洋蔥T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育與花蕾ATP含量的關(guān)系

馬蓉麗成 妍吳海濤焦彥生喬 寧

（1山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，山西太原 030031；2溫州科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江溫州325000）

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洋蔥T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育與花蕾ATP含量的關(guān)系

馬蓉麗1成 妍1吳海濤1，2*焦彥生1喬 寧1

（1山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，山西太原 030031；2溫州科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江溫州325000）

摘 要：以洋蔥T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系8-43A、保持系8-43B和恢復(fù)系8-43-57C為試材，采用螢火蟲熒光素酶檢測技術(shù)，分析花蕾不同發(fā)育時期三磷酸腺苷（ATP）的含量變化，研究洋蔥T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育與花蕾ATP含量的關(guān)系。結(jié)果表明：在整個花藥發(fā)育過程中的各個階段，保持系和恢復(fù)系的花蕾之間ATP含量均無顯著差異，不育系花蕾ATP含量均極顯著低于保持系和恢復(fù)系，尤其在花粉粒成熟早期，僅為保持系和恢復(fù)系的1%；花粉粒成熟早期，不育系花蕾ATP含量下降到不足四分體時期的1/10，說明花藥發(fā)育通過單核期后耗費(fèi)了組織內(nèi)大量的ATP，更重要的是ATP的產(chǎn)生可能出現(xiàn)了障礙；洋蔥T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系花蕾ATP含量極顯著低于各時期的可育株，可能是導(dǎo)致其雄性不育的原因。

關(guān)鍵詞：洋蔥；T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育；花蕾；ATP含量

馬蓉麗，女，研究員，主要從事蔬菜遺傳育種方面的研究，E-mail：marongli1957@163.com

細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterile，CMS）是植物中廣泛存在的現(xiàn)象，已經(jīng)在逾320個種中發(fā)現(xiàn)存在細(xì)胞質(zhì)雄性不育（孫新菊，2015）。細(xì)胞質(zhì)雄性不育的不育性狀不但能被恢復(fù)系恢復(fù)育性，還可以用保持系維持其后代的不育性，因此在植物雜交育種以及核質(zhì)互作研究中占有非常重要的地位。

洋蔥（Allium cepa L.）是世界上栽培時間最早、栽培面積最大的蔬菜作物之一，也是我國出口創(chuàng)匯最多的蔬菜作物之一（梁毅 等，2009）。但由于洋蔥每朵小花僅產(chǎn)生6粒種子，人工去雄授粉成本很高，應(yīng)用雄性不育系制種省時省工，因此洋蔥CMS的研究非常重要（王建軍 等，2003）。

三磷酸腺苷（ATP）是以次黃嘌呤核苷酸為底物，經(jīng)生物發(fā)酵技術(shù)制得的高能化合物，是體內(nèi)組織細(xì)胞一切生命活動所需能量的直接來源，被譽(yù)為細(xì)胞內(nèi)能量的“分子貨幣”，儲存和傳遞化學(xué)能，蛋白質(zhì)、脂肪、糖和核苷酸的合成都需它參與，可促使機(jī)體各種細(xì)胞的修復(fù)和再生，增強(qiáng)細(xì)胞代謝活性（呂俊恒和鄧明華，2014）。

根據(jù)細(xì)胞核中控制育性的基因不同，洋蔥CMS被分成S型和T型兩種（吳海濤 等，2009）。S型不育由1對隱性基因（msms）控制，最早在洋蔥品種意大利紅中發(fā)現(xiàn)（Jones & Emsweller，1936）；T型不育受3對基因控制：1對相對獨(dú)立的基因（A）和2對互補(bǔ)基因（B和C），在法國洋蔥品種Jaunepaille des venus中首先發(fā)現(xiàn)（Berninger，1965）。

吳海濤（2010）采用分子標(biāo)記方法鑒定出洋蔥品種沙溝紅皮的不育系8A為T型CMS（T-CMS）。為了初步判斷洋蔥T-CMS是否在小孢子發(fā)育能量需求旺盛階段通過減少ATP的合成量誘導(dǎo)花粉敗育，本試驗(yàn)對該材料的小孢子敗育前后的ATP含量進(jìn)行測定分析，旨在為洋蔥T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的進(jìn)一步研究與利用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試洋蔥T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系、保持系和恢復(fù)系均從山西地方品種沙溝紅皮中選出，回交10代，為近等位基因系。不育系材料為8-43A，保持系材料為8-43B，恢復(fù)系材料為8-43-57C，均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。

