藥物誘導(dǎo)自噬對慢性髓系白血病細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究進(jìn)展

劉慧敏，陳亦雨，賀艷杰，李玉華

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣州510280)

藥物誘導(dǎo)自噬對慢性髓系白血病細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究進(jìn)展

劉慧敏，陳亦雨，賀艷杰，李玉華

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣州510280)

慢性髓系白血病(CML)是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性腫瘤，其藥物治療常伴隨自噬激活。一方面自噬可以對白血病細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，維持細(xì)胞生存；另一方面自噬可以誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡。合理聯(lián)合應(yīng)用自噬調(diào)節(jié)劑對CML的治療可能會有益。

自噬；慢性髓系白血?。凰幬锆煼?；自噬調(diào)節(jié)劑

慢性髓系白血病(CML)是以9號染色體與22號染色體異位生成斷裂點(diǎn)簇區(qū)/阿伯爾森1(BCR-ABL1)基因?yàn)樘卣鞯囊环N造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，約占成人新診斷白血病的15%。靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑(TKI)伊馬替尼(IM)的問世是CML治療史上的里程碑，使CML成為藥物可控的慢性疾病，但仍有近20%的CML經(jīng)IM治療無法達(dá)到完全緩解，而且加速期和急變期患者對IM耐藥已成為臨床上的普遍現(xiàn)象。IM耐藥機(jī)制復(fù)雜，包括BCR-ABL1基因激酶域或非激酶域點(diǎn)突變、BCR-ABL1基擴(kuò)增及藥物泵高表達(dá)等[1]。第二代TKI尼洛替尼和達(dá)沙替尼可克服部分耐藥現(xiàn)象，但對T315I(位于BCR-ABL1基因激酶域)突變的CML患者無效。第三代TKI帕那替尼克服了T315I突變導(dǎo)致的耐藥，但不良反應(yīng)嚴(yán)重。自噬是發(fā)生在真核細(xì)胞中的一種保守機(jī)制，基礎(chǔ)水平的自噬可維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和能量平衡。在饑餓、缺氧、藥物刺激、放射、病原體入侵等不利條件下，自噬被高度激活，一方面通過降解受損細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白減輕炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的進(jìn)一步損傷，另一方面可將氨基酸、脂肪酸等降解產(chǎn)物供細(xì)胞循環(huán)利用，幫助細(xì)胞克服應(yīng)激[2]。自噬對CML細(xì)胞的生存具有兩面性：一方面產(chǎn)生保護(hù)性作用，維持白血病細(xì)胞存活；另一方面可以促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡。現(xiàn)將藥物誘導(dǎo)自噬對CML的作用及機(jī)制、自噬調(diào)節(jié)劑的作用機(jī)制等相關(guān)研究進(jìn)展情況綜述如下。

1 自噬與腫瘤

自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有雙重作用[3]。腫瘤多發(fā)生在器官或組織受損的基礎(chǔ)上。自噬能幫助細(xì)胞清除有害物質(zhì)，維持基因組穩(wěn)定性。但如果自噬缺陷則增加基因錯(cuò)誤修復(fù)發(fā)生率，削弱細(xì)胞和機(jī)體對抗應(yīng)激的能力，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。腫瘤完全形成后，自噬將發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)一步惡化的作用，原因在于腫瘤細(xì)胞的過速增殖伴隨大量正常細(xì)胞的死亡和干細(xì)胞的激活，并導(dǎo)致局部缺血缺氧，此時(shí)腫瘤細(xì)胞依靠自噬緩解高代謝壓力，抵抗不良環(huán)境，繼而存活。

2 藥物誘導(dǎo)自噬對CML細(xì)胞的作用及其機(jī)制

自噬在腫瘤治療中的作用同樣也有雙面性。諸多化療藥物可誘導(dǎo)自噬，這可能與藥物導(dǎo)致的細(xì)胞應(yīng)激有關(guān)。一方面藥物誘導(dǎo)自噬可能是腫瘤的自我保護(hù)機(jī)制，另一方面藥物可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。藥物誘導(dǎo)自噬在促進(jìn)細(xì)胞生存或死亡這兩者之間的選擇和轉(zhuǎn)換可能與細(xì)胞類型、腫瘤分期、基因背景以及腫瘤微環(huán)境有關(guān)。

