高烏頭炮制前后高烏甲素含量測定及小鼠急性毒性實驗

李 蕓， 胡昌江， 徐 婷， 王志旺， 熊 瑞

（1.成都中醫(yī)藥大學，四川成都611137；2.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅蘭州730000）

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高烏頭炮制前后高烏甲素含量測定及小鼠急性毒性實驗

李 蕓1，2， 胡昌江1*， 徐 婷2， 王志旺2， 熊 瑞1

（1.成都中醫(yī)藥大學，四川成都611137；2.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅蘭州730000）

摘要：目的 比較高烏頭生品及炮制品的高烏甲素含有量及急性毒性大小，為探討高烏頭炮制機理提供依據(jù)。方法 采用測定半數(shù)致死量的方法對高烏頭生品及炮制品的急性毒性進行研究。采用高效液相色譜法，測定高烏頭生品及炮制品中高烏甲素的含有量。結果 高烏頭生品的LD50為1.424 g/kg；高烏頭炮制品的LD50為2.625 g/kg。生品的毒性大于炮制品，高烏甲素的質量分數(shù)分別為1.170％、0.562％，炮制后含有量降低了一半。結論 高烏頭炮制后毒性顯著降低，表明用甘草汁炮制能夠降低高烏頭的毒性，且毒性與高烏甲素密切相關，進一步證實高烏甲素就是高烏頭的毒性成分之一。

關鍵詞：高烏頭；炮制；高烏甲素；急性毒性

高烏頭是毛莨科烏頭屬植物高烏頭（Aconitum sinomontanum Nakai）的干燥根，別名麻布七、穿心蓮，曲芍，九連環(huán)等，是甘肅、四川、陜西太白地區(qū)、湖北神農(nóng)架地區(qū)及云南、貴州等地珍稀名貴的“七藥”之一［1-2］，性味苦辛、溫，有毒，具有祛風除濕、理氣止痛、活血散結的功效，臨床用于治風寒腰痛，痧氣腹痛，胃痛，心悸，跌打勞傷，瘰疬，瘡癤等［3-5］，現(xiàn)收載于《甘肅省中藥材標準》（2009年版）［6］。高烏甲素是高烏頭主要的C18-雙去甲二萜類生物堿，為高烏頭的毒性成分之一［7-8］，也是有效成分之一，臨床上常用其氫溴酸鹽，具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、局麻、抗血小板聚集、抗腫瘤、抗心律失常、抗風濕、抗癲癇、抗氧化、抗細菌、免疫調(diào)節(jié)、殺蟲等活性［9-11］。由于高烏頭有毒，臨床應用受限，需要炮制以解毒，本課題組前期對高烏頭的炮制工藝進行了優(yōu)選（加入10％甘草汁蒸制5 h），分別測定了生品和炮制品中高烏甲素的量，同時對2種樣品進行了小鼠急性毒性試驗，為高烏頭的急性毒性評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物

1.1.1 生品 高烏頭（甘肅省天祝藏族自治縣農(nóng)貿(mào)市場），經(jīng)甘肅中醫(yī)學院楊撫德教授鑒定為麻布七，高烏頭（Aconitum sinomontanum Nakai）的根。將原藥材凈制，潤法軟化，然后切制成約5 mm的碎段，自然干燥，篩去碎屑，制成高烏頭生品飲片。

1.1.2 炮制品（甘草制） 取高烏頭生品飲片適量，用10％甘草汁（甘草∶水為1∶3）潤透后，置立式壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，在127℃，0.15 MPa條件下蒸制5 h，取出，晾干，篩去碎屑，制成高烏頭炮制品。

1.2 主要試劑與器材 氫溴酸高烏甲素對照品（甘肅神龍藥業(yè)股份有限公司，批號20001001，純度97.50％）。甲醇、乙腈為色譜純；其它試劑均為分析純。Waters-2695型高效液相儀、2998二極管陣列檢測器（PAD）；BT 125D電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；LDZX-30FA立式壓力蒸汽滅菌器（上海中安醫(yī)療器械廠）；12號灌胃針。