1.2試驗(yàn)方法

2012年8月下旬播種不育系、保持系和恢復(fù)系洋蔥種子于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽試驗(yàn)基地，11月中旬囤苗越冬，翌年3月中旬定植，7月中旬收獲，貯藏越夏，10月中旬定植種球，2014年5月下旬抽薹現(xiàn)蕾。

1.2.1不同時期花蕾的分級和取樣 在開花初期于上午8：00～10：00在田間摘取可育系發(fā)育程度不同的新鮮花球，撕開外苞片，測量不同大小花蕾的橫徑、縱徑，剝?nèi)』ㄋ?，在載玻片上擠壓出小孢子，用0.5%的醋酸洋紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)小孢子發(fā)育時期。

根據(jù)顯微觀察結(jié)果，分別選取不育系、保持系和恢復(fù)系小孢子處于四分體時期、單核花粉粒時期和花粉粒成熟早期的花蕾，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ATP含量測定ATP含量測定基于在ATP存在的條件下，螢火蟲熒光素酶可催化底物D-熒光素氧化并發(fā)射熒光（約560 nm，pH= 7.8），并且在除ATP外其他底物處于過量的情況下，光子數(shù)量與ATP含量呈線性關(guān)系這一原理。取保存的花蕾樣品各0.5 g，用ENLITEN?ATP Assay System Bioluminescence Detection kit（Promega）提取小孢子發(fā)育不同時期花蕾中的ATP，在GloMax?20/20 Luminometer（Promega）儀器上進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算單位質(zhì)量花蕾中ATP的含量，設(shè)3次重復(fù)，取平均值。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行各指標(biāo)的差異顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1洋蔥花球外部形態(tài)與花粉發(fā)育時期的對應(yīng)關(guān)系

觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)花球外苞充實(shí)約1/3時（圖1-a），花蕾橫徑為0.21～0.23cm、縱徑為0.25～0.32cm（圖1-b），花藥呈淺綠色、半透明狀、多汁液，其中大部分花粉處于四分體時期（圖1-c）；當(dāng)花球外苞充實(shí)約2/3時（圖1-d），花蕾橫徑為0.23～0.27cm、縱徑為0.31～0.35cm（圖1-e），花藥呈淺綠色、不透明、多汁液，其中大部分花粉處于單核花粉粒期（圖1-f）；當(dāng)花球外苞即將或剛開裂時，花蕾橫徑為0.27～0.33cm、縱徑為0.35～0.39cm（圖1-g），花藥呈綠色、不透明、少汁液，其中大部分花粉處于花粉粒成熟早期（圖1-h）。

圖1　洋蔥可育系不同發(fā)育時期花球外部形態(tài)和花粉發(fā)育時期

2.2洋蔥T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育與花蕾ATP含量的關(guān)系

四分體時期18 16 14 12 10 eE　eE單核花粉粒時期）花粉粒成熟早期FW1（mo1·g-86420 量/ndD cdCD　dCD cC 含ATP bBbB aA不育系 　　保持系 　　恢復(fù)系

由圖2可知，從洋蔥花藥四分體時期到單核花粉粒時期，T-CMS不育系和保持系花蕾ATP含量的變化均不顯著。到花粉粒成熟早期，不育系花蕾ATP含量下降到不足四分體時期的1/10，而保持系和恢復(fù)系則增加到四分體時期的3倍左右。不育系花蕾ATP含量在各時期均極顯著低于保持系和恢復(fù)系，尤其在花粉粒成熟早期，僅為可育系的1%。在整個花藥發(fā)育過程中，保持系和恢復(fù)系的花蕾ATP含量均無顯著差異。

