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    哈維氏弧菌qnr基因的克隆及原核表達(dá)條件優(yōu)化

    2016-04-06 08:06:26湯菊芬高增鴻簡(jiǎn)紀(jì)常吳灶和
    關(guān)鍵詞:原核表達(dá)優(yōu)化

    周 維,湯菊芬,高增鴻,甘 楨,簡(jiǎn)紀(jì)常,吳灶和,丁 燏

    (1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,廣東 湛江 524088;2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 湛江 524088;3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,廣東 廣州 510225)

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    哈維氏弧菌qnr基因的克隆及原核表達(dá)條件優(yōu)化

    周維1,2,湯菊芬1,2,高增鴻1,甘楨1,2,簡(jiǎn)紀(jì)常1,2,吳灶和2,3,丁燏1,2

    (1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,廣東湛江524088;2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江524088;3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,廣東廣州510225)

    摘要:根據(jù)GenBank中公布的哈維氏弧菌qnr基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增哈維氏弧菌qnr 序列,將其插入pET-32a質(zhì)粒,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32-qnr,并對(duì)誘導(dǎo)溫度、時(shí)間、IPTG濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,哈維氏弧菌qnr全長(zhǎng)651 bp,編碼216個(gè)氨基酸;重組蛋白優(yōu)化條件為于28 ℃、IPTG濃度為0.05 mmol/L條件下誘導(dǎo)6 h。關(guān)鍵詞:哈維氏弧菌;qnr基因;原核表達(dá);優(yōu)化

    哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)隸屬于弧菌科(Vibrionaeeae),弧菌屬(Vibrio),是一種嗜鹽性革蘭陰性菌,彎桿狀,極生單鞭毛[1-2],主要分布于海洋環(huán)境和海洋生物體中,是多種海洋魚類和無(wú)脊椎動(dòng)物的條件致病菌[3-4],在對(duì)蝦幼體階段危害尤為嚴(yán)重,曾導(dǎo)致斑節(jié)對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦幼體大量死亡[5-7],給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。目前,國(guó)內(nèi)弧菌病的防治主要依賴于抗生素和化學(xué)藥物,喹諾酮類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛,水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的細(xì)菌對(duì)此類藥物的耐藥性日趨顯著[8-10],且部分耐藥菌可將其耐藥基因或耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)移給其他菌株,甚至通過食物鏈傳遞而威脅人類健康[11-12]。1998年,在細(xì)菌質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)可水平傳播的喹諾酮類耐藥基因qnr[13],其編碼的蛋白可保護(hù)喹諾酮類藥物的作用靶酶(DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV),從而降低細(xì)菌對(duì)此類藥物敏感性。隨后在多種細(xì)菌的染色體和質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)了一系列qnr基因家族[14-21],并有很多證據(jù)支持水生來源的微生物是質(zhì)粒上qnr的最初來源,其中包括弧菌[15-16,20]。qnr基因的廣泛分布和多變異性暗示有更多qnr基因尚待發(fā)現(xiàn)。

    隨著基因測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和推廣,許多細(xì)菌的基因組已經(jīng)完成測(cè)序,目前,在水生細(xì)菌哈維氏弧菌的全基因組中也發(fā)現(xiàn)了qnr相似基因,但尚無(wú)其功能和作用的研究報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)首次從哈維氏弧菌基因組中擴(kuò)增出qnr基因,并構(gòu)建重組表達(dá)菌株,對(duì)融合蛋白表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化,為進(jìn)一步研究哈維氏弧菌染色體上qnr基因編碼蛋白的特性和功能,以及細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1菌株和載體哈維氏弧菌ZJ0603分離自廣東省湛江海域患病紅笛鯛(Lutjanus sanguineus),分離鑒定后由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。克隆載體pMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司,表達(dá)載體pET-32a、大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α以及表達(dá)菌株BL21(DE3)均由該實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.1.2主要試劑ExTaq DNA聚合酶,r Taq DNA聚合酶,限制性核酸內(nèi)切酶BamH I、 Xho I,T4連接酶購(gòu)自TaKaRa公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific)公司。氨芐西林(Amp+)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自上海生工有限公司??捡R斯亮藍(lán)快速染色液購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2方法

    1.2.1哈維氏弧菌菌株的活化及基因組DNA的提取將-

    80 ℃保存的哈維氏弧菌ZJ0603接種于TSA平板上,于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18 h后挑取單菌落接種于含20 mg/mL NaCl 的TSB液體培養(yǎng)基,于28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)12~16h,收集菌液2~5 mL于離心管中,并參照試劑盒說明書提取細(xì)菌DNA。

