落花生枝葉抗氧化作用研究*

錢春美　王璐玲　管　宇　李　寧　李永新　張曉峰

上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院(上海 200071)

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·方藥縱橫·

落花生枝葉抗氧化作用研究*

錢春美王璐玲管宇李寧李永新張曉峰△

上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院(上海 200071)

摘要目的：研究花生枝葉水提液體外抗氧化作用強度及其量效關系。方法：采用生化試劑盒測定花生枝葉水提物的總抗氧化能力及對羥自由基、超氧陰離子自由基的清除能力，評價花生枝葉水提物的體外抗氧化作用。結果：花生枝葉的水提物在濃度為0.9766～125 mg/mL，總抗氧化作用與濃度有一定的量效依賴關系，且在濃度為62.5mg/mL時，趨于平穩(wěn)。抗羥自由基能力與抗超氧陰離子自由基能力在0.9766～1000 mg/mL一定濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增長而加強，到達一定濃度時又下降。結論：花生枝葉水提液有明顯的抗氧化作用，在一定濃度間，存在量效關系。

主題詞抗氧化@落花生枝葉自由基

落花生枝葉性寒，味甘，微苦澀，入肝、心、肺三經(jīng)，具有平肝潛陽、安神健腦、鎮(zhèn)咳止血的功能，主治各種原因引起的失眠癥，以及腦動脈硬化、高血壓、小兒夜啼、多動癥、氣管炎等[1-2]。落花安神合劑作為我院的院內(nèi)制劑，其成分為花生枝葉水提液，治療失眠有很好的療效，有鎮(zhèn)靜催眠，增強免疫的藥效[3]。前期研究，我們發(fā)現(xiàn)花生枝葉水提液能降低同型半胱氨酸(Hcy)，抑制斑塊的增長，具有治療動脈粥樣硬化(AS)的作用[4]。而氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)的形成對動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生發(fā)展起到很關鍵的作用，主要通過刺激相關受體、分泌細胞因子等誘導內(nèi)皮細胞損傷，加重AS[5]。本研究采用生化試劑盒測定花生枝葉水提物的總抗氧化能力及清除羥自由基、超氧陰離子自由基的能力。

1材料1.1試 劑花生枝葉，總抗氧化能力測定試劑盒(批號：20140118)、抗羥自由基測定試劑盒(批號：20140117)、抗超氧陰離子自由基測定試劑盒(批號：20140120)，均購于南京建成生物工程研究所。

1.2儀器7146純水儀，Thermo；Varioscan Flash多功能酶標儀， Thermo。

2方法2.1花生枝葉水煎液提取定量稱取落花生枝葉100g，加10倍量的水浸泡30min，共煎煮3次，煎煮時間分別為1h。每次藥液通過6號(100目)篩子過濾，合并藥液，濃縮至1∶1比例，獲得水煎液A(1g生藥/mL)備用。

2.2花生枝葉提取物總抗氧化能力(T-AOC)的測定將水煎液A用雙蒸水稀釋成125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.6 mg/mL、 7.8125 mg/mL、3.9063 mg/mL、1.9531 mg/mL、0.9766 mg/mL作為測定液備用?？寡趸镔|(zhì)能使Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+可與鄰二氮菲結合形成穩(wěn)定的Fe2+-鄰二氮菲絡合物，可通過比色法測定，從而推知體系的總抗氧化能力。具體操作步驟，參考總抗氧化能力測定試劑盒說明書操作，于520nm波長處測各管吸光度。37℃條件下，每分鐘每毫升測定液使反應體系吸光度增加0.01為一個抗氧化能力單位(U/mL)。

2.3清除羥自由基能力的測定將水煎液A用雙蒸水稀釋成500mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.6 mg/mL、7.8125 mg/mL、3.9063 mg/mL、1.9531 mg/mL、0.9766 mg/mL作為測定液備用。Fe3+與H2O2反應，H2O2被分解成·OH和OH-，griess試劑使之顯紅色，其呈色與·OH的量成正比。具體操作步驟，參考 Fenton 測定試劑盒說明書操作，于 550nm 波長處測定各管吸光度。以近似質(zhì)量濃度 VC作為對照，比較二者清除羥自由基能力的強弱。

2.4清除超氧陰離子自由基能力的測定將水煎液A用雙蒸水稀釋成1000 mg/mL、500mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.6 mg/mL、7.8125 mg/mL、3.9063 mg/mL作為測定液備用。模擬機體中黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基O2-·，加入電子傳遞物質(zhì)及griess氏顯色劑，使反應體系呈現(xiàn)紫紅色，測其吸光度，當被測樣本中含有 O2-· 抑制劑時，則比色時測定管的吸光度低于對照管的吸光度，以VC做為標準，可計算出被測物品對O2-· 的清除能力。具體操作步驟，參考抗超氧陰離子自由基測定試劑盒說明書操作，于 550nm 波長處測定各管吸光度。以近似質(zhì)量濃度 VC作為對照，比較二者清除超氧陰離子自由基能力的強弱。

3結果3.1總抗氧化能力(T-AOC)的測定從圖1可以看出，花生枝葉水提物具有將強的總抗氧化能力，并且隨著提取液的濃度增大，總抗氧化能力增強。表現(xiàn)出明顯的量效依賴關系，且在濃度為62.5mg/mL時上升幅度小。

