雙丹口服液的HPLC指紋圖譜研究*

李　驊　高　雅　楊　倩　謝艷華　張邦樂　畢琳琳　靳雨晨　張曉良　王四旺

第四軍醫(yī)大學(西安710032)

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雙丹口服液的HPLC指紋圖譜研究*

李驊高雅楊倩謝艷華張邦樂畢琳琳靳雨晨張曉良王四旺△

第四軍醫(yī)大學(西安710032)

摘要目的：建立雙丹口服液凍干粉的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜，為該藥的質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法：色譜條件為：色譜柱ZORBAX SB C18(250 mm × 4.6 mm 5 μm，Agilent)，柱溫30 °C，流動相為甲醇與2%冰醋酸。采用梯度洗脫程序：甲醇-2%冰醋酸(5∶95，v/v)0 min，(5∶95)10 min，(25∶75)30 min，(40∶60)50 min，(60∶40)70 min，流速1 mL/min，進樣量20 μL，檢測波長280 nm；以建立的HPLC分析方法對雙丹凍干粉進行指紋圖譜分析表征，確認各物質(zhì)成分歸屬。結(jié)果：雙丹凍干粉指紋圖譜中有11個共有特征峰，其中1、6和11號峰分別為源自牡丹皮的沒食子酸、芍藥苷和丹皮酚，2、3、4、5、7、8、9和10號峰分別為源自丹參的丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A。結(jié)論：本次研究為后續(xù)雙丹各制劑的整體質(zhì)量描述和評價及雙丹凍干粉給藥后血中移行成分的分析奠定了基礎，也為進一步探討雙丹方的物質(zhì)基礎及作用機制提供了依據(jù)。

主題詞色譜法@雙丹口服液

中藥復方所含化學成分復雜，復方藥效的發(fā)揮是其所含多種化學成分的整體表現(xiàn)。此外，中藥配伍成復方后，其原生化合物種類增多，對加工處理(如煎煮、滲濾)的反應性增強，極易引起處方中各原生化合物間的化學反應，生成新的體外次代謝生產(chǎn)物[1]。因此，尋找一種能夠全面準確的反映復方整體化學成分信息的質(zhì)控手段也正是中藥復方科學化、現(xiàn)代化所面臨的難點之一。中藥指紋圖譜技術是目前國際公認的控制中藥或天然藥物質(zhì)量的有效手段，它可以較全面地反映中藥所含化學成分的種類與數(shù)量，進而為中藥復方物質(zhì)基礎研究提供科學、合理的依據(jù)[2- 3]。

丹參、牡丹皮藥對，收載于《施今墨對藥臨床經(jīng)驗集》，是中國近代著名中醫(yī)臨床家施今墨先生臨床辨證施治的經(jīng)驗方劑，亦名雙丹方。方中丹參味苦微寒，能通行血中之滯，涼散血中之熱，清心陰安心神，祛瘀而生新；牡丹皮辛苦而寒，功善涼血活血，能行瘀血，安絡血，入血分清熱化滯，清透陰分伏邪；二藥相須配伍，同氣相求，共奏涼血活血，清透邪熱之功，屬于非常經(jīng)典的清熱活血組合[4]。其口服液劑型被收載于2005、2010和2015年版的《中國藥典》(一部)，具有活血化瘀、通脈止痛的功效，用于瘀血痹阻所致的胸痹，癥見胸悶、心痛，在部分地區(qū)應用量大[5]。雙丹口服液主要有效成分為酚酸類成分，藥典中僅以丹參素的含量作為質(zhì)量控制指標，雖然此方法簡單易行，但并未納入源自牡丹皮的化學成分以及丹參中的其他化學成分，尚不能全面控制雙丹口服液的整體質(zhì)量[6-9]。此外，與多數(shù)中藥復方一樣，雙丹方所含化學成分復雜，藥效物質(zhì)基礎尚不明確，一定程度上限制了其國際化推廣。本課題按照文獻制備工藝[5]，利用HPLC-UV技術建立雙丹口服液凍干粉(簡稱雙丹凍干粉)指紋圖譜，為后續(xù)雙丹相關制劑的整體質(zhì)量控制和評價奠定基礎，為進一步探討雙丹方的物質(zhì)基礎及作用機制提供依據(jù)。

1儀器與試藥 1.1儀器Shimadzu LC-2010A HT型高效液相色譜系統(tǒng)(島津制作所，日本)； Sartorius ME235S型微量分析天平(賽多利斯儀器系統(tǒng)集團公司，德國)；Eppendorf Certrifuge 5417R型臺式高速冷凍離心機(艾本德生命科技集團公司，德國)；Milli-Q Academic超純水系統(tǒng)(Merck Millipore集團公司，德國)； SK2510LHC型雙頻加熱型超聲波清洗器。