2．1 藥物誘導(dǎo)自噬對CML細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制 多種藥物可誘導(dǎo)CML細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬，包括TKI和非TKI。

2.1.1 TKI誘導(dǎo)自噬對CML細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制 TKI可激活自噬，并對CML細(xì)胞起保護(hù)作用。Mishima等[4]研究發(fā)現(xiàn)，IM誘導(dǎo)CML來源的K562細(xì)胞發(fā)生自噬，抑制自噬后不僅增強(qiáng)IM對野生型BCR-ABL1基因細(xì)胞的毒性效應(yīng)，而且促進(jìn)BCR-ABL1基因T315I突變的細(xì)胞死亡，該研究提示抑制自噬可克服頑固諸如T315I點(diǎn)突變導(dǎo)致的IM耐藥。

CML干細(xì)胞對IM不敏感，使得殘留的干細(xì)胞在停藥后快速增殖，這是CML復(fù)發(fā)的根本原因。Crowley等[5]研究發(fā)現(xiàn)，IM停藥后CML細(xì)胞的活力恢復(fù)伴隨高水平自噬，抑制自噬可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。此外有研究[6]發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)基因ATG4B在耐藥的白血病干/祖細(xì)胞中高表達(dá)，敲除ATG4B基因可以抑制自噬，使CML干細(xì)胞對IM的敏感性增加。以上研究結(jié)果提示抑制自噬有可能成為消除CML微小殘留病灶的新策略。

IM如何誘導(dǎo)自噬？自噬又如何促進(jìn)CML細(xì)胞存活？其機(jī)制仍未完全闡明。Sheng等[7]認(rèn)為內(nèi)源性BCR-ABL1基因可持續(xù)激活A(yù)kt/mTOR通路并負(fù)性調(diào)節(jié)自噬，而IM可能通過抑制BCR-ABL1/PI3K/AKT/FOXO4/ATF5/mTOR通路誘導(dǎo)自噬。Bellodi等[8]研究發(fā)現(xiàn)，IM誘導(dǎo)自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及鈣流動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)。Mancini等[9]也得到了類似的結(jié)論，并發(fā)現(xiàn)β-catenin 75 kDa剪接體參與IM誘導(dǎo)自噬的過程。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)IM誘導(dǎo)小鼠CML細(xì)胞32D-p210T315I和S4C2-1自噬流水平升高，且其mTOR及其下游分子p-4EBP1和p-70S6K表達(dá)減少，提示該自噬過程可能依賴mTOR表達(dá)。以上研究結(jié)果表明IM可通過自噬導(dǎo)致CML細(xì)胞耐藥，采用IM聯(lián)合自噬抑制劑的治療方案有望增強(qiáng)療效。

隨著第二、三代TKI的廣泛應(yīng)用，對自噬的研究擴(kuò)展到IM以外的其他靶向治療藥物。Bafetinib是一種BCR-ABL1/Lyn雙重抑制劑，可強(qiáng)烈誘導(dǎo)保護(hù)性自噬[10]。新型酪氨酸激酶抑制劑Thiotanib使CML細(xì)胞自噬水平升高，可能與Thiotanib抑制AKT/mTOR通路、激活Erk、促進(jìn)Beclin 1與Bcl-2解耦聯(lián)，形成自噬核心復(fù)合體Beclin1/Vps34等機(jī)制有關(guān)[11]。這些研究結(jié)果證實(shí)TKI可誘導(dǎo)保護(hù)性自噬，而抑制自噬有可能增強(qiáng)TKI的療效，促進(jìn)CML細(xì)胞死亡。

2.1.2 非TKI誘導(dǎo)自噬對CML細(xì)胞的保護(hù)作用及及其機(jī)制 非TKI也可誘導(dǎo)保護(hù)性自噬。α干擾素(IFNα)是前TKI時(shí)代廣泛用于CML治療的藥物，近年來由于TKI療效不足的顯現(xiàn)，IFNα又重新引起學(xué)者關(guān)注。IFNα通過JAK1-STAT1和RELA通路激活Beclin1，誘導(dǎo)自噬，而抑制自噬可激活Caspase8-Bid通路，增強(qiáng)IFNα的促凋亡作用[12]。

