大蒜素聯(lián)合5-FU對(duì)腺樣囊性癌ACC-M裸鼠移植瘤的抑制作用

車(chē)超，吳發(fā)印，李華林，周鶴峰

(1.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬珠海醫(yī)院口腔科，廣東珠海519100；2.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物工程系，廣東珠海519041)

·論著·

大蒜素聯(lián)合5-FU對(duì)腺樣囊性癌ACC-M裸鼠移植瘤的抑制作用

車(chē)超1，吳發(fā)印1，李華林1，周鶴峰2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬珠海醫(yī)院口腔科，廣東珠海519100；2.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物工程系，廣東珠海519041)

目的探討大蒜素聯(lián)合5-FU對(duì)腺樣囊性癌ACC-M裸鼠移植瘤的抑制作用。方法建立ACC-M細(xì)胞Balb/c裸鼠肩胛下移植瘤模型30只。造模2周后挑選24只腫瘤大小較均勻的裸鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(大蒜素組、5-FU組和大蒜素聯(lián)合5-FU組)和對(duì)照組，各6只。實(shí)驗(yàn)組按照體質(zhì)量0.01 mL/g腹腔注射大蒜素和5-FU濃度均為20 μg/mL，對(duì)照組注射0.9%PBS液，每?jī)商煲淮?，?次，末次注射1周后處死動(dòng)物。測(cè)量移植瘤的體積變化，HE染色觀察移植瘤的病理學(xué)改變。結(jié)果移植瘤體積變化比較結(jié)果：各實(shí)驗(yàn)組移植瘤體積明顯縮小，5-FU組體積小于大蒜素組，大蒜素聯(lián)合5-FU組與大蒜素組、5-FU組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；鏡下見(jiàn)對(duì)照組的癌細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，異型率高，而各實(shí)驗(yàn)組的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)不同程度減少，間質(zhì)增加，大蒜素聯(lián)合5-FU組最為明顯。結(jié)論大蒜素和5-FU均能有效抑制ACC-M細(xì)胞Balb/c裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，且大蒜素聯(lián)合5-FU的抑制作用明顯強(qiáng)于大蒜素或5-FU單獨(dú)使用。

大蒜素；5-FU；腺樣囊性癌；裸鼠；移植瘤

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)一般發(fā)生在口腔頜面部的唾液腺組織中，是一種易復(fù)發(fā)、易沿神經(jīng)擴(kuò)散以及易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，其對(duì)放療和化療的敏感性較低，具有較高的死亡率[1]。常用的化療藥物有5-FU、長(zhǎng)春新堿、紫杉醇等，但其對(duì)腺樣囊性癌的治療有效率不高，且容易發(fā)生耐藥性[2]。近年來(lái)的研究表明，大蒜素對(duì)各種癌癥具有明顯的抑制作用，已成為近期抗癌研究的熱點(diǎn)[3-6]，且已有研究表明大蒜素和大蒜油均對(duì)體外培養(yǎng)的腺樣囊性癌細(xì)胞系(ACC-M)具有抑制作用[7-8]。因此大蒜素作為輔助化療藥物既可減輕單純化療藥物對(duì)于正常細(xì)胞的殺傷，又可增強(qiáng)化療藥物的藥學(xué)作用。本研究通過(guò)建立ACC-M細(xì)胞Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型，探討大蒜素聯(lián)合5-FU對(duì)腺樣囊性癌的抑制作用，為進(jìn)一步拓展其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞系由武漢大學(xué)保藏中心提供；大蒜素注射液和5-FU分別由廣州皖冬生物科技有限公司和上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；胎牛血清及DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自凱基公司；BALB/c-nude T淋巴細(xì)胞缺陷型小鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。所購(gòu)30只裸鼠均為雌性，5～6周齡，體質(zhì)量(18±2)g，健康狀況良好，動(dòng)物合格證號(hào)為No.11401300035243。將其飼養(yǎng)在常規(guī)SPF級(jí)管理的華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的無(wú)菌密閉籠具中，確?；\具獨(dú)立通風(fēng)，室溫為18℃～22℃，濕度為50%～80%。