    1.2.2qnr基因的擴(kuò)增根據(jù)GenBank上哈維氏弧菌全基因組(登錄號(hào)CP009468.1)預(yù)測(cè)的喹諾酮類耐藥基因qnr序列,通過primer 5.0設(shè)計(jì)上游引物QF:5'-CGCGGATCCA TGATTAAGACCGATCTC A-3';下游引物QR:5'-CCGCTCGAGCTAAATAAC GATCAGGCCAA-3',下劃線部分分別為BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基。以1.2.1中提取的DNA為模板,用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增目的基因片段(PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,55 ℃40 s,72 ℃ 60 s,35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min)。將純化后PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài),在含100 μg/mL Amp+的LB平板上培養(yǎng)10~14 h,挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定,并將陽(yáng)性克隆送至上海生物工程有限公司測(cè)序,并用BLAST分析比對(duì)序列。

    1.2.3表達(dá)載體的構(gòu)建提取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pMD18-qnr和表達(dá)質(zhì)粒pET-32a,用BamH I、Xho I于37 ℃恒溫水浴鍋中酶切2 h,回收目的條帶和載體,并用T4連接酶連接10 h后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。通過含氨芐的LB抗性平板篩選并結(jié)合菌落PCR,挑選陽(yáng)性克隆送測(cè)。提取陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒pET32-qnr轉(zhuǎn)化至BL21(DE3),同樣挑選陽(yáng)性克隆送測(cè)。

    1.2.4融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將測(cè)序正確的含重組質(zhì)粒的表達(dá)菌株接種于終濃度為100 μg/mL Amp+的LB液體培養(yǎng)基,當(dāng)D(600 nm)為0.4~0.6時(shí),加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,37 ℃條件下誘導(dǎo)5 h后收集細(xì)菌,提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,同時(shí)以未誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒pET32-qnr的表達(dá)菌株及含空質(zhì)粒pET-32a的BL21(DE3)表達(dá)菌株誘導(dǎo)前后作對(duì)照。

    1.2.5原核表達(dá)條件優(yōu)化將構(gòu)建成功的重組表達(dá)菌株從溫度、時(shí)間、IPTG濃度3個(gè)方面進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化。

    1)溫度。在28、37 ℃條件下(IPTG終濃度為0.5 mmol/L)誘導(dǎo)5 h,分別收集10 mL菌液后置于冰上進(jìn)行超聲破碎,程序?yàn)椋汗β?00 W,超聲5 s,間隔5 s,超聲破碎約15 min至菌液澄清。取離心后的菌體裂解液的上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

    2)時(shí)間。其他條件不變,在誘導(dǎo)后的1、2、3、4、5、6、7 h分別收集菌體,進(jìn)行SDS-PAGE分析。

    3)IPTG濃度。其他條件不變,在 IPTG濃度為0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mmol/L下誘導(dǎo),分別處理菌體,進(jìn)行SDS-PAGE分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1目的基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果

    根據(jù)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增到一長(zhǎng)約600 bp的條帶,而未加DNA模板的陰性對(duì)照未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶(圖1),菌落PCR的擴(kuò)增結(jié)果與目的條帶大小相符(圖1)。經(jīng)測(cè)序,擴(kuò)增的基因開放閱讀框(ORF)為651 bp,編碼216個(gè)氨基酸,BLAST比對(duì)結(jié)果表明,與哈維氏弧菌ATCC33843的Qnr編碼氨基酸序列同源性為99%,與霍亂弧菌(Vibrio cholerae)染色體上QnrB1(EKM30619.1)的同源性為96%,與副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)Qnr(WP_005482928.1)同源性為78%,具有Qnr蛋白特有的五肽重復(fù)序列。將該序列提交至GenBank,登錄號(hào)為KT633378。根據(jù)推導(dǎo)的Qnr氨基酸序列,預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量為24.5 ku,理論等電點(diǎn)為4.75。

    圖1 qnr基因PCR擴(kuò)增和菌落PCR鑒定Fig.1 Cloning and colony identification by PCR of qnr gene

    2.2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

    提取陽(yáng)性菌落的重組質(zhì)粒pMD18-qnr,雙酶切鑒定結(jié)果如圖2。圖2可見,BamH I和Xho I雙酶切pMD18-qnr后獲得兩條帶,其中目的條帶與直接擴(kuò)增的qnr條帶大小一致,經(jīng)測(cè)序比對(duì)證實(shí)為qnr目標(biāo)基因序列,表明qnr的克隆載體構(gòu)建成功。回收目的片段與雙酶切后pET-32a 連接、轉(zhuǎn)化后,同樣挑選陽(yáng)性菌落進(jìn)行雙酶切鑒定,得到兩個(gè)片段(圖2),測(cè)序未發(fā)現(xiàn)有突變及錯(cuò)配現(xiàn)象,說明pET32-qnr表達(dá)載體構(gòu)建成功。

