重度子癇前期胎盤小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞BKCa通道的改變*

朱艷,侯曉鈺,傅曉冬

（1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科，四川瀘州646000；2陜西省核工業(yè)215醫(yī)院產(chǎn)科；3成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科）

重度子癇前期胎盤小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞BKCa通道的改變*

朱艷1，2,侯曉鈺3,傅曉冬1

（1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科，四川瀘州646000；2陜西省核工業(yè)215醫(yī)院產(chǎn)科；3成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科）

目的：運(yùn)用膜片鉗技術(shù)記錄重度子癇前期患者胎盤小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞上的BKCa通道的活動(dòng)，探討重度子癇前期與離子通道間的關(guān)系。方法：①收集診斷重度子癇前期患者胎盤10例為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)收集正常晚孕無(wú)妊娠并發(fā)癥和合并癥產(chǎn)婦胎盤10例為對(duì)照組；②急性酶分離獲得其胎盤小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，用單通道膜片鉗軟件記錄重度子癇前期組和對(duì)照組平滑肌細(xì)胞BKCa通道的情況。結(jié)果：重度子癇前期患者胎盤小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞BKCa通道的電流幅值（Amp）為：（4.770 ±1.128）pA；通道的開(kāi)放概率為（NPO)：（0.006±0.002）；通道的平均開(kāi)放時(shí)間（To）為：（3.991±1.386）ms；通道的平均關(guān)閉時(shí)間（Tc）為：（791.893±270.693）ms；而正常血壓組的Amp為：（7.407±0.881）pA；NPO為：0.021±0.006；To為：（5.764± 0.801）ms；Tc為：（279.330±69.903）ms。兩組的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：重度子癇前期患者胎盤小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞BKCa通道的功能降低，參與了子宮胎盤的缺血缺氧改變，可能與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

重度子癇前期（Sever preeclampsia，SPE）是妊娠期高血壓疾病的一類，對(duì)母兒的健康危害極大。關(guān)于其病因和發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明，比較公認(rèn)的有：胎盤淺著床、缺血缺氧等學(xué)說(shuō)。

有研究妊娠期高血壓疾病患者胎盤小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞膜鉀電流密度比正常妊娠組減小，靜息膜電位比正常妊娠組大。推測(cè)妊娠期高血壓疾病可能與鉀通道功能的改變有關(guān)[1]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用單通道膜片鉗記錄方式檢測(cè)重度子癇前期患者胎盤血管平滑肌細(xì)胞BKCa通道進(jìn)行研究。了解在SPE患者BKCa通道的功能是否發(fā)生了改變，進(jìn)行進(jìn)一步探討SPE與離子通道間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2012年6月～2013年2月在瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科確診為重度子癇前期并終止妊娠的孕婦10例，選取同期在本科室終止妊娠的10例正常孕婦作為對(duì)照組。排除既往有炎癥性疾病、癌癥、嚴(yán)重肝腎功能損害、免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病、吸煙史以及精神或認(rèn)知異常者。排除多胎妊娠、前置胎盤、胎盤早剝等其他高危妊娠。重度子癇前期并終止妊娠的孕婦10例，年齡20～34歲，血壓≥160/110 mmHg，蛋白尿：++～++++孕周：（37.3±4.1）周。正常晚孕組，選取同期在本科室終止妊娠的10例正常孕婦作為對(duì)照組，年齡19～34歲，平均血壓（124.45± 9.92/80.17±8.27）mmHg；孕周（37.1±3.8）周，各實(shí)驗(yàn)組孕齡及孕周之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照樂(lè)杰主編第七版《婦產(chǎn)科學(xué)》。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及溶液配制

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

F型膠原酶，木瓜蛋白酶，白蛋白，DTT,HEPES，K-aspartate，和IbTX購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，其他為國(guó)產(chǎn)試劑。配制單通道膜片鉗溶液Ⅰ和溶液Ⅱ，單通道電極液和單通道浴液。

1.2.2 溶液配制

溶液ⅠHEPES10、glucose 12、KCl 5.9、CaCl22.4、NaCl 127、MgCl21.2用于組織及細(xì)胞的保存和分離。溶液Ⅱ（mM）HEPES 10、MgCl2 1.2、KCl 5.9、glucose 2。NaCl 127用于細(xì)胞的保存和分離。單通道電極液（mM）pH用KOH調(diào)至7.20～7.40、EGTA 2、KCl 100、HEPES 10、K-aspartate 40。單通道浴液（mM），pH用KOH調(diào)至7.20～7.40、KCl 40、K-aspartate 100、EGTA 1、HEPES 10。酶液，酶Ⅰ(mg/mL)，木瓜蛋白酶1.0，DTT 0.68，白蛋白2.0，用溶液Ⅰ1 ml溶解。酶Ⅱ(mg/mL)，F(xiàn)型膠原酶0.808，用溶液Ⅱ溶解。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 取材和分離人胎盤小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞

