補(bǔ)腎活血方對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑液IL-1β水平及滑膜MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

梁延琛,李念虎,丁英杰,叢海波

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250021；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3威海市中心醫(yī)院)

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補(bǔ)腎活血方對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑液IL-1β水平及滑膜MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

梁延琛1,2,李念虎2,丁英杰3,叢海波3

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250021；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3威海市中心醫(yī)院)

摘要：目的觀察補(bǔ)腎活血方對(duì)骨關(guān)節(jié)炎(OA)大鼠關(guān)節(jié)滑液白細(xì)胞介素1β(IL-1β)及關(guān)節(jié)滑膜基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)的影響。方法 取20只采用Hulth法OA造模成功的SD大鼠，隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組各10只，分別給予自擬補(bǔ)腎活血方制劑、等量淀粉混懸液灌胃6周。采用酶免疫分析(RIA)法檢測(cè)關(guān)節(jié)滑液中的IL-1β，采用RT-PCR法檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜中的MMP-9 mRNA。結(jié)果觀察組和對(duì)照組關(guān)節(jié)滑液IL-1β水平分別為(2.25±0.13)、(5.37±0.68)pg/mL,關(guān)節(jié)滑膜MMP-9 mRNA表達(dá)量分別為0.31±0.05、0.68±0.03。觀察組大鼠關(guān)節(jié)滑液IL-1β水平和關(guān)節(jié)滑膜MMP-9 mRNA表達(dá)量均低于對(duì)照組，P均<0.05。結(jié)論 補(bǔ)腎活血方灌胃可以抑制OA大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞分泌IL-1β及關(guān)節(jié)滑膜中MMP-9 mRNA表達(dá)。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)腎活血方；骨關(guān)節(jié)炎；白細(xì)胞介素1β；基質(zhì)金屬蛋白酶9

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種慢性、漸進(jìn)性、退行性的關(guān)節(jié)病變，以膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)病率最高。其主要病理學(xué)特征是關(guān)節(jié)軟骨變性破壞、軟骨下骨硬化、關(guān)節(jié)表面骨贅形成、滑膜增生、關(guān)節(jié)間隙變窄等。OA的病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為其是在生物學(xué)和力學(xué)因素共同作用下導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞、軟骨下骨及細(xì)胞外基質(zhì)三者合成和降解穩(wěn)態(tài)失衡的退行性關(guān)節(jié)疾病。補(bǔ)腎活血方是我院李念虎教授自擬的一種治療OA的方劑，臨床應(yīng)用有效[1,2],但作用機(jī)制不明。2015年3～5月，我們觀察了補(bǔ)腎活血方對(duì)OA大鼠關(guān)節(jié)滑液IL-1β水平和關(guān)節(jié)滑膜基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)基因表達(dá)的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1動(dòng)物模型制作SPF級(jí)SD 大鼠26只，鼠齡3個(gè)月，未孕，雌雄各半，體質(zhì)量(220±20)g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用Hulth法[3]行OA造模。取大鼠后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱行手術(shù)入路，切斷前后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶，切除內(nèi)側(cè)半月板，術(shù)中避免損傷關(guān)節(jié)軟骨。術(shù)后每鼠每天肌注青霉素鈉預(yù)防術(shù)后感染。術(shù)后第3天開始強(qiáng)迫大鼠每天早晚活動(dòng)1次，每次時(shí)長(zhǎng)為半小時(shí)，連續(xù)6周。普通飼料喂養(yǎng)。隨機(jī)抽取3只處死，解剖下肢膝關(guān)節(jié)，取股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端關(guān)節(jié)面行形態(tài)學(xué)檢測(cè)。肉眼觀察見股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端關(guān)節(jié)面均表面粗糙，欠規(guī)整。再對(duì)切取的關(guān)節(jié)面行HE染色，光學(xué)顯微鏡下見關(guān)節(jié)軟骨表面變薄，軟骨細(xì)胞減少，呈退行性改變；軟骨下骨小梁變細(xì)，排列紊亂，連續(xù)性差；滑膜增生肥厚。肉眼及光學(xué)顯微鏡觀察均證實(shí)OA造模成功。

1.2分組與處理從剩余OA造模成功大鼠中選取20只，隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組各10只，分別給予自擬補(bǔ)腎活血方制劑6 mL和等量淀粉混懸液，每天早晚各灌胃1次，連續(xù)給藥6周。其間大鼠正常飼養(yǎng)，不再?gòu)?qiáng)迫其活動(dòng)。補(bǔ)腎活血方由熟地黃、附子、丹參、巴戟天、仙茅等中藥組成。

1.3關(guān)節(jié)滑液IL-1β檢測(cè)在兩組大鼠一側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)注入無菌生理鹽水0.2 mL，混勻后抽取關(guān)節(jié)液，用酶免疫分析法(RIA)檢測(cè)IL-1β。每份標(biāo)本至少檢測(cè)3次，取平均值。

1.4關(guān)節(jié)滑膜MMP-9 mRNA表達(dá)檢測(cè)取兩組大鼠另一側(cè)后膝關(guān)節(jié)滑膜。采用TRIzol法提取滑膜組織RNA，瓊脂糖電泳進(jìn)行純度檢測(cè)。用反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜中MMP-9 mRNA表達(dá)，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，結(jié)果以目的條帶與β-actin條帶的灰度值之比表示。

2結(jié)果

觀察組和對(duì)照組關(guān)節(jié)滑液IL-1β水平分別為(2.25±0.13)、(5.37±0.68)pg/mL,關(guān)節(jié)滑膜MMP-9 mRNA表達(dá)量分別為0.31±0.05、0.68±0.03。觀察組大鼠關(guān)節(jié)滑液IL-1β水平和關(guān)節(jié)滑膜MMP-9 mRNA表達(dá)量均低于對(duì)照組，P均<0.05。