    2.3融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

    將測(cè)序正確的pET32-qnr重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后,在37℃條件下經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h,得到分子質(zhì)量約為42.5 ku的融合蛋白(圖3),其中預(yù)測(cè)的Qnr分子質(zhì)量為24.5 ku,pET32a表達(dá)的標(biāo)簽蛋白約為18 ku(圖3)。未誘導(dǎo)的菌及誘導(dǎo)的含空質(zhì)粒的菌均沒有出現(xiàn)目的條帶,說明融合蛋白成功表達(dá)。

    圖2 qnr基因克隆載體及原核表達(dá)載體的鑒定Fig.2 Identification of cloning and prokaryotic expression vector of qnr

    圖3 融合蛋白的原核表達(dá)Fig.3 Prokaryotic expression of pET32-qnr recombinant protein

    2.4原核表達(dá)條件優(yōu)化

    圖4表明,在37℃誘導(dǎo)條件下,目的蛋白主要存在于菌體裂解液的沉淀中,在菌體裂解液上清中含量極低,在28℃誘導(dǎo)條件下,目的蛋白在菌體裂解液沉淀和上清中均有表達(dá),且表達(dá)量高于37℃下的表達(dá)量。這說明目的蛋白Qnr的最佳誘導(dǎo)溫度是28℃,主要以包涵體形式存在。時(shí)間優(yōu)化結(jié)果(圖4)表明,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加蛋白表達(dá)量隨之增加,誘導(dǎo)6 h時(shí)表達(dá)量最高,之后蛋白表達(dá)量開始下降,因此,目的蛋白Qnr的最佳誘導(dǎo)時(shí)間是6 h。圖4可見,用0.05~1.00 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的目的蛋白表達(dá)量均較高。由于 IPTG具有細(xì)胞毒性,高濃度IPTG反而會(huì)妨礙細(xì)菌生長(zhǎng),因此最佳誘導(dǎo)濃度定為0.05 mmol/L。

    圖4 融合蛋白誘導(dǎo)條件的優(yōu)化Fig.4 The optimization inducing conditions of the pET32-qnr fusion protein

    3 討 論

    養(yǎng)殖水體細(xì)菌及噬菌體種類、數(shù)量繁多,成為耐藥基因孕育和傳播的主要溫床。一些由細(xì)菌染色體介導(dǎo)的耐藥基因可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因重組等方式進(jìn)行水平傳播,造成了海洋細(xì)菌耐藥機(jī)制的多樣性和傳播途徑的復(fù)雜性,抗生素的濫用促使細(xì)菌耐藥性的傳播和擴(kuò)散速度更加廣泛和迅速[22]。因此,研究耐藥基因的來源和特征對(duì)于耐藥菌的預(yù)防和控制很有必要。對(duì)于臨床耐藥菌中質(zhì)粒上qnr基因的起源和進(jìn)化研究表明,質(zhì)粒上的qnr基因很可能源自水產(chǎn)細(xì)菌的染色體,且通過水平傳播而來[14]。有學(xué)者[15]克隆了海洋中創(chuàng)傷弧菌Vibrio vulnificus、副溶血弧菌V.parahaemolyticus等參考菌株染色體上的qnr相似基因,分析其與腸桿菌中質(zhì)粒上QnrA、QnrB 和QnrS蛋白的同源性為40%~67%,并在大腸桿菌里表達(dá),結(jié)果含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌對(duì)喹諾酮類藥物的敏感性均有所降低,表明水環(huán)境中的弧菌科很可能是喹諾酮耐藥蛋白Qnr的儲(chǔ)藏庫(kù),弧菌科中已知的qnr相似序列有助于發(fā)現(xiàn)其他細(xì)菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的新型qnr基因。之后用同樣的方法又發(fā)現(xiàn)燦爛弧菌(V.splendidus)是質(zhì)粒上QnrS家族的來源[16]。Sanchez等[17]在宏基因組里找到了多種水產(chǎn)細(xì)菌染色體的潛在qnr基因,并證實(shí)了嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)染色體上Smqnr編碼的蛋白為喹諾酮耐藥蛋白。本研究在海洋中常見的條件致病菌哈維氏弧菌的基因組里也發(fā)現(xiàn)了潛在的qnr基因,并通過序列分析發(fā)現(xiàn)其同源性與霍亂弧菌QnrB1(EKM30619.1)和副溶血弧菌Qnr(WP_005482928.1)同源性很高,分別為98%和78%,且具有五肽重復(fù)序列,與已證實(shí)的Qnr蛋白的結(jié)構(gòu)特征相符,說明哈維氏弧菌同其他弧菌一樣,其染色體上的qnr基因是一種潛在的可水平傳播的耐藥基因。