1.2 裸鼠異種移植與藥物干預(yù)方式

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞使用含有100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素及10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37°C以及含有5%CO2的條件下培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞使用胰酶消化后用培養(yǎng)基終止消化，PBS液洗滌、離心、去除上清，收集細(xì)胞。用PBS緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為約2×107個(gè)活細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液備用(使用臺(tái)盼藍(lán)染色確保細(xì)胞活力不低于95%)。

1.2.2 裸鼠造模將所購(gòu)裸鼠飼養(yǎng)1周以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，取前述細(xì)胞懸液無(wú)菌條件下在30只裸鼠右前肩胛下進(jìn)行皮下注射接種，每只0.2 mL。接種后2周可見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)，呈結(jié)節(jié)性、膨脹性生長(zhǎng)，質(zhì)硬。

1.2.3 模型分組與藥物干預(yù)造模2周后挑選24只腫瘤大小較均勻的裸鼠隨機(jī)分為4組(對(duì)照組、大蒜素組、5-FU組和大蒜素聯(lián)合5-FU組)，每組6只。對(duì)照組注射0.9%PBS，實(shí)驗(yàn)組注射的大蒜素和5-FU濃度均為20 μg/mL，每只裸鼠按照體重腹腔注射藥物0.01 mL/g，每2 d注射一次，共注射3次。末次注射一周后拉頸處死裸鼠，取出完整腫瘤組織。

1.3 計(jì)算瘤體積給藥前及末次給藥后1周，用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)以計(jì)算瘤體積(tumor volume，TV)：TV=ab2/2。

1.4 抑瘤率抑瘤率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤體積/對(duì)照組平均瘤體積)×100%。抑瘤率＞40%說(shuō)明有抑制作用。

1.5 HE染色組織病理學(xué)觀察將手術(shù)分離的腫瘤組織以10%甲醛固定，24 h后進(jìn)行石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，HE染色，在光鏡下觀察各組腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示移植瘤體積，抑瘤率以百分比表示，組間兩兩比較采用方差分析，校驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 計(jì)算平均瘤體積和抑瘤率第一次給藥前(TV1)對(duì)照組、大蒜素組、5-FU組、大蒜素聯(lián)合5-FU組的平均瘤體積比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.161＞0.05)。末次給藥后，1周大蒜素組、5-FU組、大蒜素聯(lián)合5-FU組平均瘤體積明顯小于對(duì)照組(P＜0.01)；聯(lián)合用藥組小于大蒜素組(P＜0.01)、小于5-FU組(P＜0.05)；5-FU組小于大蒜素組(P＜0.01)(表1)。大蒜素、5-FU單獨(dú)使用以及大蒜素聯(lián)合5-FU對(duì)裸鼠體內(nèi)ACC-M細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，且大蒜素聯(lián)合5-FU的抑制作用明顯強(qiáng)于大蒜素或5-FU單獨(dú)使用。

表1 各組移植瘤的體積變化及抑瘤率(±s)

表1 各組移植瘤的體積變化及抑瘤率(±s)

注：TV1各組平均瘤體積比較，P＞0.05；TV2各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，aP＜0.01，與大蒜素組比較，bP＜0.01，與5-FU組比較，cP＜0.05。

組別只數(shù)平均瘤體積(TV，mm3)抑瘤率(%) TV1TV2對(duì)照組大蒜素組5-FU組大蒜素聯(lián)合5-FU組6666 47.64±7.42 56.59±10.41 58.10±6.47 53.67±7.99 925.87±142.26 551.57±105.37a316.89±31.00ab138.14±13.86abc0 40 66 85

2.2 HE染色觀察裸鼠移植瘤移植瘤大體上呈結(jié)節(jié)性、膨脹性生長(zhǎng)，質(zhì)硬，外有薄膜包裹。HE染色觀察裸鼠移植瘤(×200)示：對(duì)照組(圖1)：可見(jiàn)大量癌細(xì)胞分布，且癌細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)不規(guī)則，呈高度異型性，其核大深染，核質(zhì)比例增大，核分裂相多見(jiàn)，鏡下腫瘤組織實(shí)質(zhì)多于間質(zhì)；大蒜素組(圖2)：可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞減少；5-FU組(圖3)：可見(jiàn)瘤組織大量壞死，癌細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞核腫大，部分核固縮；大蒜素聯(lián)合5-FU組(圖4)：可見(jiàn)大量腫瘤組織呈現(xiàn)片狀壞死，癌細(xì)胞增大且出現(xiàn)空泡變性，癌細(xì)胞數(shù)明顯減少，纖維組織增生。