1.3 實驗動物及環(huán)境 SPF級昆明種小鼠（18～22 g），雌雄各半，均由甘肅中醫(yī)學院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（甘）2011-0001，實驗設施合格證SYXK（甘）2011-0001。實驗室溫度20～24℃，相對濕度40％～70％。

1.4 試驗方法

1.4.1 高烏甲素含有量測定 對照品溶液的制備：精密稱取氫溴酸高烏甲素對照品7.5 mg，置25 m L量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

樣品溶液的制備：取高烏頭（過50目篩）約0.5 g，精密稱定，置三角瓶中，加甲醇15 mL，超聲15 min，濾過，濾渣再加10 mL甲醇，超聲15 min，濾液合并于25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

標準曲線的繪制：精密吸取對照品溶液0.5、1、5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積（Y）對進樣量（X）進行線性回歸，氫溴酸高烏甲素在0.15～7.5 μg范圍內(nèi)線性關系良好，回歸方程Y=237 512 X-53 646，r=0.999 9。

色譜條件：色譜柱（ZORBAX SB-C18，4.6 mm× 250 mm，5 μm）；甲醇-0.05 mo1/LNaH2PO4溶液（45∶55）為流動相；體積流量為1.0 mL/min；進樣體積10 μL；檢測波長252 nm；柱溫為30℃。

1.4.2 小鼠經(jīng)口毒性試驗 采用半數(shù)致死量法。將高烏頭生品飲片粉碎，過100目篩兩次，稱取適量樣品，加蒸餾水配制成一定質量濃度的混懸液，備用（以下稱為高烏頭生品）。同法制備高烏頭炮制品混懸液（以下稱為高烏頭炮制品）。

根據(jù)預試驗結果，設計高烏頭生品和炮制品的染毒劑量。每種受試物設5個劑量，其中高烏頭生品為3.200、2.272、1.613、1.145、0.813 g/kg體質量；高烏頭炮制品為4.000、2.960、2.190、1.621、1.200 g/kg體質量。

選用18～22 g的SPF級昆明種小鼠，雌雄各8只，于灌胃前禁食16 h。各受試物按相應劑量一次性灌胃給藥40 mL/kg體質量，對照組給以等容積的蒸餾水。嚴密觀察并記錄給藥后4 h內(nèi)動物的反應情況，并連續(xù)觀察14 d內(nèi)動物的異常反應及死亡情況。同時，將死亡動物及時進行解剖，肉眼觀察各主要臟器有無明顯病理改變，未死亡動物于14 d后處死，進行尸檢，觀察主要臟器有無病理改變。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用B1iss法，應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計算LD50及95％可信限。

2 結果

2.1 高烏甲素含有量測定結果 高烏頭生品、炮制品中高烏甲素的質量分數(shù)分別為1.170％、0.562％。炮制后，其含有量約為生品的1/2。

2.2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗 在高烏頭生品及炮制品染毒動物中，部分動物3～5 min后相繼出現(xiàn)活動減少，心跳加速，呼吸困難，全身顫抖相繼出現(xiàn)異常興奮，呼吸抑制，逐漸發(fā)展到張口呼吸，陣發(fā)性奔跑后出現(xiàn)陣攣驚脈，四肢抽動，角弓反張，嘴巴、四肢及腳部顏色發(fā)青等中毒癥狀，嚴重驚厥而死亡或斷續(xù)出現(xiàn)多次驚厥后，部分死亡。給藥后10 min左右，陸續(xù)有動物死亡，極個別動物第2天死亡，對死亡動物及時進行解剖，其胃及小腸內(nèi)含有與受試樣品性狀相同的物質，無明顯的胃腸脹氣、充血及水腫等，其心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺等重要臟器也未見明顯異常；在給藥后活動減少，蜷縮于籠內(nèi)的存活小鼠于給藥40～45 min后，中毒癥狀逐漸減弱緩解，次日外觀和活動均恢復正常。給藥第14天，處死存活動物，肉眼觀察各組織，其腸道及心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺等重要臟器未見明顯異常。