3討論

OA屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)中“痹癥”、“骨痹”范疇。中醫(yī)骨傷科學(xué)認(rèn)為，OA發(fā)病機(jī)制是腎虛為本，血瘀為標(biāo)，本虛標(biāo)實(shí)，本痿標(biāo)痹。肝藏血、主筋，腎藏精、主骨，肝腎虧虛，精血不足，則致筋骨失養(yǎng)，經(jīng)脈閉阻，不通則痛，易感風(fēng)寒濕邪而發(fā)為“痹”。《素問·痹論篇》云：“骨痹者，肝腎虧虛，化生不足，因虛邪之風(fēng)，寒濕邪至，兩虛相得，乃客其形”，認(rèn)為骨痹是肝腎虧虛致正氣不足，風(fēng)寒濕邪乘虛而入，正邪相搏，經(jīng)絡(luò)痹阻，是其主要的發(fā)病機(jī)制?！稄埵厢t(yī)通》曰：“膝者，筋之府，膝痛無有不因肝腎虛者，虛則風(fēng)寒濕氣襲之?！闭J(rèn)為骨痹的主要內(nèi)因是肝腎虧虛，風(fēng)寒濕邪是其發(fā)病的重要外因。祖國(guó)醫(yī)學(xué)歷代名家及典籍基本上一致認(rèn)可本病本虛標(biāo)實(shí)的病機(jī)，不同主要是在其中醫(yī)癥候方面，有重于肝而有重于腎者，有重于瘀而有重于邪者[4]。

針對(duì)“骨痹”發(fā)病機(jī)制，李念虎教授結(jié)合古籍及多年臨床實(shí)踐，重視OA“本虛標(biāo)實(shí)，本痿標(biāo)痹”的特點(diǎn)，自擬補(bǔ)腎活血方，并在多年臨床實(shí)踐中取得了滿意的療效。此方中，熟地黃滋陰補(bǔ)血、益精填髓，附子回陽救逆、散寒止痛，二者共為君藥；丹參活血消癰、祛瘀止痛，為臣藥；巴戟天補(bǔ)腎助陽、祛風(fēng)除濕；仙茅溫腎壯陽、驅(qū)寒除濕，共為佐藥。此補(bǔ)腎活血方藥味不在多而在精，藥效重在標(biāo)本兼治，補(bǔ)腎兼以強(qiáng)筋，活血而不破血，從而達(dá)到治療OA的目的。

近年來國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)[5]，細(xì)胞因子在OA發(fā)生發(fā)展的病理生理過程中起著重要作用，其中IL-1及TNF-α是關(guān)節(jié)炎病理過程中促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的兩種最重要的細(xì)胞因子[6]。IL-1β在OA發(fā)生的病理生理過程中處于核心地位[7]，可以發(fā)揮以下作用：①改變軟骨細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)軟骨細(xì)胞非正常性的凋亡；②改變軟骨基質(zhì)中膠原蛋白的含量，減少Ⅱ型膠原蛋白的合成，并降低Ⅱ型膠原蛋白的基因表達(dá)，使其易于被基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)降解；③通過誘導(dǎo)MMPs的高表達(dá)和活性增加，促進(jìn)軟骨基質(zhì)中膠原蛋白的降解[8]；④可以激發(fā)關(guān)節(jié)滑膜中炎性介質(zhì)的高合成及高表達(dá)，促使關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境的炎癥反應(yīng)加重。

MMPs是一組Zn2+、Ca2+依賴的蛋白水解酶，其結(jié)構(gòu)具有高度同源性，均由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成，在中性pH條件下能水解包括膠原蛋白、蛋白聚糖、纖維粘連蛋白等在內(nèi)的絕大部分細(xì)胞外基質(zhì)[9]。MMP-9屬于 MMPs中的明膠酶亞型，具有降解膠原蛋白明膠、彈性蛋白的高度特異的能力。在OA的演進(jìn)過程中，MMP-9可加快軟骨基質(zhì)中膠原蛋白、彈性蛋白的降解速度，致使以Ⅱ型膠原蛋白為主體的軟骨基質(zhì)網(wǎng)狀框架結(jié)構(gòu)大量破壞，關(guān)節(jié)軟骨腫脹，抵抗外力作用下降，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)不可逆的永久性破壞[10]。

本研究結(jié)果證實(shí)，補(bǔ)腎活血方可降低OA關(guān)節(jié)滑液中IL-1β的水平，同時(shí)使關(guān)節(jié)滑膜中MMP-9 mRNA表達(dá)明顯減少。其可能機(jī)制是補(bǔ)腎活血方采用補(bǔ)腎法上調(diào)性激素水平，提高超氧化物歧化酶活性，清除氧自由基，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，減緩軟骨細(xì)胞退行性變；活血法改善微循環(huán)，降低骨內(nèi)壓，抑制滑膜中炎癥反應(yīng)，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修補(bǔ)；兩者有機(jī)地結(jié)合為一個(gè)統(tǒng)一的整體，最終針對(duì)OA的發(fā)病機(jī)制，調(diào)節(jié)異常變化的細(xì)胞因子的水平，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶含量和活性的異常增高，從而達(dá)到治療OA的目的。

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(收稿日期：2015-10-12)

中圖分類號(hào)：684.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)06-0036-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.06.012

通信作者：叢海波(E-mail: haibocong@163.com)

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2009ZRA01218)。