經(jīng)陰道或剖宮產(chǎn)分娩的患者，選取直徑約0.3～1 mm的胎盤小動(dòng)脈血管，順著血管方向剪下長(zhǎng)度約2～3 cm的血管若干。迅速放入溫度約為4℃左右的溶液Ⅰ中，立即轉(zhuǎn)送進(jìn)行試驗(yàn)。在相差顯微鏡下先剝離周圍組織及清洗血管內(nèi)的血液，急性消化酶消化血管組織獲取活性較好的血管平滑肌細(xì)胞。

1.3.2 單通道膜片鉗技術(shù)

將盛有細(xì)胞懸液的浴槽放于倒置相差顯微鏡的操作臺(tái)面上觀察細(xì)胞的貼壁情況，選擇在視野中央、貼壁穩(wěn)、細(xì)胞膜完整、折光性佳的細(xì)胞。在微推進(jìn)器的幫助下將電極尖端輕輕移向理想的細(xì)胞。待電極尖端接近細(xì)胞時(shí)再使用微推進(jìn)器使電極尖端輕輕與細(xì)胞表面相接觸，在示波器上見(jiàn)應(yīng)答電流下降直至為零，即高阻封接形成(阻抗高達(dá)10 GΩ以上)。細(xì)胞貼附式膜片形成。電流信號(hào)經(jīng)Clampex 10.1系統(tǒng)專用軟件記錄并儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)。采樣的時(shí)間為30 s，頻率為1 kHz，方式為Gap Free方式。內(nèi)面向外式膜片鉗的電流。分別記錄不同電刺激下胎盤小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上BKCa通道電流信號(hào)的變化。

1.3.3 BKCa通道電流記錄

在內(nèi)面向外式膜片鉗下記錄重度子癇前期孕婦和正常血壓孕婦胎盤血管平滑肌細(xì)胞BKCa的單通道電流活動(dòng)，運(yùn)用inside-out膜片鉗記錄，在膜電位從0 mV到+60 mV之間的不同的鉗制電壓下電流幅值和對(duì)應(yīng)的電壓數(shù)據(jù)，制作電流-電壓關(guān)系曲線(I-V曲線)，Origin 8軟件進(jìn)行I-V曲線的直線擬合，其斜率即為單通道電導(dǎo)值。胎盤小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的電導(dǎo)值為（241.25±20）pS。反轉(zhuǎn)電位接近0 mV。

1.4 單通道電流數(shù)據(jù)分析和處理

采用Clampex 10.1軟件對(duì)所獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，運(yùn)用C1ampfit 10.1分析程序進(jìn)行測(cè)量通道的電流幅值（Amp）、開(kāi)放概率(NPO)、平均開(kāi)放時(shí)間（To）、平均關(guān)閉時(shí)間（Tc）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩步法急性酶分離人胎盤小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞

急性酶分離獲得的人胎盤小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞種類單一，易于分辨，細(xì)胞數(shù)量多。新分離的平滑肌細(xì)胞為長(zhǎng)梭形、蚯蚓狀，折光性好、胞膜完整、表面光滑。在Ca2+溶液中血管平滑肌細(xì)胞在血管收縮劑如（NE，Na，ATP）作用下可見(jiàn)細(xì)胞的收縮。圖1、圖2為分離好的人胎盤小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞。分別獲得可進(jìn)行膜片鉗檢測(cè)的平滑肌細(xì)胞，研究組和對(duì)照組各10例。

圖1 低倍鏡下（×100）胎盤血管平滑肌細(xì)胞

圖2 高倍鏡下（×400）胎盤血管平滑肌細(xì)胞

2.2 人胎盤小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中BKCa通道的鑒別

實(shí)驗(yàn)記錄到人胎盤小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的單通道電流具有大電導(dǎo)、電壓依賴性以及對(duì)鈣離子濃度的高度依賴性，并可被BKCa特異性阻斷劑IbTX阻斷的特性。

2.2.1 通道的電壓依賴性

在inside-out式膜片鉗下，通道的活動(dòng)呈現(xiàn)明顯的電壓依賴性。通道的開(kāi)放呈隨機(jī)開(kāi)放的外向電流，隨著刺激電壓的加大，通道總開(kāi)放概率（NPO）和通道電流幅值（Amp）顯著升高。

