半枝蓮提取物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的凋亡作用及其對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

張　梅　韓松洋　葛圓圓　楊　丹　于英君

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室(哈爾濱 150040)

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半枝蓮提取物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的凋亡作用及其對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

張梅韓松洋葛圓圓楊丹于英君△

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室(哈爾濱 150040)

摘要目的：了解半枝蓮提取物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的凋亡作用及其對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討半枝蓮提取物的抗肺癌作用及其分子生物學(xué)作用機(jī)制。方法：采用70%乙醇水溶液制備半枝蓮提取物；實(shí)驗(yàn)組的半枝蓮提取物濃度為3 mg/L、6 mg/L、12 mg/L，對(duì)照組不加藥物。采用MTT法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；采用RT-PCR法測(cè)定細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Survivin、Caspase-3和內(nèi)對(duì)照β-actin的表達(dá)水平。結(jié)果：3 mg/L、6 mg/L、12 mg/L濃度實(shí)驗(yàn)組的OD值均低于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組的抑制率分別為(23.53±5.84)%、(39.71±6.77)%和(66.18±8.45)%。對(duì)照組3 mg/L、6 mg/L、12 mg/L濃度實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率分別是(3.76±0.82)%、(16.61±3.19)%、(21.34±4.52)%、(35.19±5.80)%；3 mg/L、6 mg/L、12 mg/L濃度實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組。3 mg/L、6 mg/L、12 mg/L濃度實(shí)驗(yàn)組的Survivin/β-actin均低于對(duì)照組；3 mg/L、6 mg/L、12 mg/L濃度實(shí)驗(yàn)組的Caspase-3/β-actin均高于對(duì)照組。結(jié)論：半枝蓮提取物可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用抑制人肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，其分子機(jī)制為下調(diào)Survivin的表達(dá)水平和上調(diào)Caspase-3的表達(dá)水平。

主題詞半枝蓮@人肺癌A549細(xì)胞細(xì)胞凋亡

半枝蓮(ScutellariabarbataD.Don)是馬唇形科黃芩屬多年生草本植物半枝蓮的干燥全草，有散瘀止痛、涼血解毒、清熱利濕和消腫之功效。半枝蓮的有效成分有黃酮類(lèi)、生物堿、鞣質(zhì)和甾體類(lèi)等化合物，有抗腫瘤作用，可與西藥和其他中藥聯(lián)合應(yīng)用用于肝癌、胃癌、肺癌、結(jié)直腸癌、白血病等多種惡性腫瘤的治療[1-3]。目前半枝蓮及其有效成分的抗腫瘤機(jī)制尚未完全明確，文獻(xiàn)報(bào)道半枝蓮提取物可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用抑制人肝癌QGY-7701、Hep-G2細(xì)胞和人白血病K562細(xì)胞的生長(zhǎng)[4-7]。生存素是已經(jīng)探明其作用的細(xì)胞凋亡抑制因子，可發(fā)揮較強(qiáng)的抑制細(xì)胞凋亡作用，主要作用機(jī)制是抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游Caspase-7、Caspase-3因子的活性[8]。本文考察了半枝蓮提取物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的抑制率和細(xì)胞凋亡率，并檢測(cè)了細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Survivin、Caspase-3的表達(dá)水平，旨在了解半枝蓮提取物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的凋亡作用及其對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討半枝蓮提取物的抗肺癌作用及其分子生物學(xué)作用機(jī)制。

1材料1.1細(xì)胞人肺癌A549細(xì)胞株由黑龍江腫瘤研究所提供。細(xì)胞培養(yǎng)基為加入100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640液體培養(yǎng)基，置5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h以上至細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2試劑與儀器半枝蓮購(gòu)自黑龍江省中醫(yī)院中藥房，產(chǎn)地為中國(guó)河北；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol總RNA抽提試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；AnnexiuV-PI雙染試劑盒(普利萊公司)；PCR引物由寶生物工程有限公司合成；RT-PCR試劑盒(美國(guó)Promega公司)。IX83型倒置顯微鏡；DNM-9606型酶標(biāo)分析儀；L96G/Y型PCR基因擴(kuò)增儀。

2實(shí)驗(yàn)方法2.1半枝蓮提取物的制備將半枝蓮粉碎為干粗粉，取50 g半枝蓮粉，采用70%乙醇水溶液溫度40℃下浸泡3 h，取濾液，并重復(fù)上述浸泡操作兩次，合并3次浸泡的濾液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)得半枝蓮浸膏[9-10]，采用適量二甲亞砜溶解浸膏，使成濃度為12 mg/L半枝蓮提取物。

