畢建云, 劉善新, 梁瑞雪, 王 平*, 蘇 酩, 師 彬
(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,山東濟(jì)南250355;2.山東省中醫(yī)藥研究院,山東濟(jì)南250014;3.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院,山東濟(jì)南250000)
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超臨界流體萃取復(fù)方活血巴布膏中肉桂藥材的有效成分
畢建云1,2, 劉善新2, 梁瑞雪2, 王 平2*, 蘇 酩2, 師 彬3
(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,山東濟(jì)南250355;2.山東省中醫(yī)藥研究院,山東濟(jì)南250014;3.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院,山東濟(jì)南250000)
摘要:目的 優(yōu)選復(fù)方活血巴布膏中肉桂藥材的超臨界流體萃取條件。方法 以桂皮醛得率為指標(biāo),正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)綜合考察了萃取壓力、萃取溫度和萃取時(shí)間等因素對(duì)藥材中有效成分得率的影響。結(jié)果 優(yōu)選出的工藝條件為萃取壓力20 MPa,萃取溫度35℃,萃取時(shí)間2.5 h。結(jié)論 在該提取條件下,桂皮醛得率、提取率均較高,工藝穩(wěn)定可靠。
關(guān)鍵詞:復(fù)方活血巴布膏;肉桂;桂皮醛;超臨界流體萃??;正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)
復(fù)方活血巴布膏為中藥復(fù)方制劑,具有溫經(jīng)活血、祛風(fēng)除濕、消腫止痛的功能,適用于寒濕阻痹型骨性關(guān)節(jié)炎,其主含揮發(fā)油的藥材為肉桂、川芎、芥子。其中,肉桂為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presi的干燥樹皮,具有補(bǔ)火助陽、引火歸元、散寒止痛、溫通經(jīng)脈的功效,其主要揮發(fā)性成分桂皮醛對(duì)堿性磷酸酶ALP活力、鈣含量以及鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量有明顯的促進(jìn)作用,同時(shí)還具有明顯抗炎、除菌的效果[1-2];川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,其性溫,味辛、微苦,具有活血行氣,祛風(fēng)止痛之功效,其主要有效成分阿魏酸能抑制血小板TXA2的釋放,對(duì)其活性有直接的拮抗作用,具有抗凝活血功能[3];芥子為十字花科植物白芥Sinapis alba L.的干燥成熟種子,具有溫肺豁痰利氣,散結(jié)通絡(luò)止痛之功效。本實(shí)驗(yàn)以桂皮醛得率為指標(biāo),采用超臨界流體萃取法來提取肉桂、川芎、芥子中的揮發(fā)油成分。
1.1 儀器與材料
1.1.1 儀器 U1timate 3000高效液相色譜儀,包括紫外檢測器、Chrome1eon7工作站(美國Thermo公司);BP211D電子天平(德國Sartorius公司);HA220-50-06超臨界萃取裝置(江蘇華安科研儀器有限公司)。桂皮醛(批號(hào)FY1265VX53J,南通飛宇生物科技有限公司)。水為純凈水(美國Mi11ipore公司純水器制備);所用試劑為色譜純或分析純。
1.1.2 藥材 所用藥材均購于山東百味堂中藥飲片有限公司,經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院靳光乾研究員鑒定。
1.2 桂皮醛含有量測定[4-5]
1.2.1 色譜條件 Diamonsi1 C18色譜柱(150 mm× 4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水(35∶65);體積流量1 mL/min;檢測波長290 nm;進(jìn)樣量10 μL;柱溫30℃。
1.2.2 供試品溶液的制備 按處方比例稱取含肉桂46.3 g的揮發(fā)油藥材120.25 g,粉碎(過50目篩),選擇萃取溫度為50℃,萃取壓力為30 MPa,萃取2.5 h,稱定收得揮發(fā)油的重量。然后,精密稱定揮發(fā)油0.1 g,置于25 mL量瓶中,定容至刻度,再精密吸取2 mL,置于25 mL量瓶中,定容至刻度,0.45 μm濾膜過濾,進(jìn)樣10 μL。
1.2.3 空白溶液的制備 按處方比例,稱取除肉桂外的揮發(fā)油藥材,粉碎(過50目篩),樣品提取及制備方法同上,0.45 μm濾膜過濾,進(jìn)樣10 μL。
1.2.4 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取桂皮醛9.58 mg,置于10 mL量瓶中,甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻。再精密吸取0.5 mL,置于25 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,配成質(zhì)量濃度0.019 16 mg/mL的對(duì)照品溶液。
1.2.5 線性關(guān)系考察 取上述對(duì)照品貯備液適量,進(jìn)樣0.5、2、4、8、10、15 μL,在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析,以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果,桂皮醛在0.009 580~0.287 4 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,回歸方程Y=255.8X+0.081 50,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。
1.2.6 空白試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品、供試品、缺肉桂空白對(duì)照溶液各10 μL,注入高效液相色譜儀,在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下檢測。結(jié)果,對(duì)照品與供試品溶液在相同的保留時(shí)間處有相應(yīng)的峰,而缺肉桂空白對(duì)照無干擾峰,說明該測定方法的專屬性好、無干擾,見圖1。
A.桂皮醛對(duì)照品 B.樣品 C.缺肉桂空白圖1 桂皮醛的HPLC色譜圖
1.2.7 精密度考察 分別精密吸取供試品溶液10 μL,注入高效液相色譜儀,測定峰面積,連續(xù)測定5次。結(jié)果,RSD為0.73%,表明儀器精密度良好。
1.2.8 穩(wěn)定性考察 分別精密吸取供試品溶液10 μL,于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣。結(jié)果,RSD為1.19%,表明桂皮醛在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