1.2試藥雙丹凍干粉(第四軍醫(yī)大學藥物研究所提供，10批，編號為B1～B10)；沒食子酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110831-200803)；丹參素鈉對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110855-201210)；原兒茶醛對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110810-201007)；原兒茶酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110809-201205)；咖啡酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110885-200102)；芍藥苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110736-201136)；紫草酸對照品(寶雞辰光生物科技有限公司，批號：20130827)；迷迭香酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：111871-201203)；丹酚酸A對照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-13020701)；丹酚酸B對照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-13103113)；丹皮酚對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110708-200506)；甲醇(色譜純，美國霍尼韋爾國際集團公司)；冰醋酸(色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司)。

2方法與結(jié)果 2.1色譜條件色譜柱：ZORBAX SB C18(250 mm × 4.6 mm 5 μm，Agilent)，柱溫：30 °C；流動相為甲醇與2%冰醋酸，采用梯度洗脫法，時間程序為：甲醇-2%冰醋酸(5∶95，v/v)0min，(5∶95，v/v)10min，(25∶75，v/v)30 min，(40∶60，v/v)50 min，(60∶40，v/v)70 min，流速1 mL/min(洗脫程序詳見表1)；進樣量：20 μL，檢測波長：280 nm。

2.2溶液的制備供試品溶液制備：將雙丹凍干粉粉末研細，精密稱取1.0 g于50 mL棕色容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，稱重并于室溫下靜置15 min，超聲清洗儀震蕩30 min，冷卻至室溫后稱重，以50%甲醇補足前后兩次稱重質(zhì)量差，渦旋振蕩20 s，靜置后將上層澄清液于12000 r/min高速離心15 min，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。以同樣方法分別制備缺牡丹皮、缺丹參陰性樣品溶液。

對照品溶液制備：精密稱取沒食子酸、丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸、咖啡酸、芍藥苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A、丹酚酸B及丹皮酚對照品適量于25 mL棕色容量瓶中，用50%的甲醇溶液定容至刻度，配制成對照品混合溶液母液。

2.3方法學考察2.3.1精密度實驗:取批號為B4的雙丹凍干粉，制得供試品溶液，以擬定的色譜條件進行HPLC檢測。結(jié)果表明，樣品溶液(B4)中各共有峰RRT的RSD均小于0.49%，RPA的RSD均小于1.67%，表明儀器精密度良好，符合相關技術標準[10]。

2.3.2重復性實驗:取批號為B4的雙丹凍干粉，制得供試品溶液，共6份，以擬定的色譜條件進行HPLC檢測，記錄各色譜峰的RPA和RRT，計算RSD值。結(jié)果顯示，樣品溶液(B4)中各共有峰RRT的RSD均小于0.46%，RPA的RSD均小于2.53%，表明當前測定方法具有較好的可重復性，符合相關技術標準[10]。

2.3.3穩(wěn)定性實驗:取批號為B4的雙丹凍干粉，制得供試品溶液，室溫放置，分別于0、120、240、480、720和1440 min以擬定的色譜條件進行HPLC檢測，記錄各色譜峰的RPA和RRT，計算RSD值。結(jié)果顯示，樣品溶液(B4)中各共有峰RRT的RSD均小于0.47%，RPA的RSD均小于1.77%，表明樣品溶液(B4)在1440 min內(nèi)基本穩(wěn)定，符合相關技術標準[10]。

2.4測定及分析2.4.1指紋圖譜測定:10批雙丹凍干粉樣品按擬定(2.2項)方法分別制得供試品溶液，擬定(2.1項)色譜條件進行HPLC檢測，記錄各供試品溶液所得圖譜。結(jié)果如圖1所示。

2.4.2共有峰的標定:由色譜工作站輔助自動進行峰匹配，確定11個共有峰(CP)。參照峰的選取原則以共有峰中峰面積較大、出峰時間較穩(wěn)定為標準，以指定參照峰的峰面積以及出峰時間為基準，其他各共有峰的峰面積及出峰時間分別與其相比，通過分析運算得出10批雙丹凍干粉指紋圖譜中各共有峰的RPA和RRT。11號色譜峰符合參照峰條件，經(jīng)標準品比對認定為丹皮酚的吸收峰，以其為參照峰，圖譜中共有峰的RRT和RPA計算結(jié)果見表2及表3。

2.4.3相似度評價:以所得圖譜中各CP峰面積的中位數(shù)為基準，分別通過“夾角余弦法(IAC)”以及“相關系數(shù)法(CC)”兩種方法評價10個批次雙丹凍干粉指紋圖譜的整體相似度[11]。結(jié)果表明，兩種相似度評價方法所得樣品相似度均在0.99以上。