3.2清除羥自由基能力的測定從圖2可以看出，花生枝葉水提物濃度在0.976563～7.8125mg/mL，抗羥自由基的能力隨著提取液的濃度增大。濃度在15.625～500mg/mL，其抗羥自由基的能力反而下降。

3.3清除超氧陰離子自由基能力的測定從圖3可以看出，花生枝葉水提物濃度在3.9063～250mg/mL， 清除超氧陰離子自由基能力隨著提取液的濃度增大。濃度在250～1000mg/mL，其清除超氧陰離子自由基能力逐漸下降。

4討論落花生又名“花生”或“長生果”，其富有豐富的營養(yǎng)成分，為素食之佳品，王翹楚教授以中醫(yī)“天人相應”理論為指導，并受到李時珍《本草綱目》所記載的“合歡樹葉能順乎自然界陰陽消長規(guī)律，有“晝開夜合”的現(xiàn)象，故取合歡皮、合歡花入藥用作治療不寐”的啟發(fā)，指導應用于臨床實踐中[6]。落花安神口服液是我院院內(nèi)制劑，在臨床上治療失眠有顯著效果。前期在治療失眠的實驗研究中，發(fā)現(xiàn)其能治療心血管疾病。文獻表明，失眠或睡眠不佳與心血管疾病有很大的關聯(lián)，尤其是血壓、血脂代謝異常。失眠患者容易出現(xiàn)心率加快、血壓升高、心血管癥狀明顯加重。失眠患者的交感神經(jīng)張力的增加，血壓、心率、血小板聚集和血液黏稠度增加，心室顫動閾值降低，動脈樣硬化斑塊破裂，血小板聚集，從而引起心血管疾病[7]。其中，血脂代謝異常導致的高脂血癥以及脂質(zhì)氧化是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中起關鍵作用的致病原因?；ㄉθ~可有效地抗氧化，通過抑制Ox-LDL預防AS疾病，有效改善睡眠質(zhì)量。而自由基是生物體生化反應的普遍介質(zhì)?，F(xiàn)代研究表明，許多疾病如心腦血管疾病、肝硬化、癌癥以及人體衰老等過程都與自由基的作用有關[8]。

近年來，相關研究證實花生枝葉主要含有原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸、對羥基桂皮酸、對甲氧基桂皮酸、異香草酸、異阿魏酸、落花生苷、狗筋蔓內(nèi)酯、長春花苷、柑橘苷等，其均有抗氧化作用[9-10]。且有相關實驗證實，花生枝葉有一定的體外抗氧化作用[11]。目前，最常用的自由基清除測定方法是ABTS法、DPPH法、ORAC法、羥自由基清除能力和超氧自由基清除能力等[12]。本實驗采用生化試劑盒法測得提取物抗氧化能力，該方法操作簡便，靈敏快速。研究表明，隨著質(zhì)量濃度上升，花生枝葉水提液的總抗氧化能力不斷升高，且有劑量依賴。在濃度較低的時候，花生枝葉水提液對羥自由基和超氧都有顯著的清除作用。隨著質(zhì)量濃度越來越高時，對羥自由基和超氧都有顯著的清除作用顯著偏弱。這可能與在鐵離子及氧存在時黃酮類化合物自動氧化生成超氧化物或過氧化氫，表現(xiàn)出一定的促氧化作用有關[13]?；ㄉθ~水提液隨著質(zhì)量濃度的升高，清除超氧陰離子自由基、抗羥自由基能力先增加，后降低但其總的抗氧化能力卻是逐漸增強。相對于化學合成的抗氧化單體，花生枝葉屬于農(nóng)作物，藥食兩用中藥，順應自然。作為單味藥，對防治心血管疾病有一定的療效，在中醫(yī)藥領域中還是不多見的。但花生枝葉水提物成分多樣，其中含有很多鞣質(zhì)等其他物質(zhì)，若對其進行分離純化，其體外抗氧化能力是否會變化？通過氧化性改善心血管疾病的療效有多少？我們將在后期實驗中結合臨床需要進一步探索。

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(收稿2015-12-16；修回2016-02-20)

The research of peanut leaves antioxidation

Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine Affililated to Shanghai TCM University(Shanghai 200071)

Qian ChunmeiWang LulingGuan Yuet al

KEY WORDSAntioxidant activity@Peanut leavesFree radicals

ABSTRACTObjective: To explore the strength of peanut leaves antioxidant effects in vitro and the dose-dffect relationship. Methods: Explored the total antioxidant capacity and hydroxyl radicals, superoxide anion radical scavenging activity of peanut foliage water extract by biochemical assay kit and to evaluate the peanut foliage antioxidant capacity. Results: Foliage water extract from the peanut leaves between the concentration of 0.9766 and 125 mg/mL had a certain degree of dose-dependent. The total antioxidant effect leveled off with the concentration of 62.5 mg/mL, anti-hydroxyl free radical and superoxide anion radical capacity within a certain concentration range between 0.9766 and 1000 mg/mL grew as the concentration strengthed and decreased later. Conclusion: Peanut foliage water extract has the significant antioxidant effects and dose-effect relationship exists among a certain concentration.

通訊作者△

【中圖分類號】R284

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.06.042

*上海市衛(wèi)生局課題(20114057)