1.2.9 重復(fù)性考察 精密稱取揮發(fā)油0.1 g,平行6份,按上述方法稀釋制備供試液,并測定桂皮醛的含有量。結(jié)果,RSD為0.80 %,表明該方法重復(fù)性良好。
1.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取桂皮醛含有量已知的揮發(fā)油0.05 g,精密加入桂皮醛對(duì)照品,混勻,平行6份,按上述方法制備供試液,進(jìn)樣10 μL。結(jié)果,桂皮醛平均回收率為99.14%,RSD為0.98 %。
2.1 因素與水平 選擇萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間作為考察因素,每種因素各取3個(gè)水平,再選用L9(34)正交表安排試驗(yàn),因素水平見表1。
表1 因素水平
2.2 試驗(yàn)安排及結(jié)果 按處方比例稱取含肉桂46.3 g的水提取藥材120.25 g,按正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn),將桂皮醛的得率進(jìn)行直觀及方差分析,結(jié)果見表2、表3。
表2 正交試驗(yàn)結(jié)果
表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析
直觀分析發(fā)現(xiàn),桂皮醛得率各因素影響程度依次為C>B>A,但是后兩者相差不大;方差分析顯示,3個(gè)因素對(duì)揮發(fā)油萃取率的影響不顯著,萃取時(shí)間相對(duì)具有一定的影響,時(shí)間越長,提取得率越大。從省時(shí)節(jié)能的角度考慮,確定最佳提取工藝為A1B1C3,即萃取溫度35℃、萃取壓力20 MPa、萃取時(shí)間2.5 h。
2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn) 采用上述優(yōu)化條件,平行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果,桂皮醛得率分別為18.98、18.40、18.89 mg/g,平均值為18.76 mg/g,RSD為1.68%;桂皮醛提取率分別81.10%、78.60%、80.13%,平均值為80.13%,RSD為1.68%,表明工藝條件穩(wěn)定可行。
超臨界流體萃取法常采用等溫減壓或等壓升溫的方法,將溶質(zhì)與萃取劑分離開,從而避免了用煎煮、濃縮、干燥等傳統(tǒng)方法提取中藥有效成分時(shí),一些活性組分因高溫而被破壞的弊端。它可在較低的溫度下進(jìn)行,特別適合于熱敏性組分的提取,而且無溶劑殘留。文獻(xiàn)報(bào)道,采用超臨界流體萃取肉桂揮發(fā)油成分時(shí),桂皮醛得率與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近[9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),藥材中桂皮醛的含有量為2.3%,小試驗(yàn)證中其提取率為80.13%,說明優(yōu)選的條件能較完全地提取出藥材中的揮發(fā)油成分。為了后續(xù)試驗(yàn)的方便進(jìn)行,以及能最大程度提取阿魏酸等極性較大的成分,本實(shí)驗(yàn)選擇加夾帶劑進(jìn)行二次提取,并對(duì)二次提取液中桂皮醛的得率進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)其結(jié)果遠(yuǎn)小于揮發(fā)油中該成分得率[10],更進(jìn)一步說明第一次就已經(jīng)較完全地提取出肉桂藥材中的揮發(fā)油成分。
參考文獻(xiàn):
[1] 邵 培,曹桂芬,趙美林,等.中藥桂皮醛對(duì)成骨細(xì)胞增殖及成骨功能的影響[J].中國口腔種植學(xué)雜志,2009,14(4):111-114.
[2] 趙美林,黃 萍,楊 霞,等.中藥桂皮醛體外抑菌和抗炎活性的研究[J].廣東牙病防治,2008,16(10):441-443.
[3] 孫立江,李玉軍,石景森.川芎嗪對(duì)缺血再灌注損傷腎臟細(xì)胞凋亡的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,23(18):1683-1685.
[4] 王偉影,范 蕾,劉 斌.HPLC法測定附桂骨痛顆粒中桂皮醛含量[J].中國藥師,2011,14(4):575-576.
[5] 王 森,陳愛華,劉紅寧,等.HPLC測定狗皮膏中桂皮醛和丁香酚的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19 (15):73-75.
[6] 胡曙晨,李 莉,李新霞,等.正交試驗(yàn)優(yōu)化肉桂子中超聲提取桂皮醛的工藝[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,36(9):1278-1281.
[7] 岳紅坤,韓明會(huì).桂枝揮發(fā)油不同萃取方法的比較研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(15):7848-7850.
[8] 岳紅坤,眭曉哲,王 娟.超臨界CO2萃取桂枝中桂皮醛的研究[J].石家莊學(xué)院學(xué)報(bào),2010,12(3):35-39.
[9] 鄧杏好,李慶國,梁桂美.超聲強(qiáng)化超臨界流體萃取桂皮醛的工藝研究[J].今日藥學(xué),2012,22(7):395-397.
[10] 宋浩亮,羅華菲,官洪義.阿魏酸及其制劑的穩(wěn)定性研究[J].安徽醫(yī)藥,2003,7(4):252-253.
*通信作者:王 平(1974—),女,副研究員,碩士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。Te1:(0531)82949847,E-mai1:wangpingjinan@163.com
作者簡介:畢建云(1987—),女,碩士,助理實(shí)驗(yàn)員,研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c新制劑。Te1:15550486770,E-mai1:bjy1217@ 126.com。
基金項(xiàng)目:山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化重大專項(xiàng)(2012ZHZX1C0405);濟(jì)南市科技計(jì)劃(201219008);濟(jì)南市青年科技明星計(jì)劃(20120142)
收稿日期:2014-09-02
doi:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.046
中圖分類號(hào):R284.2
文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B
文章編號(hào):1001-1528(2016)01-0191-03