890年引入桉樹,20世紀(jì)50~60年代,廣東、廣西、海南等地成為主要產(chǎn)區(qū)。目前,我國桉樹生產(chǎn)已經(jīng)成為世界第三位,多用于造紙[1]。桉葉油是從桃金娘科植物藍(lán)桉或其同屬其他植物的葉中提取而來的揮發(fā)油,主要用于醫(yī)療、香料、工業(yè)[2]。醫(yī)用桉葉油中1,8-桉葉素(又名桉葉油醇)是主要成分,其他含量較高的成分有α-蒎烯,β-蒎烯,α-松油醇,4-萜品醇等萜類成分[3-4]。藥理研究表明,桉葉油具有抗菌消炎、抗寄生蟲和殺蟲、抗癌、抗氧化、降壓、促滲透、改善呼吸道功能等作用[5-10]。隨著抗菌藥物的廣泛使用,出現(xiàn)了多藥耐藥菌、泛耐藥菌[11-14],這為細(xì)菌感染治療帶來了極大的難題。桉葉油作為一種天然產(chǎn)物,具有體外抗菌作用,可為體內(nèi)細(xì)菌感染治療提供新方法。本文旨在建立GC-MS測定小鼠血漿中1,8-桉葉素含量的方法,并研究1,8-桉葉素在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),為體內(nèi)抗感染治療作用研究提供理論依據(jù)。
1.1儀器
電子天平(CPA225D,德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司公司);渦旋混合器(XW-80A,上海青浦瀘西儀器廠);離心機(jī)(Heraeur Pico 17,ThermoFisher);氣質(zhì)聯(lián)用儀(5973,安捷倫科技有限公司)。
1.2試劑
1,8-桉葉素對(duì)照品(批號(hào):20140210,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.5%,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙酸丁酯(批號(hào):20120605);環(huán)己烷(批號(hào):2015051201),桉葉油(實(shí)驗(yàn)室水蒸氣蒸餾法提?。?。
1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
昆明小鼠66只(雌雄各半),SPF級(jí),由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,許可證號(hào)為scxk(川)2013-24。
2.1色譜條件及質(zhì)譜條件
色譜條件:毛細(xì)管柱HP-5MS(30 m×0.25 mm× 0.25 μm),載氣為氦氣,進(jìn)樣口溫度250℃,分流比20∶1,柱流量1mL/min;升溫程序:40℃保持3min,以20℃/min升溫至250℃,保持2.5min。
質(zhì)譜條件:離子源EI,離子源溫度250℃,電子能量70eV,掃描范圍30~300amu,掃描速度3.8scans/s,進(jìn)樣量1μL。
2.2樣品處理
取小鼠血漿0.18mL,加入0.02mL乙酸丁酯儲(chǔ)備液,渦旋振蕩5min,加入環(huán)己烷0.4mL,渦旋振蕩5min,離心(13300r/min)10min后取上清液待測。
2.3對(duì)照品溶液的配制
精密稱取1,8-桉葉素對(duì)照品105.0mg于100mL容量瓶,環(huán)己烷定容,搖勻即得質(zhì)量濃度為1.05 mg/mL 的1,8-桉葉素對(duì)照品儲(chǔ)備液,冷藏于4℃冰箱備用。
2.4內(nèi)標(biāo)液配制
精密稱取乙酸丁酯10 mg于10 mL容量瓶,環(huán)己烷定容,取上述溶液0.1mL于10mL容量瓶,環(huán)己烷定容,搖勻即得濃度為0.01mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,冷藏于4℃冰箱備用。
3.1方法專屬性考察
取空白血漿、對(duì)照品添加空白血漿樣品、含藥血漿樣品按照“2.1”項(xiàng)條件,分別進(jìn)樣1 μL,內(nèi)標(biāo)物乙酸丁酯的保留時(shí)間約為4.340min,1,8-桉葉素的保留時(shí)間約為6.988min,二者峰形良好且分離完全,血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品測定(見圖1~圖5)。
3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍
圖1 空白血漿色譜圖
圖2 對(duì)照品色譜圖
圖3 血漿樣品色譜圖
分別取“2.3”項(xiàng)下1,8-桉葉素對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1,0.2,0.4,0.8,1.6 mL于5個(gè)10 mL容量瓶,環(huán)己烷定容,搖勻。取5份小鼠空白血漿,每份0.18mL,加入0.02mL乙酸丁酯儲(chǔ)備液,依次加入上述1,8-桉葉素對(duì)照品儲(chǔ)備液0.02 mL,渦旋振蕩5 min,分別加入環(huán)己烷0.38mL,渦旋振蕩5min,離心(13 300 r/min)10min,取上清液,得1,8-桉葉素質(zhì)量濃度分別為0.5,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/L的系列血漿對(duì)照液,分別進(jìn)樣1μL。記錄1,8-桉葉素及乙酸丁酯內(nèi)標(biāo)峰面積。以1,8-桉葉素峰面積與乙酸丁酯峰面積的比值為縱坐標(biāo),以1,8-桉葉素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得到1,8-桉葉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.0998x-0.0327,r2=0.9991。結(jié)果表明:1,8-桉葉素在0.5~8mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
圖4 乙酸丁酯質(zhì)譜圖
圖5 1,8-桉葉素質(zhì)譜圖
3.3精密度試驗(yàn)
按照“3.2”項(xiàng)下方法配制質(zhì)量濃度分別為0.5,1.0,4.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品,連續(xù)進(jìn)樣5次,結(jié)果表明1,8-桉葉素標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品精密度良好(見表1)。
3.4加樣回收率實(shí)驗(yàn)
取0.09 mL灌胃10 min后的小鼠血漿9份,加入乙酸丁酯儲(chǔ)備液0.02mL,分別加入不同體積的1,8-桉葉素對(duì)照品溶液和環(huán)己烷,配制成低、中、高濃度的血漿樣品,渦旋振蕩5min,離心(13300r/min)10min后取上清進(jìn)樣。記錄內(nèi)標(biāo)和樣品峰面積,計(jì)算回收率,結(jié)果見表2。可以看出,低、中、高濃度藥血漿樣品的加樣回收率分別為96.79%、100.96%和99.31%,且RSD%均<5%,符合要求。