圖1 對(duì)照組（×200）：腫瘤組織實(shí)質(zhì)多于間質(zhì)，癌細(xì)胞分布密集，且生長(zhǎng)旺盛，呈高度異型性；圖2大蒜素組（×200）：腫瘤細(xì)胞分布稀疏，可見(jiàn)部分壞死區(qū)域;圖35-FU組（×200）：腫瘤組織大量壞死，細(xì)胞核腫大，部分核固縮；圖4大蒜素聯(lián)合5-FU組（×200）：可見(jiàn)大量腫瘤組織呈現(xiàn)片狀壞死。癌細(xì)胞數(shù)明顯減少，且出現(xiàn)空泡變性。

3 討論

腺樣囊性癌曾被稱(chēng)為“圓柱瘤”，是一種易發(fā)于口腔頜面部唾液腺組織中的惡性腫瘤，其在各個(gè)年齡階段均有發(fā)生，目前人涎腺腺樣囊性癌的治療常規(guī)以手術(shù)治療結(jié)合術(shù)前術(shù)后放化療為主。5-FU是治療ACC的常用化療藥物，但療效往往不佳，主要系因其對(duì)放療和化療的敏感性均較低，療效不顯著，且手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)、易沿神經(jīng)擴(kuò)散以及易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，致使腺樣囊性癌患者出現(xiàn)較高的死亡率[1]。有關(guān)腺樣囊性癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未完全闡明，加上其對(duì)于藥物的敏感性較低，耐藥性較強(qiáng)，因此利用動(dòng)物模型研究其有效的防治方法顯得尤為重要。侯亞麗等[9]將人復(fù)發(fā)性涎腺腺樣囊性癌組織塊進(jìn)行裸鼠皮下移植，連續(xù)傳代4次，成功構(gòu)建了腺樣囊性癌裸鼠移植瘤模型，其結(jié)果表明與原代瘤相比，傳代瘤的潛伏期和體積倍增時(shí)間均較短。本研究將人腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞接種于裸鼠右前斜背部皮下，成功構(gòu)建了裸鼠皮下移植瘤模型，為進(jìn)一步研究其藥物防治提供基礎(chǔ)。