2.2.2 通道活動(dòng)的Ca2+依賴性

在內(nèi)面向外式單通道膜片鉗實(shí)驗(yàn)下，分別更換不同鈣離子濃度的浴液，其鈣離子濃度分別為0M、10－7M、5×10－7M、10－6M時(shí)，記錄在同樣的刺激電位下（+40 mV）,可以觀察到在不同的鈣離子濃度通道的活動(dòng)。其總開(kāi)放概率分別為0.0015±0.005、0.021 ±0.006、0.045±0.008、0.101±0.012。隨著鈣離子濃度的增加通道總開(kāi)放概率也增加，表現(xiàn)為鈣離子濃度依賴性。

2.2.3 IbTX對(duì)BKCa通道的作用

在外面向外式膜片鉗下（outside-out）（Vm=+ 30 mV）,浴液中加入200 nM IbTX后，幾乎完全阻斷了單通道BKCa電流(n=10)

實(shí)驗(yàn)記錄到人胎盤小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的單通道電流具有大電導(dǎo)、電壓依賴性以及對(duì)鈣離子濃度的高度依賴性，并可被BKCa特異性阻斷劑IbTX阻斷的特性。上述的電流特性符合大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的單通道電流特性。

2.3 重度子癇前期患者與正常晚孕患者胎盤小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞BKCa的比較

實(shí)驗(yàn)采用cell-attached膜片鉗技術(shù)記錄，電壓鉗制在+40 mV下，重度子癇前期組胎盤血管平滑肌細(xì)胞的BKCa通道的電流幅值為：（4.770±1.128）pA；開(kāi)放概率為：（0.006±0.002）；平均開(kāi)放時(shí)間為：（3.991±1.386）ms；平均關(guān)閉時(shí)間為：（791.893± 270.693）ms。正常組的BKCa通道的電流幅值為：（7.407±0.881）pA；開(kāi)放概率為：（0.021±0.006）；平均開(kāi)放時(shí)間為：（5.764±0.801）ms；平均關(guān)閉時(shí)間為：（279.330±69.903）ms。兩組的電流幅度、開(kāi)放概率、平均開(kāi)放時(shí)間、平均關(guān)閉時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=10,P＜0.05），(圖3，表1)。

圖3 在貼附式膜片鉗下（Vm=+40 mV），NLP組(A)與SPE組（B）胎盤血管平滑肌細(xì)胞BKCa單通道電流對(duì)比（n=10）

表1 NLP組與SPE組BKCa單通道電流對(duì)比

3 討論

生理狀態(tài)下，胞內(nèi)鈣離子超過(guò)靜息時(shí)的濃度，此時(shí)由α和β亞基組成的BKCa通道通過(guò)其負(fù)反饋機(jī)制抑制肌細(xì)胞的收縮。即是，BKCa通道的活性增加而使膜超極化抑制鈣離子從L型鈣通道進(jìn)入，而使肌肉松弛。若BKCa，鈣離子內(nèi)流增加血管平滑肌收縮[2]。BKCa通道不能通過(guò)反饋機(jī)制產(chǎn)生相應(yīng)的代償作用，使血管緊張度升高，促進(jìn)高血壓的產(chǎn)生已有報(bào)道[3]目前對(duì)高血壓的BKCa通道的研究結(jié)果還存在差異。有研究自發(fā)性高血壓大鼠對(duì)比正常血壓大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞BKCa通道的活性下降[4]。但liu等[5]在用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄自發(fā)性高血壓大鼠發(fā)現(xiàn)其BKCa的電流密度比正常大鼠高，認(rèn)為這種電流密度的增加是BKCa的負(fù)反饋調(diào)節(jié)血壓的具體表現(xiàn)。而其單通道下電導(dǎo)值、鈣敏感性、電壓依賴性無(wú)明顯不同。以全細(xì)胞膜片鉗方式記錄高血壓組和正常血壓組人腸系膜動(dòng)脈的血管平滑肌細(xì)胞上的BKCa電流密度，發(fā)現(xiàn)其電流密度，鈣離子敏感性顯著降低，認(rèn)為原發(fā)性高血壓者存在動(dòng)脈舒張障礙[6]。推測(cè)這種差異性可能與不同的種屬、不同的組織、高血壓發(fā)展的不同時(shí)期、以及不同的研究方法等相關(guān)。