組蛋白乙?；疆惓Ｔ诎籽〉陌l(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要，組蛋白去乙?；敢种苿?SAHA)可通過周期阻滯、凋亡誘導(dǎo)、新生血管抑制等機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤活性。Carew等[13]研究發(fā)現(xiàn)，SAHA使CML細(xì)胞的自噬水平顯著升高，抑制自噬通過促進(jìn)溶酶體蛋白酶D向胞質(zhì)轉(zhuǎn)移而增強(qiáng)SAHA的促凋亡作用。

白血病細(xì)胞耐藥與Hedgehog(Hh)通路持續(xù)活化有關(guān)。Zeng等[14]發(fā)現(xiàn)抑制Hh通路也可誘導(dǎo)CML細(xì)胞發(fā)生自噬，聯(lián)用自噬抑制劑可顯著降低耐藥細(xì)胞的活性，并降低BCR-ABL1蛋白表達(dá)水平，對正常的外周血單個(gè)核細(xì)胞殺傷作用小。

2.2 藥物誘導(dǎo)自噬對CML細(xì)胞自噬性死亡的作用及其機(jī)制 適當(dāng)程度的自噬可以幫助細(xì)胞應(yīng)對不良條件，度過危機(jī)，但過度激活自噬將耗竭細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能量，即發(fā)生“自食”現(xiàn)象，促進(jìn)細(xì)胞走向衰亡。Elzinga等[15]認(rèn)為IM誘導(dǎo)自噬形成的自噬體可隔離BCR-ABL1蛋白，并進(jìn)一步將其降解。Goussetis等[16]發(fā)現(xiàn)三氧化二砷可以通過自噬功能蛋白p62/SQSTM1將BCR-ABL1蛋白錨定于自噬溶酶體，再通過組織蛋白酶cathepsin B將其降解，抑制自噬或阻止BCR-ABL1蛋白的降解。以上研究提示藥物可能通過誘導(dǎo)自噬降解BCR-ABL1蛋白，抑制細(xì)胞活性。

活性氧簇(ROS)是細(xì)胞代謝產(chǎn)生的強(qiáng)反應(yīng)活性分子，也是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生的重要原因。研究[17]發(fā)現(xiàn)，脂肪酸衍生物AIC-47通過PPAR/Catenin/BCR-ABL/mTOR/hnRNP/PKM通路使ROS生成增多，進(jìn)一步導(dǎo)致CML細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。

多種草本植物提取物都有良好的抗腫瘤效果，其對CML的作用也受到廣泛關(guān)注，如白藜蘆醇通過激活JNK通路使p62/SQSTM1蛋白聚集，同時(shí)上調(diào)AMPK表達(dá)，抑制mTOR通路，解除mTOR對自噬的抑制作用，從而誘導(dǎo)細(xì)胞走向自噬性死亡[18]。

近年來溶瘤腺病毒在腫瘤中的應(yīng)用研究成為熱點(diǎn)，其作用機(jī)制在于激活腫瘤細(xì)胞的凋亡通路。Tong等[19]構(gòu)建了過表達(dá)自噬基因Beclin 1的重組溶瘤腺病毒SG511-BECN，該病毒對正常細(xì)胞毒性極小，但可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)CML原始細(xì)胞死亡，而干擾自噬基因UVRAG、ATG5和ATG7。該研究揭示了自噬在溶瘤腺病毒治療中的作用。