高烏頭生品及炮制品對小鼠急性毒性實驗的結果見表1、表2，LD50及95％可信限見表3。

表1　高烏頭生品急性毒性試驗結果

表2　高烏頭炮制品急性毒性試驗結果

表3　高烏頭生品及炮制品的LD50及95％可信限（g/kg）

從表1～3可以看出，高烏頭炮制品的LD50約為生品的2倍左右，表明高烏頭炮制品的毒性小于生品，也說明高烏頭炮制后毒性顯著降低。

3 討論

我國自古就認為高烏頭“辛熱有毒”，在臨床使用中，相繼有報道可引起嚴重的不良反應［12-13］，使其臨床應用受限，須炮制以解毒，才能保證臨床安全有效。降低毒性的方法很多，使用輔料解毒是中藥炮制的一個顯著特點，也是毒性中藥解毒的重要手段。甘草的解毒作用早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，歷代炮制毒性中藥如烏頭、半夏等都用甘草解毒?！毒霸廊珪芬灿涊d：“甘草，味至甘，得中和之性，有調(diào)補之功，故毒藥得之解其毒，剛藥得之和其性……”。甘草的解毒作用與甘草酸的水解產(chǎn)物葡萄糖醛酸有關，后者與毒物結構中的羥基或羧基發(fā)生羥醛縮合而解毒。高烏頭主要含有二萜生物堿，結構中含有大量的羥基，容易發(fā)生羥醛縮合反應而解毒。

輔料去毒常與加熱的方法相結合，去毒效果更好。本研究借鑒了其它毒性中藥的炮制方法和特點，采用輔料甘草和蒸制相結合的解毒方法。實驗結果顯示，該法確能降低高烏頭的毒性。加熱溫度與時間如何影響去毒效果，需要深入研究炮制過程中活性成分的轉化規(guī)律，進一步揭示炮制減毒機理，是亟待解決的問題，有待進一步研究。

將毒性成分轉化為毒性較小或無毒物質是較理想的炮制方法。高烏甲素為單酯型二萜生物堿，結構中含有酯鍵和多個乙?；?，加熱處理均易水解，可能是發(fā)生水解反應生成N-去乙酰高烏甲素、刺烏寧等多個毒性較低的水解產(chǎn)物［10］，也可能與甘草酸形成了穩(wěn)定的絡合物［14］，致其含量降低，結構也發(fā)生了轉化，毒性隨之降低。關于高烏頭炮制后高烏甲素的結構具體發(fā)生了如何變化，有望在后續(xù)工作中開展。

毒性中藥的炮制要兼顧“減毒”和“存效”兩個方面，不可偏廢，否則可能造成效失毒存，或毒去效失。高烏頭炮制后毒性降低了，能夠保證臨床用藥的安全，那么炮制后鎮(zhèn)痛作用等藥效是否還存在，是個關鍵問題，有待藥理實驗進一步證明。

致謝：2013屆藥物制劑專業(yè)本科畢業(yè)生李康、馬貝紅同學在實驗中的幫助和大力支持。

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*通信作者：胡昌江（1952—），男，教授，博士生導師，主要從事中藥炮制學的教學和科研工作。E-mai1：hhccjj@hotmai1.com

作者簡介：李 蕓（1973—），女，博士生，主要從事中藥炮制學的教學和科研工作。E-mai1：1iyunherb@163.com

基金項目：甘肅省自然科學基金項目（1107RJZA242）；甘肅中醫(yī)學院中青年基金項目（ZQ2011-8）

收稿日期：2014-12-02

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.042

中圖分類號：R283.1

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0179-03

網(wǎng)絡出版日期：2015-02-27

網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20150227.1050.001.htm1