CYP2C8代謝紫杉醇產(chǎn)物6α—羥基紫杉醇的LC—MS/MS檢測

黃潔瓊

【摘 要】本文以紫杉醇為底物，建立其CYP2C8代謝產(chǎn)物6α-羥基紫杉醇的LC-MS/MS方法，為CYP2C8酶活性的研究提供可靠、靈敏、快速的檢測分析方法。采用電噴霧離子源（ESI），三級四級桿串聯(lián)質(zhì)譜，多級反應(yīng)監(jiān)測進(jìn)行定量，正離子掃描，選取離子對為6α-羥基紫杉醇892.3→308.1；內(nèi)標(biāo)多西紫杉醇830.3→549.4。利用Agela Venusil XBP C18 色譜柱（50×2.1mm；5μm）實(shí)現(xiàn)代謝物分離，柱溫40℃，流速為0.3mL/min，流動相為A相（水∶乙腈=95∶5）與B相（水∶乙腈=5∶95）梯度混合。代謝物6α-羥基紫杉醇與內(nèi)標(biāo)實(shí)現(xiàn)基線分離，峰形良好，而且不存在代謝與內(nèi)標(biāo)之間的干擾，且6α-羥基紫杉醇在5-500ng/ml的范圍為線性關(guān)系良好；該方法快速靈敏可用于CYP2C8活性檢測。

【關(guān)鍵詞】紫杉醇；CYP2C8；LC-MS

細(xì)胞色素P450酶（CYP450）是存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白質(zhì)超家族，它對多種內(nèi)源性、外源性物質(zhì)在體內(nèi)的氧化反應(yīng)起著重要的作用，是藥物動力學(xué)和反應(yīng)的變化的一個主要原因。在推定的57個有功能的人類細(xì)胞色素P450中，只有屬于CYP1、CYP2、CYP3這三個家族的大約十幾個酶對藥物的代謝起主要作用，其中包括CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5等[1]。其中，CYP2C8是CYP2C家族中最晚發(fā)現(xiàn)的一個成員，大約占CYP2C家族的26%。CYP2C8主要分布在肝臟，占肝CYP代謝酶總量的7%；其在肝臟外的組織中也存在少量的分布[2]。CYP2C8參與催化大約5%的臨床藥物，并且存在著明顯的基因多態(tài)性，對藥物的代謝清除有著明顯的影響。

紫杉醇是一種抗微管細(xì)胞藥物，被廣泛應(yīng)用于治療卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、頭頸部癌等惡性腫瘤[3]。紫杉醇在人體內(nèi)能夠被CYP3A4和CYP2C8代謝，分別生成p-3-羥基紫杉醇和6α-羥基紫杉醇[4-5]。在人肝微粒體中，6α-羥基紫杉醇的生成量高于p-3-羥基紫杉醇，這表明CYP2C8在紫杉醇體內(nèi)代謝過程中發(fā)揮著重要作用[6]。為了研究CYP2C8酶活性則必須要建立快速、可靠、靈敏的檢測酶活性方法。本文以紫杉醇為底物，建立其CYP2C8代謝產(chǎn)物6α-羥基紫杉醇的LC-MS/MS方法，為CYP2C8酶活性的研究提供可靠，靈敏，快速的檢測分析方法。

1 試劑和儀器

1.1 試劑

甲醇（Merck，德國）；乙腈（Merck，德國）；紫杉醇及其代謝物6α-羥基紫杉醇（BD，美國）；多西紫杉醇（sigma，美國）。

1.2 儀器

液相色譜系統(tǒng)為日本Shimadzu液相色譜系統(tǒng)，包括LC-20AD輸液泵，SIL-20A自動進(jìn)樣器以及Shimadzu CTO-20A柱溫箱；質(zhì)譜系統(tǒng)為美國Applied Biosystems公司API 4000 Q TRAP三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧電離源（Turbo Ionspray）以及Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)采集軟件。

2 底物代謝物L(fēng)C-MS/MS方法的構(gòu)建

（1）用甲醇或乙腈將紫杉醇及其代謝產(chǎn)物6α-羥基紫杉醇稀釋至約1000ng/mL；

（2）激活Mass only，修改參數(shù)，以10μL/min進(jìn)入質(zhì)譜儀；

（3）記錄相應(yīng)參數(shù)：底物及代謝產(chǎn)物的母離子Q1、子離子Q3、去溶劑電壓DP，撞擊能量CE；

（4）激活LC/MS，修改參數(shù)。選擇合適流動相，分別用甲醇或乙腈配制低高兩個濃度的代謝產(chǎn)物單樣及低、高兩個濃度的代謝產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)的混合液進(jìn)樣，調(diào)整相應(yīng)參數(shù)使得底物，代謝產(chǎn)物及內(nèi)標(biāo)實(shí)現(xiàn)基線分離并使其系列濃度擁有良好的線性；

（5）清洗管路。

3 結(jié)果

通過液相串聯(lián)質(zhì)譜對紫杉醇的代謝產(chǎn)物6α-羥基紫杉醇建立專屬靈敏的LC-MS/MS方法，進(jìn)行定量檢測。采用正離子模式，選擇離子對m/z 892.4→324.1（圖1）和m/z 830.3→549.4（圖2）分別測定6α-羥基紫杉醇和多西紫杉醇（內(nèi)標(biāo)）的含量；色譜圖如圖3所示，方法總結(jié)見表1。代謝物與內(nèi)標(biāo)實(shí)現(xiàn)基線分離，峰形良好，而且不存在代謝與內(nèi)標(biāo)之間的干擾，6α-羥基紫杉醇在5-500ng/ml的范圍為線性關(guān)系良好。該方法快速靈敏可用于CYP2C8活性檢測。

4 結(jié)論

本文選取紫杉醇為CYP2C8代謝酶的探針底物，并建立了其主要代謝物6α-羥基紫杉醇的LC-MS方法，代謝物與內(nèi)標(biāo)峰形良好，分離度好，且不存在相互干擾，可為評價CYP2C8代謝酶的活性提供靈敏、快速、特征專屬的檢測方法。

【參考文獻(xiàn)】

[1]謝章明.人CYP3A4與POR及cytb_5共表達(dá)條件的優(yōu)化以及表達(dá)產(chǎn)物在藥物相互作用研究中的應(yīng)用[D].浙江大學(xué)，2013.

[2]Klose TS， Blaisdell JA， Goldstein JA. Gene structure of CYP2C8 and extrahepatic distribution of the human CYP2Cs[J]. Journal of Biochemical & Molecular Toxicology， 1999，13（6）：289-295.

[3]郭培鳳，郭云利.紫杉醇應(yīng)用相關(guān)不良反應(yīng)觀察[J].醫(yī)學(xué)信息，2014（2）：643.

[4]Monsarrat B， Mariel E， Cros S， et al. Taxol metabolism. Isolation and identification of three major metabolites of taxol in rat bile[J]. Drug Metabolism & Disposition， 1990， 18（6）：895-901.

[5]Walle T， Kumar GN， McMillan JM， et al. Taxol metabolism in rat hepatocytes[J]. Biochemcal Pharmacology， 1993，46（9）：1661-1664.

[6]Taniguchi R， Kumai T， Matsumoto N， et al. Utilization of human liver microsomes to explain individual differences in paclitaxel metabolism by CYP2C8 and CYP3A4[J]. Journal of Pharmacological Sciences， 2005，97（1）：83-90.

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