2.4.4指紋圖譜共有峰的歸屬:取批號為B4的雙丹凍干粉、缺丹參凍干粉供試品溶液、缺牡丹皮凍干粉供試品溶液及對照品溶液，以擬定的色譜方法進樣檢測，分別對照各樣品所得液相色譜圖，確定CP及其歸屬。如圖所示，經(jīng)過對比雙丹凍干粉、缺牡丹皮陰性樣品、缺丹參陰性樣品色譜圖。

a：標準品；b：雙丹凍干粉(B4)；c：缺牡丹皮陰性樣品；d：缺丹參陰性樣品；1. 沒食子酸，2. 丹參素，3. 原兒茶酸，4. 原兒茶醛，5. 咖啡酸，6. 芍藥苷，7. 紫草酸，8. 迷迭香酸，9. 丹酚酸B，10. 丹酚酸A，11. 丹皮酚

圖2雙丹供試品及標準品色譜圖

雙丹凍干粉指紋圖譜的11個共有峰中，1、6、11號峰來源自牡丹皮，2、3、4、5、7、8、9、10號峰均來源自丹參。通過標準品UV光譜與保留時間對色譜峰進行定性認定，確定1、6、11號峰分別為沒食子酸、芍藥苷和丹皮酚，2、3、4、5、7、8、9和10號峰分別為丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A。

3討論多成分、多靶點、多通路整合式“霰彈”作用，是中藥復方治療疾病的主要特點之一。與多數(shù)中藥復方一樣，雙丹方系列制劑臨床療明確，但因化學組成成分不清，體內(nèi)作用的藥效物質(zhì)基礎及作用機制尚未闡明，無法為臨床療效提供進一步詳實的科學依據(jù)，一定程度上限制了其科學應用及國際推廣。中藥復方指紋圖譜是中藥成分信息的化學表征，也是目前國際認可的能夠較全面的反映中成藥、天然藥物所含化學成分信息的有效方法[12-13]。中藥復方指紋圖譜技術能夠?qū)㈩A處理后的中藥復方復雜體系通過直觀的色譜、質(zhì)譜及光譜(或其聯(lián)用圖譜)加以反映，基于圖譜中化學成分的表征，后續(xù)還可開展一系列與復方相關的藥動、藥效學研究。因此，建立雙丹方的指紋圖譜對于雙丹系列制劑的質(zhì)量控制和物質(zhì)基礎研究都具有重要意義。

預實驗中曾利用沃特世色譜儀配備的2996型二極管陣列檢測器對雙丹凍干粉供試品和相關混合標準品溶液進行全波長掃描(210～400 nm)，發(fā)現(xiàn)在280 nm各被檢物質(zhì)均有較強UV吸收峰，且背景噪音信號較小，對各被檢物質(zhì)峰無干擾，因此選定280 nm作為檢測波長。雙丹凍干粉中多種成分遇熱不穩(wěn)定且在高濃度醇溶液中不穩(wěn)定[14-15]，故采用超聲提取法，選用25%甲醇、50%甲醇、70%甲醇為溶劑，考察溶劑對提取效果以及被檢物質(zhì)色譜信息的影響。最終確定以50%甲醇為溶劑，超聲處理(頻率：53 Khz，時間：30 min)作為樣品提取方法。雙丹制劑中多種水溶性成分由于含有酚羥基而使自身在溶液中呈弱酸性，洗脫過程中會出現(xiàn)色譜峰拖尾情況，因此考慮在洗脫溶劑中加入適量酸以抑制酚羥基上H+的電離，以改善譜圖峰型?？疾炝思状?水、甲醇-2%冰醋酸、甲醇-0.5%磷酸等不同流動相體系，以及等度洗脫和梯度洗脫等不同的洗脫程序，測定顯示采用甲醇-2%冰醋酸梯度洗脫所得各樣品峰形好，干擾成分少，保留時間合適，故選此洗脫系統(tǒng)作為流動相。根據(jù)所選流動相，色譜柱應耐酸并能承受較大水相，試驗中曾試用Agilent ZORBAX SB C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色譜柱、Ultimate XB C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色譜柱、Yilite SinoChrom ODS-BP C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色譜柱，對比發(fā)現(xiàn)經(jīng)安捷倫ZORBAX SB C18色譜柱分離后的譜圖信息全面，各被測物質(zhì)峰均能達到良好分離，故最終確定選用此色譜柱。