2.2藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制試驗(yàn)采用MTT法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞用培養(yǎng)基稀釋后置96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔的細(xì)胞濃度為1.0×104個(gè)/mL，置5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h。吸去每個(gè)孔內(nèi)的培養(yǎng)液，并加入用培養(yǎng)基稀釋為濃度0、3、6、12 mg/L半枝蓮提取物200 μL，每個(gè)濃度均設(shè)置5個(gè)平行孔，并設(shè)置對(duì)照孔。置5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中37℃繼續(xù)培養(yǎng)42 h，每孔中均加入濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h后停止培養(yǎng)，吸去每孔的培養(yǎng)液，均加入150 μL二甲基亞砜，將96孔板置于震蕩器中持續(xù)震蕩15 min使每孔成均勻的細(xì)胞混懸液。將96孔板置酶標(biāo)儀中在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)試每孔的光吸收值(OD值)。抑制率(%)=(1-加藥孔OD值/陰性對(duì)照孔OD值)×100%。

2.3細(xì)胞凋亡率檢測(cè)收集藥物作用后的各組細(xì)胞2×105個(gè)，置離心機(jī)中1500 r/min速度離心5 min，僅保留沉淀，采用PBS溶液洗滌沉淀3次，加入200 μL的結(jié)合液重懸細(xì)胞，分別加入AnnexinV-FITC與PI各5μL，混勻，避光孵育15min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.4細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平收集藥物作用后的各組細(xì)胞，采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞的總RNA，采用RT-PCR法測(cè)定細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Survivin、Caspase-3和內(nèi)對(duì)照β-actin的表達(dá)水平，所需引物經(jīng)Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證。RT-PCR的體系總體積為50 μL，其中逆轉(zhuǎn)錄的溫度45℃反應(yīng)時(shí)間45 min，逆轉(zhuǎn)錄酶AMV-RT滅活與預(yù)變性的溫度94℃反應(yīng)時(shí)間2 min，PCR反應(yīng)共35個(gè)循環(huán)，條件分別為94℃×30 s、57℃×1 min和68℃×2min，鏈延伸溫度為68℃時(shí)間7 min，反應(yīng)終止溫度為4℃[11]。采用密度掃描儀分析條帶光密度，采用內(nèi)對(duì)照基因β-actin的表達(dá)水平確定標(biāo)本的Survivin、Caspase-3基因表達(dá)量。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS Statistics 22統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

3結(jié)果3.1對(duì)A549細(xì)胞的抑制率3mg/L、6 mg/L、12 mg/L半枝蓮提取物濃度實(shí)驗(yàn)組的OD值均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=4.525、6.548、16.296，均P<0.05)。半枝蓮提取物對(duì)A549細(xì)胞的抑制率見(jiàn)表1。

3.2A549細(xì)胞的的細(xì)胞凋亡率經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)，對(duì)照組、3 mg/L、6 mg/L、12 mg/L半枝蓮提取物濃度實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率分別是(3.76±0.82)%、(16.61±3.19)%、(21.34±4.52)%、(35.19±5.80)%；3 mg/L、6 mg/L、12 mg/L半枝蓮提取物濃度實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=11.035、10.824、15.176，均P<0.05)。

3.3細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平經(jīng)過(guò)光密度掃描分析，3 mg/L、6 mg/L、12 mg/L半枝蓮提取物濃度實(shí)驗(yàn)組的光密度積分值Survivin/β-actin均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=2.263、3.373、5.336，均P<0.05)；3 mg/L、6 mg/L、12 mg/L半枝蓮提取物濃度實(shí)驗(yàn)組的光密度積分值Caspase-3/β-actin均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=2.173、4.396、7.257，均P<0.05)。細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平見(jiàn)表2。

4討論半枝蓮及其提取物均具有良好的抗腫瘤活性，可在體外和動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[12-13]。研究表明，半枝蓮提取物可抑制和清除自由基，抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)荷瘤小鼠脾細(xì)胞分泌免疫因子TNF-α和IL-2，使小鼠的淋巴細(xì)胞功能顯著提高，并可明顯降低H22肝癌小鼠的腫瘤重量，促進(jìn)腫瘤組織的吸收[14]。本研究的MTT試驗(yàn)表明，不同濃度的半枝蓮提取物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞有不同程度的抑制率，且這種抑制腫瘤的作用伴隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，顯示出一定的濃度依賴(lài)性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，不同濃度的半枝蓮提取物可誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度的增加而提高，這提示半枝蓮提取物抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制在于誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡[15]。