3.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
日內(nèi)穩(wěn)定性:將處理好的血漿樣品溶液,1d內(nèi)每隔2h測1次,一共檢測3次,計(jì)算得1,8-桉葉素峰面積比值的RSD為2.89%。
表1 1,8-桉葉素精密度(n=5)
表2 1,8-桉葉素加樣回收率(n=3)
日間穩(wěn)定性:將處理好的血漿樣品溶液,1d測1次,連續(xù)測3d,計(jì)算得1,8-桉葉素峰面積比值的RSD為4.32%。
3.6含量測定
將66只小鼠(雌雄各半)隨機(jī)分成6組,每組11只,禁食不禁水12 h,均灌以3.2 g/kg桉葉油,于給藥前和給藥5,10,15,20,25,30,45,60,90,120min后斷頭取血(取血量≥0.2 mL),按照“2.2”項(xiàng)下方法處理樣品,進(jìn)樣1μL。不同時(shí)間點(diǎn)1,8-桉葉素的血藥濃度見表3。
3.7藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)
將“3.6”項(xiàng)下6組血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)代入DAS3.0藥動(dòng)學(xué)軟件,經(jīng)處理,1,8-桉葉素的平均藥-時(shí)曲線見圖6,藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表4。
表3 小鼠灌胃后不同時(shí)間點(diǎn)1,8-桉葉素的血藥濃度(n=6)
圖6 1,8-桉葉素平均藥-時(shí)曲線圖(n=6)
表4 1,8-桉葉素主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=6)
結(jié)果顯示,口服給藥后1,8-桉葉素在10min左右血藥濃度達(dá)到高峰,平均達(dá)峰濃度約為17.46mg/L,消除半衰期約為155.70 min,表明1,8-桉葉素在小鼠體內(nèi)口服吸收迅速,達(dá)峰時(shí)間較短,體內(nèi)作用時(shí)間較長。
4.1內(nèi)標(biāo)物篩選
以1,8-桉葉素沸點(diǎn)為依據(jù),選取N,N-二甲基甲酰胺、水楊酸甲酯和乙酸丁酯為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)以N,N-二甲基甲酰胺、水楊酸甲酯作內(nèi)標(biāo)時(shí)峰形不理想,影響樣品的測定。而以乙酸丁酯作內(nèi)標(biāo),兩者分離完全,且峰型好。
4.2血漿樣品前處理
預(yù)實(shí)驗(yàn)階段,曾以乙醇為溶劑處理血漿樣品,溶解性好且可以沉淀蛋白,但乙醇用量較大,須濃縮上清液,樣品回收率顯著下降。而以環(huán)己烷為提取溶劑用量小,不須揮干,直接渦旋、離心后取上清液進(jìn)樣。樣品測定無干擾,結(jié)果滿意。
本文建立了GC-MS測定血漿樣品中1,8-桉葉素含量的方法,該方法樣品前處理簡單,能夠快速、準(zhǔn)確地測定血漿樣品中1,8-桉葉素含量。同時(shí)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明該藥物在小鼠體內(nèi)口服吸收迅速,出峰時(shí)間較短,半衰期較長,可為進(jìn)行體內(nèi)抗菌治療作用研究提供理論依據(jù)。
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(編輯:莫婕)
Determination of 1,8-cineole in mouse plasma by GC-MS and pharmacokinetic parameters study in vivo
LU Yun,ZANG Zhihe,LIAO Changjun
(The Chengdu Medical College School of Pharmacy,Chengdu 610083,China)
Abstract:This paper aims to determine the concentration of 1,8-cineole in mouse plasma at different time-points by GC-MS after a separate gavage with moderate dose of eucalyptus oil and to calculate the pharmacokinetic parameters in mouse plasma with pharmacokinetic software DAS3.0. After the study,the ratio of concentration and peak area shows a good linear relationship within the concentration range of 0.5-8 mg/L. After the concentration data was treated with DAS3.0,it reveals that Cmaxis 17.46mg/L,tmaxis 10min,t1/2is 155.70 min. This method is rapid,accurate and highly sensitive. The pharmacokinetic parameters can be used as theoretical support for in-vivo antibacterial treatment of 1,8-cineole.
Keywords:GC-MS;pharmacokinetic;content determination;1,8-cineole
通訊作者:臧志和(1955-),男,河北樂亭縣人,教授,主要從事教學(xué)管理工作。
作者簡介:盧云(1990-),女,湖北咸寧市人,碩士研究生,專業(yè)方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)與藥代動(dòng)力學(xué)研究。
基金項(xiàng)目:四川省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(120486)成都醫(yī)學(xué)院科研資助項(xiàng)目(CYZ13-028)
收稿日期:2015-09-13;收到修改稿日期:2015-10-09
doi:10.11857/j.issn.1674-5124.2016.02.013
文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
文章編號(hào):1674-5124(2016)02-0059-04