本研究首次建立了雙丹凍干粉的HPLC-UV指紋圖譜，明確了其所含的11種主要物質(zhì)成分，分別為來源于牡丹皮的沒食子酸、芍藥苷和丹皮酚，來源于丹參的丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B及丹酚酸A。該結(jié)果使得雙丹方(制劑)中眾多尚不明了的物質(zhì)成分得到明晰，各物質(zhì)成分的歸屬也由無序發(fā)展為有序。雙丹指紋圖譜分析方法的建立，為后續(xù)雙丹各制劑的整體質(zhì)量描述和評價及雙丹凍干粉給藥后血中移行成分的分析奠定了基礎。也為進一步探討雙丹方的物質(zhì)基礎及作用機制提供了依據(jù)。

參考文獻

[1]楊倩, 王四旺.植物次生代謝物質(zhì)研究與新藥發(fā)現(xiàn)——談中藥復方及其體內(nèi)外次生代謝化合物研究的思考[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志, 2010, 19(13): 62-63.

[2]齊鳳琴.酸棗仁湯改善睡眠作用的藥效物質(zhì)基礎研究[D].哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學, 2011.

[3]Song XY, Li YD, Shi YP, et al. Quality control of traditional Chinese medicines: a review[J]. Chin J Nat Med,2013, 11(6): 596-607.

[4]李貴海, 涂曉龍.常用中藥藥對分析與應用[M].北京:人民衛(wèi)生出版社, 2009, 482-484.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社出版, 2015:733-734.

[6]李驊, 楊倩, 王四旺, 等.高效液相色譜法測定雙丹膠囊中丹皮酚的含量[J].解放軍藥學學報, 2011, 27(3): 251-253.

[7]Li H, Wang SW, Zhang BL, et al. Simultaneous quantitative determination of 9 active components in traditional Chinese medicinal preparation Shuangdan oral liquid by RP-HPLC coupled with photodiode array detection[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2011, 56(4): 820-824.

[8]李驊,謝艷華,張邦樂,等. RP-HPLC法同時測定雙丹口服液中沒食子酸、丹參素和原兒茶醛的含量[J].中國醫(yī)藥導報, 2012, 9(5): 117-118.

[9]Li H, Wang S, Xie Y, et al. Simultaneous determination of danshensu, salvianolic acid B, and paeonol in shuangdan oral liquid by HPLC[J]. Journal of AOAC International, 2013, 96(1): 20-23.

[10]中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)[J].中成藥, 2000, 22(10): 3-7.

[11]韋建榮, 馬銀海.Excel與中藥色譜指紋圖譜相似度計算[J].昆明師范高等專科學校學報,2007,29(4): 110-112.

[12]陳莉雯,李毅民, 謝瑞芳,等.黃連解毒湯HPLC指紋圖譜的建立[J].陜西中醫(yī), 2015，36(2): 238-242.

[13]楊娟英,林玉紅, 謝偉, 等.參仙生脈口服液HPLC指紋圖譜研究[J].陜西中醫(yī), 2011, 32(9): 1239-1240.

[14]劉德茂,史德勝.雙丹口服液中丹酚酸B和丹參素的穩(wěn)定性研究[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床,2009, 24(2): 102-104.

[15]關大衛(wèi). HPLC法測定注射用丹參粉針中丹參素的含量[J].藥物分析雜志, 1994, 14(3): 36-37.

(收稿2016-02-23；修回2016-03-05)

HPLC fingerprint study of Shuangdan oral liquid

The Fourth Military Medical University(Xi’an 710032)

Li HuaGao YaYang Qianet al

KEY WORDSChromatography@Shuangdan oral liquid

ABSTRACTObjective: To establish the HPLC fingerprints for the quality control of Shuangdan oral liquid and provide information on the therapeutic material bases of Shuangdan prescription. Methods: Separation was performed at 30 °C on ZORBAX SB C18 (250 mm×4.6 mm 5 μm, Agilent) with a mobile phase gradient (flow rate: 1 mL·min-1) prepared from methanol and 2% aqueous glacial acetic acid (v/v). The detection wavelength was 280 nm. The method was applied for the identification of major components in chemical fingerprint of SD lyophilized powder. Results: 11 main peaks exist in ten sample profiles were selected as the common peaks. The 11 compounds were simultaneously identified by UV spectrum and relative retention time compared with the reference standards. They are gallic acid, paeoniflorin and paeonol from Cortex Moutan and danshensu, protocatechuic acid, protocatechuic aldehyde, caffeic acid, lithospermic acid, rosmarinic acid, salvianolic acid B and salvianolic acid A from Radix Salvia Miltiorrhizae. Conclusion: This method could provide reference standard for the quality control of Shuangdan oral liquid and its related preparations, and could also provide more informations on the therapeutic material bases of Shuangdan prescription.

通訊作者△

【中圖分類號】R282

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.06.043

*陜西省科學技術研究發(fā)展計劃項目(2012K19-03-02；2013K12-07-05)