    隨著越來越多qnr基因的發(fā)現(xiàn),對(duì)Qnr蛋白結(jié)構(gòu)的研究也進(jìn)一步深入。已克隆、表達(dá)、純化嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的AhQnr,并獲得晶體結(jié)構(gòu),找出其與DNA促旋酶相互作用的功能結(jié)構(gòu)域,揭示了革蘭陰性細(xì)菌中Qnr蛋白和DNA促旋酶相互作用的一種普遍機(jī)制[19]。為獲得哈維氏弧菌的Qnr蛋白,本研究擴(kuò)增了哈維氏弧菌染色體上qnr基因,得到一段長(zhǎng)為651 bp的序列,并將其在大腸桿菌里表達(dá),獲得帶有標(biāo)簽蛋白的融合蛋白。選用的表達(dá)系統(tǒng)為大腸桿菌pET32表達(dá)系統(tǒng),載體含有噬菌體T7啟動(dòng)子,可在含有T7噬菌體RNA聚合酶基因(位于λ 噬菌體DE3區(qū))的BL21(DE3)菌株中表達(dá)外源蛋白,具有轉(zhuǎn)化效率高、生長(zhǎng)繁殖快、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[23-24]。此外,重組蛋白的表達(dá)水平還與誘導(dǎo)條件有關(guān),如溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度等[25]。為提高表達(dá)水平,優(yōu)化此3方面的表達(dá)條件,結(jié)果發(fā)現(xiàn),低溫條件下獲得的蛋白較多,且更易獲得活性蛋白,這可能是由于低溫可降低細(xì)菌生長(zhǎng)速度,增加重組質(zhì)??截悢?shù),最終增加融合蛋白的表達(dá)量,且低溫有助于蛋白正確折疊,高溫下易形成包涵體。本研究中,在誘導(dǎo)6 h后蛋白表達(dá)量最高,之后隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加,蛋白表達(dá)量反而下降,這說明誘導(dǎo)時(shí)間并非越長(zhǎng)越好。原因可能是隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物增多,培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量消耗,不利于外源蛋白的積累。而IPTG濃度對(duì)重組蛋白的表達(dá)量影響不大,在低濃度(0.05 mmol/L)下即可獲得大量蛋白。最終確定的表達(dá)重組蛋白的最佳條件為:在28 ℃、IPTG濃度為0.05 mmol/L條件下誘導(dǎo)6 h。所得哈維氏弧菌Qnr蛋白為進(jìn)一步研究蛋白純化,蛋白的結(jié)構(gòu)和功能以及細(xì)菌的耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ),并為發(fā)現(xiàn)新型的喹酮類耐藥基因和蛋白提供一定依據(jù)。

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    (責(zé)任編輯:劉慶穎)

    Cloning and Optimization of Prokaryotic Expression of Quinolone Resistance Gene in Vibrio harveyi

    ZHOU Wei1,2,TANG Ju-fen1,2,GAO Zeng-hong1,GAN Zhen1,2,JIAN Ji-chang1,2,WU Zao-he2,3,DING Yu1,2
    (1.Fisheries College of Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China; 2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals,Zhanjiang 524088,China; 3.Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China)

    Abstract:The sequence of quinolone resistance gene of Vibrio harveyi was cloned based on the qnr of Vibrio harveyi published on GenBank and then inserted into the pET-32a vector to construct prokaryotic expression plasmid pET32-qnr.Then the expression conditions of temperature,induction time,and IPTG concentration of the pET32-qnr were optimized.The results showed that the complete open reading frame(ORF)length of qnr gene was 651 bp,encoding a protein of 216 amino acids.The optimization conditions of inducible expression for Qnr protein were inducing in 0.05 mmol/L IPTG for 6 hours at 28 ℃.

    Key words:Vibrio harveyi; quinolone resistance gene; prokaryotic expression; optimization

    通信作者:丁燏(1971-),男,博士,教授,研究方向?yàn)樗a(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物免疫學(xué)及病害控制。E-mail:dingy@gdou.edu.cn

    基金項(xiàng)目:農(nóng)業(yè)部行業(yè)專項(xiàng),漁藥使用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及其控制技術(shù)研究與示范(201203085); 廣東省教育廳高等學(xué)校高層次人才項(xiàng)目(谷胱甘肽及其合成酶系在哈氏弧菌耐藥中的作用機(jī)制研究)。

    收稿日期:2015-10-08

    doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2016.01.016

    中圖分類號(hào):Q786;Q939.1

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):1673-9159(2016)01-0093-05

    第一作者:周維(1990-),女,碩士研究生,研究方向?yàn)樗a(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害防治。E-mail:zw199008 @163.com

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