Survivin具有抗細(xì)胞凋亡作用，可阻斷線粒體釋放細(xì)胞色素C的水平，同時(shí)可結(jié)合下游細(xì)胞凋亡因子Caspase-3、Caspase-7，通過(guò)抑制凋亡因子的活性表現(xiàn)出抗凋亡作用。Survivin還可與細(xì)胞周?chē)蕾?lài)性激酶4(CDK4)相結(jié)合，形成CDK4-Survivin復(fù)合物，進(jìn)而釋放P21，P21可有效抑制線粒體中的凋亡因子Caspase-3的活性，表現(xiàn)出抗凋亡作用[16]。此外，Survivin還可與結(jié)合腫瘤細(xì)胞中的紡綞體纖維，抑制Caspase-3因子對(duì)紡綞體纖維的水解過(guò)程，從而保護(hù)腫瘤細(xì)胞的有絲分裂進(jìn)程，同樣發(fā)揮出抗細(xì)胞凋亡效應(yīng)[17]。本研究的RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果表明半枝蓮提取物可為下調(diào)Survivin的mRNA表達(dá)水平和上調(diào)Caspase-3的mRNA表達(dá)水平，且對(duì)Survivin、Caspase-3基因表達(dá)量的影響具有劑量依賴(lài)性。因而，半枝蓮提取物誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制在于下調(diào)A549細(xì)胞的Survivin基因表達(dá)水平，減弱了Survivin對(duì)細(xì)胞凋亡因子Caspase-3活性的抑制作用，解除Survivin的抗細(xì)胞凋亡作用，從而使A549細(xì)胞的凋亡程序得以進(jìn)行，最終表現(xiàn)出對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。

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(收稿2016-01-28；修回2016-03-05)

Apoptotic effect of scutellaria barbata D. Don extract on human lung cancer cell A549 and effect on expression of apoptosis related genes

Department of Biochemistry and Molecular Biology, Heilongjiang University of TraditionalChinese Medicine(Harbin150040 )

Zhang MeiHan SongyangGe Yuanyuanet al

KEY WORDSScutellaria barbataD. Don@Human lung cancerA549 cellsApoptosis

ABSTRACTObjective：To learn the apoptotic effect of Scutellaria barbata D. Don extract on human lung cancer cell A549 and effect on the expression of apoptosis related genes.To investigate the anti lung cancer effect of Scutellaria barbata D. Don extract and its molecular mechanism. Methods： Scutellaria barbata D. Don extract was prepared by 70% ethanol aqueous solution. The concentrations of Scutellaria barbata D. Don extract in experimental groups were 3 mg/L, 6 mg/L and 12 mg/L. The control group without drug. MTT method was used to determine the inhibitory rate of drug on cell growth. The apoptosis rate was detected by flow cytometry. The expression levels of apoptosis related genes Survivin, Caspase-3 and internal control gene β-actin were determined by RT-PCR method. Results：ODs of 3 mg/L, 6 mg/L and 12 mg/L concentration experimental groups were lower than the control group; inhibition rates of the experimental groups were (23.53±5.84) % and (39.71±6.77) % and (66.18±8.45) %, respectively. The apoptosis rates of the control group, 3 mg/L, 6 mg/L, 12 mg/L concentration experimental groups were (3.76±0.82) %, (16.61±3.19) %, (21.34 ±4.52) %, (35.19±5.80) %; 3 mg/L, 6 mg/L, 12 mg/L concentration experimental groups were higher than the control group. Survivin/β-actin ratios of 3 mg/L, 6 mg/L, 12 mg/L concentration experimental group were lower than the control group. Caspase-3/β-actin ratios of 3 mg/L, 6 mg/L, 12 mg/L concentration experimental group were higher than the control group. Conclusions：Scutellaria barbata D. Don extract can inhibit the growth of human lung cancer A549 cells by inducing cell apoptosis, and the molecular mechanism are down-regulating the expression level of Survivin and up-regulating expression level of Caspase-3.

通訊作者△

【中圖分類(lèi)號(hào)】R563

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.06.052