3　結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用螢火蟲熒光素酶檢測技術(shù)測定了洋蔥T-CMS不育系、保持系和恢復(fù)系在花蕾不同發(fā)育時期的ATP含量，發(fā)現(xiàn)不育系花蕾ATP含量在各時期均極顯著低于保持系和恢復(fù)系，尤其在花粉粒成熟早期，僅為可育系的1%。多種作物的研究中都發(fā)現(xiàn)，植物花粉敗育過程中ATP的含量呈普遍降低趨勢，玉米和高粱的CMS的形成與ATP含量變化有著密切關(guān)系，可育系花藥中的ATP含量均高于不育系（王秀珍 等，1986）；水稻從單核早期開始，不育系花藥的ATP含量一直低于可育系，可育系花藥的ATP含量比不育系高7倍以上（陳賢豐和梁承鄴，1991）；而在不育系中由于ATP含量較低，不足以提供花粉萌發(fā)或者花粉管伸長所需的能量，最終使得小孢子發(fā)育被迫停止，從而導(dǎo)致不育（鄧?yán)^新 等，1990）。此外，在玉米（夏濤和劉紀(jì)麟，1994）、蘿卜（魏毓棠 等，2001）雄性不育的研究中也發(fā)現(xiàn)了能量虧損現(xiàn)象。夏濤和劉紀(jì)麟（1994）在玉米三種（T、C、S）CMS不育系中均發(fā)現(xiàn)，隨著小孢子發(fā)育的進(jìn)行，花藥組織ATP含量顯著降低。蘿卜雄性不育小孢子發(fā)育過程中，向花蕾中運(yùn)輸?shù)矸鄣任镔|(zhì)會導(dǎo)致能量積累不足而敗育（張麗 等，2002）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，洋蔥T-CMS不育系花粉粒成熟早期的花蕾ATP含量下降到不足四分體時期的1/10，說明花藥發(fā)育通過單核期后耗費(fèi)了組織內(nèi)的大量ATP，更重要的是ATP的產(chǎn)生可能出現(xiàn)了障礙。這些現(xiàn)象表明，伴隨著小孢子發(fā)生的開始和小孢子敗育的發(fā)生，不育系花藥組織中ATP含量及其變化出現(xiàn)了異常。這種異常必然會影響花藥組織及小孢子物質(zhì)合成和能量代謝以及與之有關(guān)的生命活動，導(dǎo)致小孢子發(fā)育的畸形和敗育。下一步可以從影響ATP合成的因素出發(fā)，應(yīng)用細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、生理生化、分子生物學(xué)等手段進(jìn)行研究，闡明洋蔥T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育的機(jī)理。

參考文獻(xiàn)

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梁毅，王永勤，于春霞，關(guān)絢麗，張智，田保華.2009.中國洋蔥產(chǎn)業(yè)的回顧與展望.中國農(nóng)學(xué)通報，25（24）：308-312.

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Jones H A，Emsweller S L.1936.A male-sterile onion.Proceeding of the American Society for Horticultural Science，34：582-585.

Relationship between ATP Contents of buds and T-type Cytoplasmic Male Sterility in Onion

MA Rong-li1，CHENG Yan1，WU Hai-tao1，2*，JIAO Yan-sheng1，QIAO Ning1
（1Institute of Vegetables，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，Shanxi，China；2Wenzhou Professional College of Science and Technology，Wenzhou 325000，Zhejiang，China）

Abstract：Taking onion T-type cytoplasmic male sterile line ‘8-43A’，maintainer line ‘8-43B’and restorer line ‘8-43-57C ’as material，using firefly luciferase enzyme testing technology，this paper analyzed the changes in ATP contents of buds at different growing stages，and studied the relationships between ATP contents of buds and T-type cytoplasmic male sterility in onion.The results showed that there were no significant differences between the ATP contents of maintainer and restorer lines throughout the entire development process of bud.While，the ATP content ofcmS bud was very significantly lower than that of the maintainer and restorer lines，especially at early grain stage，which only took 1% of that in maintainer and restorer lines.ATP content of thecmS line at early grain stage decreased to less than 1/10 of those at tetrad stage，illustrating a large quantity of ATP was consumed after mononuclear stage.And an even important thing was there might be barriers in ATP generation.The ATP content of T-typecmS in onion was very significantly lower than that of the fertile lines might be the reason for male sterility.

Key words：Onion；T-type cytoplasmic male sterility；Bud；ATP content

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31201638）

收稿日期：2015-08-12；接受日期：2015-12-09

*通訊作者（

Corresponding author）：吳海濤，男，博士，助理研究員，主要從事蔬菜遺傳育種方面的研究，E-mail：cucum2008@126.com