妊娠期高血壓疾病患者在胎盤娩出后臨床癥狀逐漸消失。認(rèn)為在妊娠期高血壓疾病狀態(tài)下滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮螺旋動(dòng)脈僅僅只達(dá)蛻膜層，胎盤植入過(guò)淺，子宮螺旋動(dòng)脈改造欠佳，管徑相對(duì)狹窄，喪失了低阻力血管的功能，從而導(dǎo)致胎盤血流灌注不足，胎盤缺血、缺氧和代謝障礙，全身小動(dòng)脈痙攣，尤其在重度子癇前期患者[7]。重度子癇前期存在子宮-胎盤、胎盤-胎兒循環(huán)障礙，子宮動(dòng)脈及臍動(dòng)脈阻抗增高，胎兒缺氧、胎兒生長(zhǎng)受限[8]。

本研究應(yīng)用單通道膜片鉗技術(shù)研究顯示重度子癇前期組胎盤血管平滑肌細(xì)胞BKCa通道的電流幅值、開(kāi)放概率、平均開(kāi)放時(shí)間較正常妊娠小，而平均關(guān)閉時(shí)間較正常妊娠長(zhǎng)。提示重度子癇前期組胎盤血管平滑肌細(xì)胞BKCa通道的功能是降低的。由此認(rèn)為，BKCa通道的改變參與了重度子癇前期的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，也解釋了BKCa通道的改變與先兆子癇和子癇患者胎兒宮內(nèi)缺氧、生長(zhǎng)受限具有相關(guān)性[9]。

無(wú)論在妊娠高血壓疾病的胎盤血管平滑肌BKCa通道功能是減弱還是增強(qiáng)，之前的研究都提示BKCa通道功能改變，使血管收縮張力改變，與高血壓密切相關(guān)。我們可將該課題繼續(xù)實(shí)驗(yàn)下去，增加樣本量，并分層統(tǒng)計(jì)分析，了解妊娠高血壓疾病的胎盤血管BKCa通道功能究竟是減弱還是增強(qiáng)，是否因病情的不同程度，平滑肌BKCa通道功能就不同。進(jìn)一步，通過(guò)藥物作用研究胎盤血管平滑肌BKCa通道功能改變，為臨床藥物治療妊娠期高血壓疾病提供新的治療靶點(diǎn)以及對(duì)藥物療效的檢測(cè)提供新的方法，或采用全細(xì)胞穿孔膜片鉗技術(shù)研究妊娠期高血壓疾病大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的電流密度以及從分子和基因水平研究妊娠期高血壓疾病患者胎盤血管平滑肌BKCa通道的遺傳差異性。

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（2016-06-22收稿）

Changes of BKCa in vascular smooth muscle cells of human with severe preeclampsia placental small arteries

Zhu Yan1，2,Hou Xiaoyu3,Fu Xiaodong1
1Department of Obstetrics and Gynecology,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou, Sichuan Province,646000;2Department of Obstetrics,Nuclear Industry 215 Hospital of Shanxi;3Department of Obstetrics,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College,China

Objective:In this study,we use Patch Clamp technique to record the activities of BKCa channels in VSMCs of patients with SPE,study these changes,then compare with the activities of BKCa in VSMCs of normal pregnant,it is desirable to provide atheoretical basis for the pathogenesis of disease and treatment.Metheds:We selected a control group with 10 patients that met the severe cases of preeclampsia diagnostic criteria,at the same time,choose a normal pregnant group of 10 patients with no pregnancy complications and comorbidities.Keep the enzymatically dissociated VSMCs of human placenta.Clampex 10.1 software and Clampfit 10.1 software were used for data acquisition and data analysis individually.Software were used for data acquisition and data analysis individually.Results:When the test voltage was 40 mV,the Amp of BKCa channels from SPE group was(4.770±1.128)pA，The NPO,To and Tc were 0.006±0.002,(3.991±1.386)ms,and (791.893±270.693)ms individually.However,the Amp,Npo,To and Tc of BKCa channels from control group were(7.407±0.881)pA,0.021±0.006，(5.764±0.801)ms,(279.330±69.903)ms.There were statistical significant difference for Amp,NPo,Tc and Tc（P＜0.05）.Conclusion:BKCa channels in VSMCs of patients with SPE placental small artery were decreased.This could lead to vasoconstriction and increase blood pressure, and involved in the change of utero-placental chemia and hypoxia,which may be associated with the pathogenesis of hypertensive disorders in pregnancy.

Sever preeclampsia;Placental vascular smooth muscle cells;Large conductance calciumactivated potassium channel

R714.24+5

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.05.019

*四川省科技廳項(xiàng)目（2012820178）

朱艷（1979-），女，住院醫(yī)士，碩士。

傅曉冬（1964-），女，主任醫(yī)師，碩士。E-mail:dongerfu@163.com

關(guān)鍵詞重度子癇前期;胎盤血管平滑肌細(xì)胞;大電導(dǎo)鈣激活鉀通道