3 自噬調(diào)節(jié)劑的作用機(jī)制

3.1 自噬抑制劑 化療藥物聯(lián)合自噬抑制劑的治療方案可增加腫瘤對化療藥物的敏感性。不同的自噬抑制劑的作用機(jī)制不同，主要有以下三方面：①抑制溶酶體功能：自噬底物降解需要溶酶體水解酶的參與，溶酶體烷化劑氯喹和羥氯喹可通過中和溶酶體囊泡的酸性而抑制該過程。氯喹衍生物L(fēng)ys05和Monensin有更強(qiáng)的親溶酶體性，可發(fā)揮更加顯著的自噬抑制作用[20]。目前羥氯喹聯(lián)合IM治療CML的Ⅱ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，有望成為CML治療的重大突破。②調(diào)節(jié)PI3K活性：哺乳動(dòng)物有三型PI3K。ClassⅠPI3K促進(jìn)mTOR活化，抑制自噬；Class Ⅲ PI3K是酵母細(xì)胞中液泡分選蛋白 34(Vps34)在哺乳動(dòng)物中的同源物，其與酵母自噬基因Beclin1、Vps15/p150、 ATG14L以及抗紫外線相關(guān)基因等形成自噬核心復(fù)合物，正性調(diào)節(jié)自噬。LY294002、渥曼青霉素、3-甲基腺嘌呤(3-MA)可同時(shí)抑制ClassⅠPI3K和Class Ⅲ PI3K，但通常對Class Ⅲ PI3K的抑制作用更強(qiáng)，故其作為自噬抑制劑被廣泛應(yīng)用。然而，近年來有研究[21]發(fā)現(xiàn)10 mmol/L的3-MA在體外可有效抑制自噬體形成，但相同劑量的3-MA在體內(nèi)卻促進(jìn)自噬的發(fā)生，原因可能是3-MA在體內(nèi)對ClassⅠPI3K的抑制作用更強(qiáng)。小分子化合物Spautin-1是一種新型強(qiáng)效自噬抑制劑，可通過靶向泛素特異性蛋白酶USP10和USP13促進(jìn)Beclin1和Vps34降解，進(jìn)而抑制自噬。Shao等[22]發(fā)現(xiàn)Spautin-1可逆轉(zhuǎn)CML細(xì)胞對IM的耐藥。此外，Mill等[23]設(shè)計(jì)了一系列靶向Vps34的化合物，如PT21等，將有望作為特異性自噬抑制劑得到應(yīng)用。③調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣水平：鈣離子是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的第二信使，參與多種信號通路調(diào)控，在自噬發(fā)生過程中也有不可或缺的作用。Ganley等[24]發(fā)現(xiàn)毒胡蘿卜內(nèi)酯可通過干擾鈣離子穩(wěn)態(tài)抑制自噬。

3.2 自噬激動(dòng)劑 對于化療藥物誘導(dǎo)的自噬，我們可以通過聯(lián)用自噬激動(dòng)劑進(jìn)一步增強(qiáng)自噬反應(yīng)，更快更徹底殺滅腫瘤細(xì)胞。雷帕霉素通過抑制mTORC1活性，誘導(dǎo)自噬。新型mTOR抑制劑PP242和Torin 1可同時(shí)抑制mTORC1和mTORC2而誘導(dǎo)自噬[25]。

Obatoclax是一種BH3域類似物，也參與自噬調(diào)控，可能機(jī)制是Obatoclax通過抑制Bcl-2和Mcl，解除與Beclin1的耦聯(lián)作用，促進(jìn)自噬[26]。Bonapace等[27]發(fā)現(xiàn)將Obatoclax與糖皮質(zhì)激素聯(lián)用可顯著抑制mTOR底物表達(dá)，觸發(fā)耐糖皮質(zhì)激素的ALL細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。

綜上所述，在CML治療過程中，多種藥物可誘導(dǎo)CML細(xì)胞發(fā)生自噬，但相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)卻不盡相同，既有可能促進(jìn)CML細(xì)胞存活，也有可能加速CML細(xì)胞死亡。這一現(xiàn)象與自噬水平高低、自噬所處時(shí)期、CML的發(fā)展階段、CML細(xì)胞所處的微環(huán)境、藥物種類及作用機(jī)制等息息相關(guān)。深入探索現(xiàn)有藥物對自噬的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)開發(fā)特異性的小分子自噬調(diào)節(jié)藥物，將其與化療聯(lián)合應(yīng)用，抑制保護(hù)性自噬或誘導(dǎo)自噬性死亡，將有望為CML的治療帶來新的契機(jī)。

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國家自然科學(xué)基資助項(xiàng)目(81372249)；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81300431)。

李玉華(E-mail: liyuhua2011gz@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.036

R733.72；R551.3

A

1002-266X(2016)43-0108-04

2016-07-23)