大量研究表明大蒜在防癌抗癌中均具有良好的作用，而大蒜素由大蒜提取而來(lái)，其含有多種含硫化合物，具有較強(qiáng)的殺菌作用，在防癌抗癌中也發(fā)揮重要作用[3-6]。王海燕等[10]研究發(fā)現(xiàn)大蒜素對(duì)兩種胃癌SGC-7901和MGC-803細(xì)胞均具有較強(qiáng)的殺傷作用，其可能通過(guò)直接殺傷胃癌細(xì)胞從而提高機(jī)體免疫來(lái)發(fā)揮抗癌作用。徐麗等[11]研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可促進(jìn)體外培養(yǎng)的NK細(xì)胞的增殖作用，抑制NK細(xì)胞的凋亡，并通過(guò)促進(jìn)NK細(xì)胞分泌IFN-γ提高其對(duì)腫瘤的殺傷能力。馬紅兵等[12]研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可抑制胰腺癌BXPC3細(xì)胞的生長(zhǎng)，且具有放射增敏的作用。5-FU是一種廣泛應(yīng)用于頭、頸、胸、胃腸和卵巢等部位惡性腫瘤的化療藥物，其作用機(jī)制為5-FU在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的活性產(chǎn)物能影響DNA和蛋白質(zhì)的合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[13]。但5-FU的不良反應(yīng)、對(duì)腺樣囊性癌較低的敏感性以及腺樣囊性癌對(duì)5-FU產(chǎn)生的耐藥性等導(dǎo)致其療效欠佳，因此5-FU與其他藥物進(jìn)行聯(lián)合用藥是目前研究的熱點(diǎn)。研究表明黃癸素和5-FU聯(lián)用對(duì)腺樣囊性癌Acc-3細(xì)胞的抑制作用比單藥使用更明顯[14]。Zou等[15]研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可通過(guò)ROS介導(dǎo)的線粒體途徑增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。王曉峰等[2]研究發(fā)現(xiàn)萊菔硫烷和5-FU聯(lián)合使用可協(xié)同抑制人高轉(zhuǎn)移唾液腺腺樣囊性癌細(xì)胞的增殖，且可能與細(xì)胞核NF-kB p65的表達(dá)受抑制有關(guān)。吳發(fā)印等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)大蒜素聯(lián)合5-FU以及大蒜油聯(lián)合5-FU均可有效抑制ACC-M細(xì)胞的生長(zhǎng)，且其作用明顯強(qiáng)于大蒜素、大蒜油或5-FU單獨(dú)使用。之前的研究是在細(xì)胞水平上探討大蒜素聯(lián)合5-FU的作用效果，本研究通過(guò)建立ACC-M細(xì)胞Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型，探討大蒜素聯(lián)合5-FU在動(dòng)物水平上對(duì)腺樣囊性癌的抑制作用。結(jié)果表明大蒜素、5-FU單獨(dú)使用以及大蒜素聯(lián)合5-FU對(duì)裸鼠體內(nèi)ACC-M細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，大蒜素的抑瘤率為40%，5-FU為66%，而大蒜素聯(lián)合5-FU組高達(dá)85%，即大蒜素聯(lián)合5-FU使用的抑制作用明顯強(qiáng)于大蒜素或5-FU單獨(dú)使用，可能是因?yàn)榇笏馑卦鰪?qiáng)了5-FU的藥效的同時(shí)減輕了其副作用，與5-FU聯(lián)合使用時(shí)對(duì)腺樣囊性癌有協(xié)同抑制作用。本研究進(jìn)一步證實(shí)了大蒜素和5-FU的抗癌作用，為拓展其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Inhibitory effects of allicin combined with 5-FU on adenoid cystic carcinoma ACC-M in nude mice model.

CHE Chao1,WU Fa-yin1,LI Hua-lin1,ZHOU He-feng2.1.Department of Stomatology,Zhuhai Hospital,the Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zhuhai 519100,Guangdong,CHINA;2.Department of Bioengineering,Zhuhai Campus,Zunyi Medical University,Zhuhai 519041,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of allicin combined with 5-fluorouracil(5-FU)on adenoid cystic carcinoma in nude mice models transplanted with ACC-M cells.MethodsThe nude mice xenograft models were established by subcutaneous injecting human adenoid cystic carcinoma cell line ACC-M into Balb/c nude mice.Twenty-four xenograft model rats were randomly divided into four groups(control group and three experimental groups of allicin group,5-FU group,and allicin combined with 5-FU group),with 6 rats in each group.The rates in the four groups received intraperitoneal injection of 0.01 mL/g medicine according to the weight of each nude mice,0.9% phosphate buffer saline(PBS),20 μg/mL allicin,20 μg/mL 5-FU,and 20 μg/mL allicin combined with 20 μg/mL 5-FU respectively,once per two days,for three times.The animals were executed after 1 week for measuring the xenograft tumor volume and observing the pathological changing by HE staining.ResultsThe xenograft tumor volume of three experimental groups had narrowed considerably.The tumor volume was significantly decreased in the 5-FU group compared with Allicin group,with statistically significant difference between allicin combined with 5-FU group and allicin group,5-FU group(P＜0.01).Under microscope,the cancer cells of the control group showed vigorous growth and high abnormal rate,while the cancer cells of the three experimental groups showed reduced quantity and increased intercellular substance to different extent,especially in allicin combined with 5-FU group.ConclusionAllicin and 5-FU can both effectively inhibit the growth of nude mice xenograft tumor of adenoid cystic carcinoma.And the inhibitory effects of allicin combined with 5-FU is more significant than either allicin or 5-FU used alone.

Allicin;5-fluorouracil;Adenoid cystic carcinoma(ACC);Nude mice;Xenograft tumor

R-332

A

1003—6350（2016）21—3441—03

2016-07-08)

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目[編號(hào)：黔科合J字LKZ(2010)07號(hào)]

吳發(fā)印。E-mail：wufy0515@163.com